Dans vivo et ex vivo approches pour étudier Cancer de l'ovaire métastatique colonisation de Lactée spot Structures en péritonéale adipeux

Résumé

We outline a protocol that implements both in vivo and ex vivo approaches to study ovarian cancer colonization of peritoneal adipose tissues, particularly the omentum. Furthermore, we present a protocol to quantitate and analyze immune cell-structures in the omentum known as milky spots, which promote metastases of peritoneal adipose.

Résumé

Haute qualité de l'ovaire séreux cancer (HGSC), la cause de métastases péritonéales répandues, continue d'avoir un très mauvais pronostic; moins de 30% des femmes sont en vie 5 ans après le diagnostic. L'épiploon est un site privilégié de la formation de métastases HGSC. Malgré l'importance clinique de cette microenvironnement, la contribution du tissu adipeux épiploïque à la progression de cancer de l'ovaire reste peu étudié. Omental adipeux est inhabituel en ce qu'il contient en tant que structures connues taches laiteuses, qui sont constitués de B, T, et les cellules NK, des macrophages et des cellules progénitrices autour de nids denses de système vasculaire. Taches laiteuses jouent un rôle clé dans les fonctions physiologiques de l'épiploon, qui sont nécessaires pour l'homéostasie péritonéale. Nous avons montré que des taches laiteuses favorisent également le cancer de l'ovaire métastatique de la colonisation adipeux péritonéale, une étape clé dans le développement de métastases péritonéales. Nous décrivons ici les approches que nous développés pour évaluer et quantifier les taches laiteuses en paritoneal adipeux et étudier leur contribution fonctionnelle à la cellule de cancer de l'ovaire métastatique colonisation des tissus omentales fois in vivo et ex vivo. Ces approches sont plus généralisables à des modèles de souris et des lignées cellulaires, ce qui permet l'étude de l'ovaire de la formation de métastases de cancer localisation initiale des cellules de structures ponctuelles laiteux pour le développement de métastases peritoneales généralisées.

Introduction

Contrairement à la plupart des tumeurs solides, des métastases de cancer de l'ovaire séreux de haut grade (HGSC) sont limités à la cavité péritonéale ^1. Ainsi, les thérapies efficaces péritonéale pourraient contrôler ou d'éradiquer HGSC. Actuellement, une approche thérapeutique norme est cytoréduction chirurgicale combinée avec la chimiothérapie ^1-3. Malheureusement, la grande majorité des patients expérience et succomber à des complications de récurrence de la maladie. Ces statistiques lamentables montrent la nécessité d'améliorer la compréhension de la colonisation métastatique, le processus par lequel les cellules cancéreuses à localiser, utiliser, et proliférer dans les tissus de l'hôte pour former des métastases ^2.

L'épiploon est un site début préféré de HGSC métastases ^4-7. Contrairement à d'autres adipeux péritonéale, le tissu adipeux épiploïque contient des structures inhabituelles immunitaires appelées taches laiteuses, qui contiennent B, T et les cellules NK et les macrophages, qui jouent des rôles clés dans Homeos péritonéalesTASIS ^8,9. En plus de leurs fonctions physiologiques, nous avons constaté que des taches laiteuses jouent un rôle actif dans le cancer ovarien métastatique ⁴ colonisation. Dans les dosages de métastases expérimentales, SKOV3ip.1, Caov3, et HeyA8 (humain) et ID8 (murine; C57BL / 6) cellules de cancer ovarien rapidement à domicile points laiteux, ce qui suggère que les cellules se dirigent vers un facteur chimiotactique sécrétée. Fait intéressant, les cellules cancéreuses ne colonisent adipeux péritonéale manque taches laiteuses (c.-à-gonadiques et de la graisse de l'utérus) ^4.

Afin d'identifier les mécanismes de régulation de la colonisation laiteuse place, nous avons optimisé des modèles de xénogreffes qui permettent l'interrogation des événements cellulaires et moléculaires au cours du temps de la colonisation métastatique ^4. Un avantage particulier des approches décrites ici est l'accent mis sur l'architecture et la fonction des tissus, qui permet aux utilisateurs de tester des hypothèses dans entièrement intégré in vivo et ex vivo modèles de metastatic ^4,10 de la colonisation. En comparant la localisation des cellules cancéreuses et la croissance dans les dépôts de graisse péritonéale qui soit contiennent ou manquent des taches laiteuses, les enquêteurs peuvent tester la contribution (s) relative des adipocytes et des cellules à l'intérieur des taches laiteuses à l'hébergement et de la croissance progressive des cellules du cancer de l'ovaire dans les tissus physiologiquement pertinents.

Protocole

Toutes les souris ont été logées, entretenues et euthanasiés selon institutionnel soins des animaux et l'utilisation du Comité (IACUC) directives et sous la supervision de l'Université de Chicago Center des ressources animales.

1. Préparation animaux pour des études expérimentales

1. Permettre aux animaux d'acclimater à de nouveaux logements et de l'environnement, se remettre des effets physiologiques potentiels de transport et de manutention.
   Remarque: La technique suivante est applicable à toutes les souches de souris disponibles dans le commerce. Le nombre d'animaux qui seront utilisés pour une expérience dépend de la conception de l'étude et devrait être fait en consultation avec un statisticien.

2. Identification et isolement de péritonéale Fat dépôts.

1. Euthanasier les animaux via CO ₂ surdose et une méthode physique secondaire pour confirmer la mort.
2. Comme récolte dépôts de graisse péritonéale constitue le prélèvement d'organes internes (méthode secondaire), MAke Une incision médiane proche de la papilles inguinale à travers la paroi péritonéale pour exposer les organes internes (figure 1A).
3. Pour la Omental Fat (OM), exposer le complexe omental / pancréas en étendant la rate de la cavité péritonéale avec une pince (figure 1C). Relâchez épiploon par le pancréas et la rate en coupant près toutes les connexions de tissus. Assurez-vous que tous les tissus du pancréas restant est excisé ^4.
4. Pour la gonadique Fat (GF), utiliser une pince pour soulever la graisse gonadique entourant les ovaires et de l'accise en coupant les connexions de tissus (Figure 1A supérieure righ t) ^4.
5. Pour l'utérus Fat (UF), utiliser une pince pour soulever la graisse de l'utérus qui entoure les cornes utérines et de l'accise en coupant les connexions de tissus (figure 1A en bas à droite) ^4.
6. Pour la mésentérique Fat (MF), couper la jonction entre l'intestin grêle et du pylore. Utilisez une pince à saisir fermement l'extrémité libre dul'intestin grêle, et lentement "peau" à l'écart de la graisse mésentérique. Relâchez la graisse mésentérique de la racine mésentérique l'aide de ciseaux de dissection (figure 1A en bas à gauche) ^4.
7. Pour la Splenoportal Fat (SF), soulever l'extrémité distale de la rate en utilisant une pince pour exposer la bande mince gras de tissu reliant le hile de la rate au pancréas. Exciser la graisse splenoportal faisant d'abord la libération par le pancréas, et ensuite soigneusement disséquer de la rate (figure 1B) ^4.

3. Lactée spot d'identification utilisant Giemsa

1. Omenta d'accise (voir l'étape 2.3) à partir de souris C57BL / 6 et fixer 5% du formol tamponné neutre à 4 ° C pendant 16 heures (O / N).
2. Pour inclusion en paraffine le tissu fixe, choisissez un moule qui est approprié pour la taille du tissu. Verser la paraffine en fusion à partir du réservoir de paraffine pour remplir le moule. Ouvrez la cassette et l'utilisation chaud pourcèpes, transférer le tissu dans le moule.
   1. Orienter soigneusement les tissus pendant inclusion dans la paraffine pour produire des sections longitudinales. Placez la cassette de tissu marqué sur le moulage et appuyez fermement en place. Laisser le moule refroidir pendant au moins 30 min.
3. Couper des sections en série (4 um d'épaisseur) de la paraffine fixés au formol intégré (FFPE) bloc de tissu. Placez une diapositive préalablement nettoyé sous les sections que le ruban de tissu se détache du bloc de paraffine.
4. Série section l'ensemble épiploon; recueillir et tacher chaque troisième section pour Giemsa (voir 3.6). Autoriser la lame de verre avec les sections à l'air sec, de préférence O / N à température ambiante. Diapositives secs sont prêts pour la fixation. Colorer la première section pour hématoxyline et l'éosine pour les comparaisons à des diapositives Giemsa colorées.
5. Déparaffiner les lames par deux incubations séquentielles 5 min en xylenes. Réhydrater diapositives par deux incubations séquentielles dans les domaines suivants: l'éthanol 100%, 95% d'éthanol, et enfin puiser water.
   1. Prendre les précautions adéquates pour éviter les diapositives de séchage. Effectuez toutes les étapes à la température ambiante.
6. Immerger complètement les lames dans une jarre de Coplin contenant une solution de Giemsa à 5% (p / v préparé dans l'eau du robinet) et incuber pendant 4 min à température ambiante. Rincer les lames à l'eau du robinet pendant 60 secondes, l'air sec et monter avec lamelle en utilisant les médias de montage.
7. Image les lames colorées en utilisant un scanner de diapositives entier et processus avec le logiciel du fabricant. Quantifier le volume de tache laiteuse dans les sections omentales colorés au Giemsa en utilisant le logiciel ImageJ ^4.

4. Propagation et préparation des cellules de cancer ovarien pour in vivo et ex vivo études

1. Pré-chaud 15 ml de milieu de croissance de cellules à 37 ° C dans un bain thermique. Préparer un flacon de culture tissulaire de taille appropriée (par exemple, 75 cm zone ² de surface) par marquage avec le nom de la lignée cellulaire, numéro de passage, la date et la personne qui a préparé le stock congelé, et la dateet personne qui dégèle / étalement des cellules.
   Remarque: Dans les études de la métastase de telles informations détaillées est crucial, que la date du gel et que le numéro de passage peut affecter le phénotype métastatique.
2. Utilisation de l'environnement stérile de la hotte de sécurité biologique, une pipette 10 ml de milieu dans le ballon de culture T-75. Retirer un flacon de cellules du système de l'azote liquide et vérifiez l'étiquette pour confirmer le type de cellule. Décongeler un seul flacon de cellules à un moment par le réchauffement de 37 ° C bain de chaleur.
3. En utilisant une technique stérile, une pipette à 1x10 ⁶ cellules décongelé dans le flacon de culture. Placer la fiole dans l'incubateur pour permettre aux cellules de se fixer. Agitez doucement le flacon avant et en arrière pour former une suspension de cellules uniforme.
   1. Placer dans fiole de culture de tissus incubateur et maintenir à 37 ° C dans _5% de CO2 environnement. Permettre aux cellules d'adhérer O / N.
4. Aspirer le milieu, et les remplacer par des milieux de croissance préchauffé frais. Placer la fiole dans l'incubateur et toutOW cellules à croître. Surveiller la croissance des cellules quotidiennement par inspection visuelle tous les 2-3 jours en utilisant un microscope inversé. Utiliser des techniques de culture cellulaire standard aux cellules de passage lorsqu'il atteint 70-80% de confluence.
   Remarque: Pour les essais expérimentaux récolter les cellules à 70% de confluence pour assurer que les cellules se multiplient activement.
5. Aspirer le milieu de culture et rincer avec 10 ml de solution saline tamponnée phosphate stérile (PBS). Aspirer le PBS et ajouter 0,25% trypsine / EDTA (2 à 3 ml d'une ² surface de 75 cm) et on incube 5 min à 37 ° C. Visuellement confirment que les cellules ont détaché et ajouter un volume égal de milieu de croissance, et la pipette en douceur les cellules de haut en bas pour obtenir une suspension de cellule unique.
   Remarque: Il est essentiel que le milieu de culture contient du sérum car il inactive la trypsine. Préparer au moins 2 à 4 fois plus de cellules que le nombre requis pour une expérience donnée pour compenser la perte des cellules au cours des étapes subséquentes
6. Déterminer le pourcentage de cellules viables dans lasuspension par l'intermédiaire d'un dosage d'exclusion du bleu trypan en utilisant un hématimètre ou un compteur de cellules automatisé.
   Remarque: Ici, seulement utiliser des préparations cellulaires dans lesquelles ≥ 96% des cellules sont viables.
7. Transférer la suspension cellulaire à partir de la fiole dans un tube conique de 50 ml. Pellet cellules par centrifugation 5 min à 1100 xg, ^à 4 o C.
8. Aspirer le surnageant et remettre en suspension le culot cellulaire dans du PBS à une concentration de 2x10 ⁶ cellules par ml.

5. injection intrapéritonéale de cellules

Remarque: Dans nos expériences, les souris sont traitées dans un flux d'air laminaire ou enceinte de sécurité biologique au sein de notre centre de barrière afin de limiter le risque d'exposition aux agents pathogènes, Afin de démontrer cette technique clairement, les procédures de la vidéo qui l'accompagne ont été effectuées dans un laboratoire agréé pour le travail des animaux. Cette technique particulière ne nécessite pas que les animaux sont sous anesthésie. Sous protocoles approuvés, effectuer cette technique sur les animaux vivants. Utiliser des souches appropriées de souris pour cette étude. Par exemple: utiliser la souris nude athymiques immunodéprimés, pour l'étude des cellules de cancer ovarien humain (SKOV3ip.1 et HeyA8) la colonisation; utiliser immunocompétents souris C57BL / 6 pour l'étude des souris des cellules de cancer de l'ovaire (ID8) colonisation.

1. Charge 500 pi de la suspension de cellule unique dans la seringue et mettre dans l'aiguille de 25 G plafonné stérile. Cela réduit le cisaillement de la cellule avant l'injection.
2. Choisissez la souris par la peau du cou et maintenez la queue avec la paume et l'index et fixer la patte arrière gauche entre l'annulaire et l'auriculaire (lorsque la souris est retenu avec la main gauche).
   Remarque: Pour éviter les organes abdominaux traumatisantes, retenir la souris bien de sorte qu'il ne peut pas bouger pendant l'injection.
3. Imaginez une ligne à travers abdomen, juste au-dessus des genoux, et de localiser un point sur le côté droit de l'animal et à proximité de la ligne médiane. Le point d'entrée est crânien et légèrement médialdu dernier mamelon.
   Remarque: Insertion de l'aiguille sur le côté droit de la souris permet d'éviter le caecum et réduit le risque de perforer les intestins ^11.
4. Insérer l'aiguille dans la zone latérale inférieure de l'abdomen de la souris à une profondeur d'environ 0,5 cm. Tirer sur le piston afin de confirmer que l'aiguille n'a pas pénétré dans un vaisseau sanguin ou d'autres organes péritonéaux.
   1. Si du liquide est aspiré jeter la seringue (et l'échantillon) ^11. Une aspiration brun verdâtre ou jaune indique pénétration de l'aiguille dans les intestins ou la vessie, respectivement.
5. Injecter l'échantillon en utilisant pression lente et régulière. Retirer l'aiguille et le retour de la souris dans sa cage. Ne pas résumer la seringue avant de les jeter dans un récipient pour objets tranchants.
6. Souris Sacrifice par _asphyxie au CO2 et l'enlèvement d'organes vitaux à des moments spécifiques après l'injection.

6. Lactée place colonisation in vivo

1. Quantitàtion des cellules de cancer de la localisation des taches laiteuses en utilisant la cytométrie en flux
   1. Isoler dépôts de graisse péritonéale de souris (comme décrit dans l'étape 2.3 au 2.7) injecté avec fluorescence taggés cellules cancéreuses et place des tissus immédiats dans PBS glacé.
      1. Pour cette technique particulière, le poids-match de tous les tissus adipeux graisse pour épiploon. Tissus de transfert pour séparer les tubes de 5 ml contenant 1,5 ml de DMEM exempt de sérum et 0,1% (p / v) de sérum-albumine bovine. Tissus Piscine récoltées à partir de trois souris indépendants pour assurer un rendement suffisant de cellules pour la cytométrie de flux.
   2. Mince de tissus à l'aide de ciseaux chirurgicaux et ajouter 1,5 ml de DMEM sans sérum contenant 0,4% (p / v) de la collagénase I. Incuber la suspension tissulaire à 37 ° C pendant 30 min sous agitation rotative.
      1. Comme une étape facultative, dissocier davantage les tissus par la mastication. Dans ce cas, le transfert de la suspension tissulaire collagénase à un sac de microstomacher, mastiquer pendant 10 min à feu, tourner l'orientationdes sacs après 5 min.
   3. Filtrer les échantillons à travers un filtre de nylon mesh (60 um des pores) pour enlever les gros débris. Recueillir les cellules par centrifugation à 250 g pendant 5 min à 4 ° C et jeter la fraction de surnageant.
   4. Remettre en suspension le culot cellulaire dans 100 pi de PBS combinées avec 900 pi de tampon de lyse ACK et incuber à température ambiante pendant 1 min. Centrifuger les cellules à 250 g pendant 5 min et éliminer le surnageant.
      1. Remettre en suspension le culot cellulaire dans 250 pi de PBS glacé. Filtrer les échantillons à travers un tamis de 60 um pores de nylon pour assurer suspension cellulaire unique. Rincer le filtre avec 250 ul de PBS glacé.
   5. Quantifier le nombre de cellules marquées par fluorescence dans la population en utilisant un cytomètre de flux équipé d'un laser jaune-vert 561 nm et a / 15 nm filtre passe-bande 585 nm. Réglez la porte pour les cellules tdTomato positive basées sur l'analyse des cellules parentales et / ou des contrôles négatifs appropriés ^4.
2. La quantification des métastases macroscopiques et microscopiques
   1. Au point limite expérimental souhaité (s), d'isoler et placer immédiatement les tissus dans les médias de fixation appropriée. Fixez échantillons plus larges, tels que gonadique intacte, de l'utérus, et de dépôts de graisse mésentériques à 10% du formol tamponné neutre pendant 48 heures à 4 ° C. Fixer des échantillons plus petits (omental et graisses splenoportal, ainsi que des équivalents de tissus de l'utérus et de la graisse mésentérique) dans 5% du formol tamponné neutre à 4 ° C pendant 2-16 h.
      1. Alternativement, snap geler les tissus en les plaçant dans un milieu tel que le gel PTOM et déposez-les dans une quantité appropriée de l'azote liquide.
   2. Transfert fixé tissus à 70% d'éthanol et conserver à 4 ° C jusqu'à l'intégration dans de la paraffine. Incluez et le tissu de processus comme décrit dans 3.2 et 3.3.
      1. Utilisez la section colorées H & E pour évaluer les tissus pour la présence ou l'absence de métastases microscopiques (par exemple, des groupes de 50 cellules). Confirmez til présence de métastases microscopiques par un procédé secondaire tel qu'un colorant IHC pour la cytokératine 8/18 pour détecter des cellules de cancer de l'ovaire.

7. Lactée spot colonisation Ex Vivo

1. Mise en place de conditions ex vivo de culture d'organes de base omental
   1. Placez chaque épiploon en un seul insert de plaque de culture et sa place dans un puits d'une plaque de culture de tissus de douze puits contenant 500 pi de DME médias / F12 contenant 20% de FCS. Maintenir des cultures d'organes à 37 ° C dans un environnement _de CO 2 de 5% pendant 24 à 48 h et / ou des points de temps supplémentaires. Utilisez trois omenta indépendante (échantillons en triple) pour chaque condition (par exemple, le type de support / point de temps).
   2. Pour confirmer l'intégrité des tissus aux extrémités expérimentales, fixer et échantillons de procédé tel que décrit à l'étape 3. Compter saine par rapport adipocytes nécrotiques sur les sections H & E peut évaluer l'intégrité des tissus. Un minimum de 120 cellules de ~5 échantillons biologiques est nécessaire de formuler un pourcentage de tissus vivants présente ^10.
   3. Pour mesurer la fonction des tissus, lieu omenta (n = 3) dans les puits individuels d'une plaque de 24 puits contenant 500 pi de DME médias / F12 avec 20% de FCS. Laisser omenta de conditionner les médias à 37 ° C dans un environnement _de CO 2 de 5% pendant 24 heures, puis retirez 250 pl pour une utilisation dans un IL-6 ELISA ^10.
2. Ex vivo co-culture de l'épiploon de la souris avec des cellules GFP-SKOV3ip.1
   1. Développer et préparer des cellules par fluorescence marqués comme décrit dans la section 4 et remettre en suspension à une concentration de 2 × 10 ⁶ cellules par ml.
   2. Appliquer ~ 6 ul de la colle pour tissus de la membrane de l'insert de culture et laisser sécher à l'air. Laver la membrane deux fois avec de l'eau stérile pour éliminer tout excès de colle. Sécher à l'air les membranes sous une hotte laminaire.
   3. Exciser soigneusement la omenta et l'attacher à la memb encolléeRane l'aide de pinces stériles. Laisser le tissu d'adhérer à la membrane pendant 1 min avant l'addition de médias. Ajouter 500 ul de la suspension cellulaire sur le dessus de l'épiploon dans chaque insert de culture. Remplissez la zone autour de la chambre de transwell avec 2,5 ml de DME / F-12 ^10.
   4. Incuber omenta avec la suspension de cellules pendant 6 heures à 37 ° C dans un environnement de CO ₂ à 5%. Retirez délicatement et laver le omenta avec ~ 10 ml de PBS. Visualiser fluorescent foyers de cellules de cancer en utilisant un système d'imagerie approprié ¹⁰ fluorescent.

Résultats

Identification et histologique examen des dépôts de graisse péritonéale

Dissection anatomique brute permet l'identification de quatre des cinq principales sources de graisse péritonéale (figure 1A). Déplacement dans le sens horaire à partir du haut au centre sont: l'épiploon (OM; décrit) situé sur l'estomac et de la rate, la graisse des gonades (GF) entourant l'ovaire gauche (vo), la graisse de l'utérus (UF) attachée aux corn...

Discussion

Développement de thérapies pour cibler les cellules disséminées nécessite une compréhension des mécanismes de la colonisation métastatique, la première étape critique dans le développement de la maladie péritonéale. Pour répondre à ces questions que nous signalons approches qui peuvent être utilisés pour discerner comment unique de tissu composition et l'architecture de l'épiploon promouvoir le cancer de l'ovaire métastatique colonisation. Traits distinctifs de notre approche sont...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dissection Tools	Fine Science Tools	NA
Geimsa	Fluka/Sigma Aldrich	48900
5% Formalin	Sigma	HT501320
DMEM	Corning	10-013-CV
Trypsin	Gibco	25200-056
PBS	Corning	21-040-CV	Without calcium and Magnesium
26 gauge needle	BD	329652
BSA	Sigma	A7906
Collagenase	Worthington	LS004196
Stomacher	Seward Labsystems	Stomacher 80 Biomaster
Microstomacher bag	Stomacher Lab Systems	BA6040/Micro
ACK Lysis Buffer	Gibco	A10492-01
Millicell culture plate insert	Millipore	PICM01250
Cell-Tak	Corning	354240