In Vivo e Ex Vivo Abordagens para o Estudo do cancro do ovário metastático Colonização de Estruturas Láctea natural em Peritoneal adiposo

Resumo

We outline a protocol that implements both in vivo and ex vivo approaches to study ovarian cancer colonization of peritoneal adipose tissues, particularly the omentum. Furthermore, we present a protocol to quantitate and analyze immune cell-structures in the omentum known as milky spots, which promote metastases of peritoneal adipose.

Resumo

Alto grau de câncer de ovário seroso (HGSC), a causa de metástases peritoniais generalizados, continua a ter um prognóstico extremamente pobre; menos do que 30% das mulheres estão vivos 5 anos após o diagnóstico. O omento é um local preferido de formação de metástases HGSC. Apesar da importância clínica desta microambiente, a contribuição de tecido adiposo omental a progressão do câncer de ovário foram pouco estudados. Adiposo omental é incomum, pois contém estruturas conhecidas como manchas esbranquiçadas, que são compostos de B, T e células NK, macrófagos e células progenitoras que cercam ninhos densas da vasculatura. Manchas leitosas desempenham um papel fundamental nas funções fisiológicas do omento, que são necessários para a homeostase peritoneal. Nós mostramos que manchas esbranquiçadas também promover o cancro do ovário de colonização metastática adiposo peritoneal, um passo fundamental para o desenvolvimento de metástases peritoniais. Aqui nós descrevemos as abordagens que desenvolvemos para avaliar e quantificar manchas esbranquiçadas em poritoneal adiposo e estudar a sua contribuição funcional para células de cancro do ovário metastático colonização de tecidos omental tanto in vivo como ex vivo. Estas abordagens são generalizáveis ​​a obter modelos de ratinho e linhas celulares, permitindo, assim, o estudo da formação de metástases do cancro do ovário de localização inicial de células de estruturas local leitoso para o desenvolvimento de metástases generalizadas peritoneais.

Introdução

Ao contrário da maioria de tumores sólidos, as metástases de cancro do ovário seroso de alto grau (HGSC) estão limitados a cavidade peritoneal ^1. Assim, as terapias eficazes peritoneal poderia controlar ou erradicar HGSC. Atualmente, uma abordagem terapêutica padrão é citorredução cirúrgica combinada com quimioterapia ^1-3. Infelizmente, a grande maioria dos pacientes experimentam e sucumbir a complicações de recorrência da doença. Estas estatísticas sombrias mostram a necessidade de uma melhor compreensão da colonização metastática, o processo pelo qual as células cancerosas para localizar, utilizar e proliferar dentro de tecidos do hospedeiro para formar metástases ^2.

O omento é um site de início preferido de HGSC metástase ^4-7. Ao contrário de outros peritoneal adiposo, o tecido adiposo omental contém estruturas invulgares imunes conhecidas como manchas leitosas, que contêm B, T, e células NK e macrófagos, os quais desempenham papéis fundamentais na homeos peritoneaistasis ^8,9. Além de suas funções fisiológicas, descobrimos que manchas esbranquiçadas desempenhar um papel ativo no câncer de ovário colonização metastática ^4. Em ensaios de metástases experimentais, SKOV3ip.1, CaOV3, e HeyA8 (humano) e ID8 (murino; C57BL / 6) células de câncer de ovário rapidamente de casa para manchas esbranquiçadas, sugerindo que as células estão se movendo em direção a um factor quimiotáctico segregado. Curiosamente, as células cancerosas não colonizar adiposo peritoneal sem manchas esbranquiçadas (ou seja, gonadal e gordura ^uterino) 4.

A fim de identificar os mecanismos que regulam a colonização mancha leitosa, que têm modelos de xenoenxerto optimizado que permitem a interrogação de eventos celulares e moleculares ao longo do curso tempo da colonização metastático ^4. Uma vantagem específica das abordagens aqui descritas é sua ênfase na arquitetura e função do tecido, o que permite aos usuários para testar hipóteses em totalmente integrado in vivo e ex vivo modelos de m^4,10 colonização etastatic. Ao comparar a localização de células de câncer e crescimento em depósitos de gordura peritoneal que quer contenham ou não possuem manchas esbranquiçadas, os pesquisadores podem testar a contribuição relativa (s) de adipócitos e células dentro de manchas esbranquiçadas à apresentação e progressivo crescimento de células de câncer de ovário em tecidos fisiologicamente relevantes.

Protocolo

Todos os ratos foram alojados, mantidos e sacrificados de acordo com a Animal Care Institucional e Comitê de Uso (IACUC) orientações e sob a supervisão da Universidade de Chicago animal Resource Center.

1. Os animais que preparam para estudos experimentais

1. Permitir que os animais se adapte à nova habitação e meio ambiente, para se recuperar de potenciais efeitos fisiológicos de transporte e manuseio.
   Nota: A técnica seguinte é aplicável a todas as estirpes de ratinhos disponíveis comercialmente. O número de animais a serem utilizados para um experimento é dependente do desenho do estudo e deve ser feito com consulta a partir de um estatístico.

2. identificação e isolamento de peritoneais gordos depósitos.

1. Eutanásia animais por sobredosagem de CO ₂ e um método físico para confirmar a morte secundária.
2. Como depósitos de gordura peritoneal colheita constitui remoção de órgãos internos (método secundário), make uma incisão na linha média próximo da papila inguinal através da parede peritoneal para expor os órgãos internos (Figura 1A).
3. Para a gordura omental (OM), exponha o complexo omental / pâncreas através do alargamento do baço a partir da cavidade peritoneal com uma pinça (Figura 1C). Solte omento do pâncreas e baço aparando de perto todas as conexões de tecido. Assegure-se que qualquer tecido pancreático remanescente é excisado ^4.
4. Para o Fat gonadal (GF), utilize uma pinça para levantar a gordura gonadal que envolve os ovários e impostos especiais de consumo, cortando conexões de tecido (Figura 1A superior righ t) ^4.
5. Para o Fat uterina (UF), utilize uma pinça para levantar a gordura uterina que envolve os cornos uterinos e impostos especiais de consumo, cortando conexões de tecido (Figura 1A inferior direito) ^4.
6. Por gordura mesentérica (MF), corte da junção entre o intestino delgado e o piloro. Utilize uma pinça para segurar com firmeza a extremidade livre doo intestino delgado, e lentamente "casca" que distância a partir da gordura mesentérica. Solte a gordura mesentérica a partir da raiz mesentérica usando tesouras de dissecção (Figura 1A inferior esquerdo) ^4.
7. Para a gordura Splenoportal (SF), levantar a extremidade distal do baço utilizando um fórceps para expor a banda de tecido gordo fina que liga o hilo do baço para o pâncreas. Excisar o splenoportal gordura por primeiro libertando-o do pâncreas, e, em seguida, cuidadosamente dissecando a partir do baço (Figura 1B) ^4.

3. Láctea Identificação Ponto Usando Coloração Giemsa

1. Excise omentos (Passo 2.3) a partir de ratinhos C57BL / 6 e fixar em 5% de formalina tamponada neutra a 4 ° C durante 16 horas (S / N).
2. Para inclusão em parafina do tecido fixado, escolher um molde que é adequado para o tamanho do tecido. Pour parafina fundida a partir do reservatório de parafina para encher o molde. Abra a gaveta e utilizando quente paraceps, transferir o tecido para dentro do molde.
   1. Orientar cuidadosamente os tecidos durante a parafina para produzir cortes longitudinais. Coloque a cassete de tecido marcado através da moldagem e pressione com firmeza no lugar. Permitir que o molde para esfriar por pelo menos 30 min.
3. Corte cortes seriados (4 mm de espessura) da parafina fixado em formalina incorporado (FFPE) bloco de tecido. Coloque um slide precleaned sob as seções como a fita de tecido sai do bloco de parafina.
4. Serially seção inteira do omento; coletar e manchar a cada terceira seção para Giemsa (vide 3.6). Permitir que a lâmina de vidro com as secções para ar seco, de um modo preferido O / N à temperatura ambiente. Lâminas secas estão prontos para fixação. Manchar a primeira seção de hematoxilina e eosina para comparações com lâminas Giemsa manchadas.
5. Desparafinar os slides por dois seqüenciais 5 min incubações em xilenos. Rehidratar lâminas por duas incubações sequenciais no seguinte: etanol a 100%, etanol a 95%, e finalmente toque water.
   1. Tomar as precauções adequadas para evitar os slides da secagem. Execute todas as etapas na RT.
6. Imergir completamente as lâminas em um frasco Coplin contendo solução de Giemsa 5% (w / v preparada em água da torneira) e incubar durante 4 minutos à temperatura ambiente. Lavar as lâminas em água da torneira durante 60 segundos, o ar seco e montar com lamela usando a mídia de montagem.
7. Imagem lâminas coradas usando um scanner de slides inteira e processo de software com o fabricante. Quantificar o volume mancha leitosa nas seções omentais corados pelo Giemsa usando software ImageJ ^4.

4. Propagação e Preparação de células do cancro do ovário para in vivo e ex vivo Estudos

1. Pré-aquecer a 15 ml de meio de crescimento de células a 37 ° C num banho de calor. Preparar um frasco de cultura de tecidos de tamanho adequado (por exemplo, 75 centímetros área de superfície ²⁾ por meio de rotulagem com o nome da linha celular, número de passagens, a data ea pessoa que elaborou o estoque congelado, ea dataea pessoa que está descongelando / plaqueamento das células.
   Nota: Em estudos de metástase tais informações detalhadas é crucial, como a data de congelamento para baixo e número passagem pode afetar o fenótipo metastático.
2. Usando o ambiente estéril do exaustor de segurança biológica, pipeta de 10 ml de meio em frasco de cultura T-75. Remover um frasco de células a partir do sistema de azoto líquido e verificar o rótulo para confirmar o tipo de célula. Descongele apenas um frasco de células em um momento de aquecimento no 37 ° C banho de calor.
3. Utilizando uma técnica estéril, pipeta 1x10 ⁶ células descongeladas para o balão de cultura. Colocar o balão na incubadora para permitir que as células para anexar. Agite suavemente o frasco para trás e para formar uma suspensão de células uniforme.
   1. Colocar o balão de cultura de tecidos na incubadora e manter a 37 ° C em 5% de CO ₂ ambiente. Permitir que as células aderem O / N.
4. Aspirar media, e substituir por meio de crescimento pré-aquecido fresco. Colocar o balão na incubadora e tudoow células a crescer. Monitorizar o crescimento celular por dia por inspecção visual a cada 2-3 dias utilizando um microscópio invertido. Utilize as técnicas padrão de cultura de células para células de passagem, ao atingir 70-80% de confluência.
   Nota: Para os ensaios experimentais colher as células a 70% de confluência para assegurar que as células estão a proliferar activamente.
5. Aspirar o meio de cultura e lavar com 10 ml de solução salina tamponada com fosfato estéril (PBS). Aspirar PBS e adicionar 0,25% de tripsina / EDTA (2 a 3 ml de uma área 75 ^cm2 de superfície) e incubar 5 minutos a 37 ºC. Visualmente confirmar que as células foram destacadas e adicionar um volume igual de meio de crescimento, e suavemente para cima e para baixo pipetar células para se obter uma suspensão de célula única.
   Nota: É crítico que o meio de crescimento conter soro, uma vez que inactiva a tripsina. Preparar pelo menos 2 a 4 vezes mais células do que o número exigido para uma dada experiência para compensar a perda de células durante as etapas subsequentes
6. Determinar a percentagem de células viáveis ​​nasuspensão através de ensaio de exclusão de azul de tripano utilizando um hemocitómetro ou um contador de células automatizado.
   Nota: aqui, utilizar apenas preparações de células em que ≥ 96% das células são viáveis.
7. Transferir a suspensão de células a partir do frasco para um tubo cónico de 50 ml. Células de pelotas por centrifugação 5 min a 1100 xg, ^a 4 o C.
8. Aspirar o sobrenadante e ressuspender o sedimento de células em PBS até uma concentração de 2x10 ⁶ células por ml.

5. injeção intraperitoneal de Células

Nota: Em nossos experimentos, os ratos são tratados de fluxo de ar laminar ou gabinete de biossegurança dentro de nossa unidade de barreira, a fim de limitar o risco de exposição a patógenos, Para demonstrar essa técnica de forma clara, os procedimentos no vídeo que acompanha foram realizados em um laboratório aprovado para o trabalho animal. Esta técnica não exige especial os animais estar sob anestesia. Sob protocolos aprovados, executar esta technique em animais vivos. Use estirpes adequadas de camundongos para o estudo. Por exemplo: usar imunocomprometidos, ratos pelados atímicos para o estudo de células de cancro do ovário humano (SKOV3ip.1, e HeyA8) colonização; usar imunocompetentes camundongos C57BL / 6 para o estudo de rato células de cancro do ovário (ID8) colonização.

1. Carga de 500 ul da suspensão de células individuais dentro da seringa e colocar na agulha estéril tapado 25 G. Isto reduz o cisalhamento de células antes da injecção.
2. Escolha o mouse para cima pela nuca do pescoço e segurar o rabo usando a palma eo dedo indicador e fixar a perna esquerda entre o anel eo dedo mínimo (quando o mouse é contido com a mão esquerda).
   Nota: Para evitar órgãos abdominais traumatizantes, restringir o mouse bem para que ele não pode se mover durante a injecção.
3. Imagine uma linha que atravessa abdômen logo acima dos joelhos, e localizar um ponto no lado direito do animal e perto da linha média. O ponto de entrada é craniana e ligeiramente medialdo último bocal.
   Nota: Inserir a agulha no lado direito do rato evita o ceco e reduz o risco de perfurar o intestino ^11.
4. Insira a agulha na região lateral inferior do abdómen dos ratos a uma profundidade de aproximadamente 0,5 cm. Puxar para trás o êmbolo para confirmar que a agulha não penetrou num vaso sanguíneo ou outros órgãos peritoneais.
   1. Se o fluido é aspirado para descartar a seringa (e amostra) ^11. Um aspirado marrom-esverdeada ou amarela indica a penetração da agulha para o intestino ou bexiga, respectivamente.
5. Injectar a amostra usando, pressão lenta e constante. Retire a agulha e retornar o mouse para sua gaiola. Não reaproveite seringa antes da eliminação em recipiente apropriado.
6. Camundongos sacrifício via _asfixia com CO2 e remoção de órgãos vitais em momentos específicos após a injecção.

6. Láctea colonização local In vivo

1. Quantitàção de localização de células de cancro de manchas leitosas utilizando citometria de fluxo
   1. Isolar depósitos de gordura peritoneais a partir de ratinhos (como descrito no passo 2.3 - 2.7) injectados com células cancerosas com a etiqueta fluorescente e tecidos lugar imediatas em PBS gelado.
      1. Para esta técnica particular, peso-match todos os tecidos adiposo gordura para omento. Tecidos de transferência para separar tubos de 5 ml contendo 1,5 ml de DMEM isento de soro e 0,1% (w / v) de albumina de soro bovino. Piscina tecidos colhidos de três ratinhos independentes para assegurar um rendimento suficiente de células para citometria de fluxo.
   2. Tecidos tritura usando tesouras cirúrgicas e adicionar 1,5 ml de DMEM isento de soro contendo 0,4% (w / v) de colagenase I. Incubar a suspensão de tecido a 37 ° C durante 30 min com agitação rotativa.
      1. Como passo opcional, ainda dissociar o tecido por mastigação. Neste caso, a transferência da suspensão de tecido-colagenase para um saco microstomacher, mastigar durante 10 min em baixo, girando a orientaçãodos sacos após 5 min.
   3. Amostras filtrar através de um filtro de malha de nylon (60 de poro) para remover os detritos maiores. Recolher as células através de centrifugação a 250 xg durante 5 min a 4 ° C e desprezar a fracção de sobrenadante.
   4. Ressuspender o sedimento celular em 100 ul de PBS combinado com 900 ul de tampão de lise ACK e incubar à temperatura ambiente durante 1 min. Centrifugar células a 250 xg por 5 min e elimine o sobrenadante.
      1. Ressuspender o sedimento celular em 250 ul de PBS gelado. Filtrar as amostras através de uma malha de nylon de 60 um de poro para assegurar suspensão de células individuais. Lavar o filtro com 250 ul de PBS gelado.
   5. Quantificar o número de células marcadas por fluorescência da população utilizando um citómetro de fluxo equipado com um laser de amarelo-verde 561 nm e um / 15 nm, filtro de banda 585 nm. Defina a porta para as células tdTomato-positivos com base na análise de células parentais e / ou controlos negativos adequados ^4.
2. A quantificação de metástases microscópico e macroscópico
   1. No ponto final experimental desejada (s), isolar, e colocar imediatamente tecidos nos meios de fixação apropriados. Fix amostras maiores, tais como gonadal intacta, uterino, e depósitos de gordura mesentéricos em 10% de formalina tamponada neutra para 48 h a 4 ° C. Fix amostras mais pequenas (e gordura omental splenoportal, bem como os equivalentes de tecido uterino e de gordura mesentérica) em 5% de formalina tamponada neutra a 4 ° C durante 2-16 h.
      1. Alternativamente, pressão congelar tecidos, colocando-os em um meio de congelamento, como outubro e cair em uma quantidade adequada de nitrogênio líquido.
   2. Transferência de tecidos para armazenamento de etanol e 70% fixado a 4 ° C até ser embutido em parafina. Incorporar e tecido processo como descrito em 3.2 e 3.3.
      1. Utilizar a secção corada com H & E para avaliar os tecidos quanto à presença ou ausência de metástases microscópicos (isto é, conjuntos de 50 células). Confirme tele presença de metástases microscópicas por um método secundário, como uma mancha de IHC para cytokeratin 18/8 para detectar células de câncer de ovário.

7. Láctea Mancha Colonização Ex Vivo

1. Estabelecimento de ex vivo de órgãos omental condições básicas de cultura
   1. Colocar cada omento numa única pastilha e placa de cultura lugar dentro de um poço de uma placa de cultura de tecido de doze poços contendo 500 uL de DME meio / F12 contendo 20% de FCS. Manter culturas de órgãos a 37 ° C em ambiente _de CO2 a 5% durante 24 a 48 h e / ou pontos de tempo adicionais. Use três omentos independente (amostras em triplicado) para cada condição (por exemplo, tipo de mídia / ponto de tempo).
   2. Para confirmar a integridade dos tecidos nas extremidades experimentais, corrigir e amostras do processo, tal como descrito no Passo 3. Contando saudável contra adipócitos necróticas nas secções H & E podem avaliar a integridade do tecido. Um mínimo de ~ 120 células de5 amostras biológicas é necessário formular uma percentagem de tecido vivo ¹⁰ presente.
   3. Para medir a função do tecido, o local omentos (n = 3) em poços separados de uma placa de 24 poços contendo 500 ul de meios DME / F12 com 20% de FCS. Permitir omentos para condicionar os meios de comunicação a 37 ° C em ambiente _de CO2 a 5% durante 24 h, e depois remover 250 ul para uso num ensaio ELISA de IL-6 ^10.
2. Ex vivo de co-cultura do omento rato com células SKOV3ip.1-GFP
   1. Crescer e preparar células fluorescente tag como descrito na seção 4 e ressuspender a uma concentração de 2 x 10 ^{6 células por} ml.
   2. Aplicar ~ 6 ul de o adesivo de tecido para a membrana da lâmina de cultura e permitir que o ar seco. Lava-se a membrana duas vezes com água esterilizada para remover qualquer excesso de adesivo. Air secar as membranas sob uma capa laminar.
   3. Extirpar cuidadosamente o omentos e anexá-lo ao memb revestida com adesivorane usando uma pinça estéril. Permitir que o tecido de aderir à membrana durante 1 min antes de se adicionar meios de comunicação. Adicionar 500 ul da suspensão de células no topo de cada omento em cada inserção de cultura. Preencher a área em torno da câmara de Transwell com 2,5 ml de meio DME / F-12 ^10.
   4. Incubar omentos com suspensão de células durante 6 horas a 37 ° C em ambiente _de CO2 a 5%. Cuidadosamente remover e lavar o omentos com ~ 10 ml de PBS. Visualize focos de células de câncer fluorescente usando um sistema de imagem fluorescente apropriado ^10.

Resultados

Identificação e histológica Exame de Peritoneal Fat Depots

A dissecção anátomo bruta permite a identificação de quatro das cinco fontes primárias de gordura peritoneal (Figura 1A). Movendo no sentido horário a partir do topo centro são: o omento (OM; delineado) localizado sobre o estômago e baço, a gordura gonadal (GF) em torno do ovário esquerdo (ov), a gordura uterino (UF) ligado às cornos uterinos (uh) e o mesentério (MEU), fixada no intes...

Discussão

O desenvolvimento de terapias para direccionar células disseminadas requer uma compreensão mecanicista da colonização metastático, o primeiro passo crítico no desenvolvimento da doença peritonial. Para tratar dessas questões que relatamos abordagens que podem ser usadas para discernir como composição do tecido exclusivo do omento e arquitetura promover o cancro do ovário colonização metastática. Características distintivas da nossa abordagem são: 1) o foco em eventos precoces no processo de colo...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dissection Tools	Fine Science Tools	NA
Geimsa	Fluka/Sigma Aldrich	48900
5% Formalin	Sigma	HT501320
DMEM	Corning	10-013-CV
Trypsin	Gibco	25200-056
PBS	Corning	21-040-CV	Without calcium and Magnesium
26 gauge needle	BD	329652
BSA	Sigma	A7906
Collagenase	Worthington	LS004196
Stomacher	Seward Labsystems	Stomacher 80 Biomaster
Microstomacher bag	Stomacher Lab Systems	BA6040/Micro
ACK Lysis Buffer	Gibco	A10492-01
Millicell culture plate insert	Millipore	PICM01250
Cell-Tak	Corning	354240