In vivo לשעבר vivo גישות לחקר סרטן השחלות גרורתי התיישבות של מבני ספוט החלב בהצפק שומני

Summary

We outline a protocol that implements both in vivo and ex vivo approaches to study ovarian cancer colonization of peritoneal adipose tissues, particularly the omentum. Furthermore, we present a protocol to quantitate and analyze immune cell-structures in the omentum known as milky spots, which promote metastases of peritoneal adipose.

Abstract

בדרגה גבוהה לסרטן השחלות הצפק (HGSC), הגורם לגרורות הצפק נרחבות, ממשיכה להיות פרוגנוזה גרועה מאוד; פחות מ -30% מהנשים בחיים 5 שנים לאחר האבחון. Omentum הוא אתר מועדף של היווצרות גרורה HGSC. למרות החשיבות הקלינית של מייקרו-סביבה זו, התרומה של רקמת שומן omental להתקדמות סרטן השחלות נותרת understudied. שומן Omental יוצא דופן בכך שהוא מכיל מבנים הידועים ככתמים חלביים, המורכבים מB, T, ותאי NK, מקרופאגים, ותאים המקיפים את הקנים צפופים של כלי דם. כתמי החלב לשחק תפקיד מפתח בפונקציות הפיזיולוגיות של omentum, אשר נדרשות להומאוסטזיס הצפק. הראינו כי כתמים חלביים גם לקדם התישבות השחלות סרטן גרורתי של שומן הצפק, צעד מפתח בפיתוח של גרורות הצפק. כאן אנו מתארים את הגישות שפיתחנו כדי להעריך ולכמת כתמים חלביים לitoneal שומן וללמוד התרומה הפונקציונלית שלהם לקולוניזציה גרורתית תאים סרטניים בשחלות של רקמות omental שני in vivo לשעבר vivo. גישות אלה הן להכליל לדגמים נוספים עכבר ושורות תאים, ובכך לאפשר את חקר היווצרות גרורות סרטן השחלות מלוקליזציה ראשונית של תאים למבני מקום חלביים להתפתחות של גרורות הצפק נרחבות.

Introduction

שלא כמו רוב הגידולים מוצקים, גרורות מסרטן בדרגה גבוהה השחלות הצפק (HGSC) מוגבלות לחלל הצפק ^1. לפיכך, טיפולי הצפק יעילים עלולים לשלוט או לחסל HGSC. נכון לעכשיו, גישה טיפולית סטנדרטית היא cytoreduction כירורגית בשילוב עם כימותרפיה ^1-3. למרבה הצער, הרוב המכריע של מטופלים חווים ולהיכנע לסיבוכים של הישנות מחלה. סטטיסטיקה העגומה אלה מראה את הצורך בהבנה משופרת של קולוניזציה גרורתית, התהליך שבו תאי הסרטן בתרגום ל, לנצל, ולהתרבות בתוך רקמות מארח כדי ליצור גרורות ^2.

Omentum הוא אתר מוקדם המועדף HGSC גרורות ^4-7. שלא כמו שומן הצפק אחר, רקמת שומן omental מכילה מבנים חיסוניים חריגים ידועים ככתמים חלביים, המכילים B, T, ותאי NK ומקרופאגים, אשר ממלאים תפקידי מפתח בhomeos הצפקtasis ^8,9. בנוסף לפונקציות הפיזיולוגיות שלהם, מצאנו כי כתמים חלביים למלא תפקיד פעיל בקולוניזציה גרורתית סרטן השחלות ^4. במבחני גרורות ניסיוניים, SKOV3ip.1, CaOV3, וHeyA8 (אדם) וID8 (עכברי; C57BL / 6) תאי סרטן השחלות במהירות הביתה לכתמים חלביים, המצביע על כך שהתאים לנוע לעבר גורם chemotactic מופרש. מעניין לציין, תאי סרטן לא ליישב שומן הצפק חסר כתמים חלביים (כלומר, האשכים ושומן רחם) ^4.

על מנת לזהות מנגנוני ויסות קולוניזציה מקום חלבי, יש לנו מודלים מותאמים xenograft המאפשרים החקירה של אירועים תאיים ומולקולריים במהלך קולוניזציה גרורתית ⁴ הזמן. יתרון ספציפי של הגישות המתוארות במסמך זה דגש על ארכיטקטורה ותפקוד רקמות, המאפשר למשתמשים לבחון השערות במשולבות במלואו ובמודלי vivo לשעבר vivo של מטר^4,10 קולוניזציה etastatic. על ידי השוואת לוקליזציה של תאי הסרטן וגידול במחסנים שומן הצפק אשר גם להכיל או חסרי כתמים חלביים, חוקרים יכולים לבדוק את תרומתו היחסית (ים) של תאי שומן ותאים בתוך כתמים חלביים ללינה והצמיחה ההדרגתית של תאי סרטן השחלה ברקמות רלוונטיות מבחינה פיזיולוגית.

Protocol

כל העכברים שוכנו, מתוחזק ומורדם בהתאם להנחיות מוסדיות טיפול בבעלי חי ועדת שימוש (IACUC) ותחת פיקוחו של אוניברסיטת שיקגו בעלי החיים מרכז משאבים.

1. בעלי חיים הכנה ללימודים ניסויי

1. לאפשר חיות להסתגל לסביבה חדשה ודיור, להתאושש מהשפעות פיזיולוגיות אפשריות של תחבורה וטיפול.
   הערה: הטכניקה הבאה היא ישימה לכל הזנים הזמינים המסחרית של עכברים. מספר בעלי החיים שישמשו לניסוי תלוי בעיצוב המחקר וצריך להיעשות בהתייעצות מסטטיסטיקאי.

2. זיהוי ובידוד של מאגרי שומן הצפק.

1. להרדים בעלי חיים באמצעות מנת יתר של CO ₂ ושיטה פיזית משנית כדי לאשר מוות.
2. כמחסני שומן הצפק קציר מהווה הסרת איברים פנימית (שיטה משנית), תואר שניke חתך קו האמצע קרוב לגבשושיות מפשעתי דרך קיר הבטן לחשוף את האיברים הפנימיים (איור 1 א).
3. לOmental השומן (OM), לחשוף את הלבלב המורכב / omental ידי הרחבת הטחול מחלל הצפק עם מלקחיים (איור 1C). שחרר omentum מהלבלב והטחול על ידי זמירה מקרוב את כל חיבורי הרקמות. ודא שכל רקמת לבלב שנותרה הוא נכרת ^4.
4. לאשכי השומן (GF), להשתמש במלקחיים כדי להרים את שומן האשכים המקיף את השחלות ובלו על ידי חיתוך חיבורי רקמות (t העליון righ איור 1 א) ^4.
5. לרחם השומן (UF), להשתמש במלקחיים כדי להרים את שומן הרחם מקיף את קרן הרחם ובלו על ידי חיתוך חיבורי רקמות (איור 1 א ימני תחתון) ^4.
6. לmesenteric השומן (MF), לחתוך את הצומת בין המעי הדק והשוער. שימוש במלקחיים לתוקף אחיזת הקצה החופשי שלמעי דק, ולאט לאט "קליפה" זה מהשומן mesenteric. שחרר את שומן mesenteric משורש mesenteric באמצעות מספריים לנתח (איור 1 א השמאלי תחתון) ^4.
7. לSplenoportal השומן (SF), להרים את הקצה הדיסטלי של הטחול באמצעות מלקחיים לחשוף את להקת השומן הדק של רקמת חיבור hilum של הטחול ללבלב. בלו שומן splenoportal ידי השחרור הראשון אותו מהלבלב, ולאחר מכן בזהירות לנתח אותו מהטחול (איור 1) ^4.

3. החלב ספוט זיהוי באמצעות Giemsa מכתים

1. omenta בלו (ראה שלב 2.3) מעכברי C57BL / 6 ולתקן ב5% ניטראלי שנאגרו פורמלין ב 4 מעלות צלזיוס במשך 16 שעות (O / N).
2. לפרפין הטבעת הרקמות קבועות, לבחור תבנית שמתאימה לגודל של הרקמות. יוצקים פרפין המותך ממאגר הנפט כדי למלא את התבנית. פתח את הקלטת ושימוש חם לפטריות לבנות, להעביר את הרקמה לתוך התבנית.
   1. כוון את הרקמות בזהירות במהלך פרפין הטבעה לייצר סעיפים אורך. מניחים את קלטת רקמות שהכותרת מעל דפוס ולחץ בחוזקה במקום. לאפשר העובש להתקרר במשך לפחות 30 דקות.
3. לחתוך קטעי סדרתי (4 מיקרומטר עבים) מפרפין-קבוע פורמלין מוטבע גוש רקמה (FFPE). מקום שקופית precleaned תחת הסעיפים כמו הסרט של רקמה יורד בלוק פרפין.
4. סדר סעיף כל omentum; לאסוף ולהכתים כל חלק שלישי לצביעה גימזה (ראה 3.6). לאפשר שקופיות זכוכית עם הסעיפים לאוויר יבש, רצוי O / N ב RT. מגלשות יבשות מוכנות לקיבעון. להכתים את הסעיף הראשון לhematoxylin ו eosin להשוואות לשקופיות Giemsa מוכתמים.
5. Deparaffinize השקופיות על ידי שני incubations 5 דקות רציפות בxylenes. רעננות שקופיות על ידי שני incubations רציף בפעולות הבאים: אתנול 100%, 95% אתנול, ולבסוף ברז water.
   1. לנקוט באמצעי זהירות נאותה כדי למנוע את השקופיות מייבוש. לבצע את כל הפעולות בRT.
6. לחלוטין לטבול את השקופיות בצנצנת Coplin המכילה 5% פתרון Giemsa (w / v מוכן במים ברז) ודגירה של 4 דקות ב RT. יש לשטוף את השקופיות במים ברז למשך 60 שניות, אוויר יבש והר עם coverslip באמצעות תקשורת הרכבה.
7. תמונת השקופיות המוכתמות באמצעות סורק שקופיות שלם ותהליך עם תוכנה של יצרן. לכמת את הנפח החלבי נקודה בסעיפי omental הצבעוניים Giemsa באמצעות תוכנת ImageJ ^4.

4. רביה והכנת תאי סרטן השחלות בvivo לשעבר vivo מחקרים

1. 15 מיליליטר טרום חם של מדיום גידול תא עד 37 מעלות צלזיוס באמבט חום. הכן בקבוק תרבות רקמה בגודל מתאים (למשל, אזור ² משטח 75 סנטימטרים) על ידי תיוג עם שמו של קו התא, מספר מעבר, תאריך ומי שהכין את המניה הקפואה, ואת התאריךואדם שמפשיר / ציפוי התא.
   הערה: במחקרים של גרורות מידע מפורט כזה הוא חיוני, כמועד הקפאה למטה ומספר מעבר יכול להשפיע על הפנוטיפ גרורתי.
2. שימוש בסביבת סטרילית של מכסה המנוע הבטיחות הביולוגי, פיפטה 10 מיליליטר של מדיום לתוך בקבוק תרבות T-75. הסר בקבוקון של תאים ממערכת החנקן הנוזלית ולבדוק את התווית כדי לאשר את סוג התא. להפשיר רק אחד בקבוקון של תאים בכל פעם על ידי התחממות 37 ° C אמבט חום.
3. באמצעות טכניקה סטרילית, פיפטה 1x10 ⁶ מופשר תאים לתוך בקבוק התרבות. מניחים את הבקבוק בחממה כדי לאפשר לתאים לצרף. נער בעדינות את הבקבוק קדימה ואחורה כדי ליצור השעיה תא אחידה.
   1. הנח בקבוק בתרבית רקמת חממה ולשמור על 37 מעלות צלזיוס ב 5% הסביבה CO _2. לאפשר לתאים לדבוק O / N.
4. תקשורת לשאוב, ולהחליף עם תקשורת צמיחה מחוממת מראש טרי. מניחים את הבקבוק בחממה וכלתאי ow לגדול. צג תא צמיחה מדי יום על ידי בדיקה ויזואלית כל 2-3 ימים באמצעות מיקרוסקופ הפוכה. להשתמש בטכניקות תרבית תאים סטנדרטי לתאי מעבר עם הגיע מפגש 70-80%.
   הערה: מבחני ניסיוניים לקצור את התאים בנקודת מפגש 70% כדי להבטיח שתאים באופן פעיל מתרבים.
5. לשאוב את מדיום התרבות ולשטוף עם 10 מיליליטר של תמיסת מלח שנאגרו פוספט סטרילי (PBS). לשאוב PBS ולהוסיף 0.25% טריפסין / EDTA (2 עד 3 מיליליטר לשטח 75 סנטימטר ²⁾ דגירה 5 דקות ב 37 מעלות צלזיוס. מבחינה ויזואלית לאשר כי התאים מנותקים ולהוסיף נפח שווה של מדיום גידול, ובעדינות פיפטה תאים למעלה ולמטה כדי לקבל השעיה תא בודדת.
   הערה: זה קריטי, כי מדיום הגידול מכיל סרום כפי שמנטרל טריפסין. הכן לפחות 2 עד 4-לקפל יותר תאים מהמספר דרוש לניסוי נתון, כדי לפצות על אובדן של תאים בשלבים הבאים
6. לקבוע את אחוז תאי קיימא בהשעיה באמצעות assay הרחקת trypan הכחול באמצעות hemacytometer או דלפק תא אוטומטי.
   שים לב: כאן, השתמש רק בהכנות תא שבי ≥ 96% מתאי קיימא.
7. מעבירים את ההשעיה התא מהבקבוק לצינור חרוטי 50 מיליליטר. תאים גלולה על ידי צנטריפוגה 5 דקות ב1,100 XG, ב 4 ^{מעלות צלסיוס}
8. לשאוב supernatant ו resuspend התא גלולה ב PBS לריכוז של 2x10 ⁶ תאים לכל מיליליטר.

5. הזרקה של תאי Intraperitoneal

הערה: בניסויים שלנו, עכברי מטופלים בזרימת אוויר למינרית או ארון בטיחות ביולוגית במתקן המחסום שלנו, במטרה לצמצם את הסיכון לחשיפת הפתוגן, כדי להדגים את הטכניקה הזו באופן ברור, הנהלים בווידאו הנלווה נערכו במעבדה המאושרת לעבודה של בעלי חיים. טכניקה מיוחדת זו אינה דורשת חיות להיות תחת הרדמה. תחת פרוטוקולים שאושרו, לבצע techniq זהUE בבעלי חיים. השתמש בזנים מתאימים של עכברים במחקר זה. לדוגמא: להשתמש בעכברי מדוכאי חיסון, athymic בעירום לחקר תא סרטן השחלות אנושי (SKOV3ip.1, וHeyA8) קולוניזציה; להשתמש C57BL / 6 עכברים עם מערכת חיסון למחקר של תאי סרטן השחלות קולוניזציה עכבר (ID8).

1. עומס 500 μl של ההשעיה התא הבודד לתוך המזרק ולשים במחט סטרילית כתרים 25 G. הפעולה זו מפחיתה את תא גז לפני ההזרקה.
2. בחר את העכבר על ידי בעורפו של הצוואר ולהחזיק את הזנב באמצעות הכף והאצבע ולתקן את הרגל האחורית השמאלית בין הטבעת לאצבע קטנה (כאשר העכבר מאופק עם יד השמאל).
   הערה: כדי להימנע מאברי בטן טראומה, לרסן את העכבר כל כך טוב שהוא לא יכול לזוז במהלך ההזרקה.
3. תארו לעצמכם קו רוחב הבטן ממש מעל הברכיים, ולאתר נקודה בצד ימין של החיה וקרובה לקו האמצע. נקודת הכניסה היא גולגולת ולמעט המדיאליהפטמה האחרונה.
   הערה: החדרת המחט בצד הימין של העכבר תמנע את cecum ומפחית את הסיכון לניקוב המעיים ^11.
4. הכנס את המחט באזור התחתון של הבטן לרוחב של העכברים לעומק של כ -0.5 סנטימטר. למשוך בחזרה על הבוכנה כדי לאשר שהמחט לא חדרה כלי דם או איברים אחרים הצפק.
   1. אם כל נוזל להישאף להשליך את המזרק (ומדגם) ^11. לשאוב ירקרק-חום או צהוב מציין חדירת מחט לתוך המעיים או בשלפוחית ​​השתן, בהתאמה.
5. להזריק המדגם באמצעות לחץ איטי ויציב. למשוך את המחט ולהחזיר את העכבר לכלוב שלה. אל לסכם מזרק לפני הרשות במכל חדים.
6. עכברי קורבן באמצעות CO ₂ מחנק והסרת איברים חיוני בנקודות זמן ספציפיות לפרסם הזרקה.

6. קולוניזציה מקום החלב בvivo

1. Quantitation של לוקליזציה של תאי סרטן לכתמים חלביים באמצעות cytometry זרימה
   1. לבודד מחסני שומן הצפק מעכברים (כמתואר בשלב 2.3-2.7) הוזרק מתויג fluorescently תאי סרטן ורקמות מקום מיידיים בPBS קר כקרח.
      1. לטכניקה זו בפרט, משקל התאמה כל רקמות שומן שומן לomentum. העברת רקמות להפריד 5 מיליליטר צינורות המכילים 1.5 מיליליטר של סרום ללא DMEM ושל 0.1% (w / v) אלבומין בסרום שור. רקמות בריכה שנקטפו משלושה עכברים עצמאיים כדי להבטיח תשואה מספקת של תאים לcytometry זרימה.
   2. רקמות בשר טחון באמצעות מספריים כירורגיות ולהוסיף 1.5 מיליליטר של הסרום ללא DMEM המכיל 0.4% (w / v) collagenase I. דגירה ההשעיה רקמות על 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות עם ערבוב סיבובי.
      1. כצעד אופציונאלי, נוסף לנתק רקמה על ידי לעיסה. במקרה זה, להעביר את ההשעיה רקמות collagenase לשקית microstomacher, ללעוס במשך 10 דקות על נמוך, מסתובב האורינטציהשל השקיות לאחר 5 דקות.
   3. דגימות סינון דרך מסנן רשת ניילון (60 מיקרומטר נקבובית) כדי להסיר שאריות גדולות יותר. איסוף תאים באמצעות צנטריפוגה ב 250 XG במשך 5 דקות על 4 מעלות צלזיוס וזורקים את חלק supernatant.
   4. Resuspend התא גלולה בשל PBS 100 μl בשילוב עם 900 μl של חיץ תמוגה ACK ולדגור על RT דקות 1. תאי צנטריפוגה ב 250 XG במשך 5 דקות וזורקי supernatant.
      1. Resuspend התא גלולה ב250 μl של PBS קר כקרח. סנן את הדגימות באמצעות רשת ניילון נקבובית 60 מיקרומטר כדי להבטיח השעיה תא בודדת. יש לשטוף את המסנן עם 250 μl של PBS קר כקרח.
   5. לכמת את מספר התאים מתויגים fluorescently באוכלוסייה באמצעות cytometer זרימה מצויד בליזר צהוב-ירוק-561 ננומטר וננומטר 585/15 ננומטר מסנן bandpass. הגדר את השער לתאי tdTomato-חיובי המבוססים על ניתוח של תאי הורים ו / או בקרות שליליות מתאימות ^4.
2. Quantitation של גרורות מיקרוסקופיות ומקרוסקופיים
   1. בנקודת הסיום הרצוי הניסיונית (ים), לבודד, ומייד למקם את הרקמות בתקשורת הקיבעון המתאימה. תקן דגימות גדולות יותר, כגון האשכים שלמים, רחם, ומחסני שומן mesenteric ב 10% ניטראלי שנאגרו פורמלין למשך 48 שעות על 4 מעלות צלזיוס. תקן דגימות קטנות (omental ושומן splenoportal, כמו גם שווי רקמות של רחם ושומן mesenteric) ב 5% ניטראלי שנאגרו פורמלין ב 4 מעלות צלזיוס במשך שעה 2-16.
      1. לחלופין, הצמד להקפיא רקמות על ידי הצבת אותם במדיום הקפאה כגון OCT ושחרר לכמות מתאימה של חנקן נוזלי.
   2. העברה קבועה רקמות לאתנול 70% ולאחסן ב 4 מעלות צלזיוס עד ההטבעה בפרפין. שבץ ורקמות תהליך כפי שתואר ב3.2 ו -3.3.
      1. השתמש בסעיף H & E המוכתמת להעריך רקמות לנוכחות או עדר של גרורות מיקרוסקופיות (כלומר, אשכולות של 50 תאים). אשר לאהוא הנוכחות של גרורות מיקרוסקופיות בשיטה משנית כגון כתם IHC לcytokeratin 8/18 כדי לזהות תאי סרטן השחלות.

7. החלב ספוט התיישבות Ex Vivo

1. הקמת תנאי תרבות הבסיסיות vivo לשעבר איבר omental
   1. מניחים כל omentum להוספת צלחת תרבות אחת ומקום בתוך היטב אחד של צלחת תרבית רקמת עשר היטב המכילה 500 μl של תקשורת / F12 DME FCS המכילה 20%. לשמור על תרבויות איבר על 37 מעלות צלזיוס בסביבת 5% CO ₂ במשך 24 עד 48 שעות ו / או נקודות זמן נוספות. להשתמש בשלוש omenta העצמאי (דגימות בשלושה עותקים) לכל מצב (למשל, סוג תקשורת / נקודת זמן).
   2. כדי לאשר את תקינות רקמות בנקודתי הקצה הניסיונית, לתקן ודגימות תהליך כפי שמתואר בשלב 3. ספירה בריאה לעומת adipocytes נמקים בסעיפי H & E יכולה להעריך שלמות רקמות. מינימום של 120 ~ תאים מ5 דגימות ביולוגיות נדרש לגבש אחוז רקמת חיה כיום ^10.
   3. כדי למדוד תפקוד רקמות, omenta המקום (n = 3) בבארות נפרדות של צלחת 24 היטב המכילה 500 μl של תקשורת / F12 DME עם FCS 20%. לאפשר omenta להתנות את התקשורת על 37 מעלות צלזיוס בסביבת 5% CO ₂ למשך 24 שעות, ולאחר מכן להסיר 250 μl לשימוש בELISA assay IL-6 ^10.
2. שיתוף תרבות vivo לשעבר של omentum העכבר עם תאי SKOV3ip.1-GFP
   1. לגדול ולהכין תאים מתויגים fluorescently כאמור בסעיף 4 וגלול בריכוז של 2 × 10 ⁶ תאים למ"ל.
   2. החל ~ 6 μl של דבק רקמות הקרום של להכניס את התרבות ולאפשר לו אוויר יבש. לשטוף את הממברנה פעמיים עם מים סטריליים כדי להסיר כל דבק מוגזם. אוויר יבש הקרומים מתחת למכסת מנוע למינרית.
   3. בלו בזהירות את omenta ולצרף אותו לmemb המצופה הדבקהRANE באמצעות מלקחיים סטרילית. לאפשר לרקמות לדבוק בקרום 1 דקות לפני הוספת תקשורת. הוסף 500 μl של ההשעיה התא זה על גבי זה omentum בכל הכנס תרבות. מלא סביב תא transwell האזור עם 2.5 מיליליטר של DME / F-12 ^10.
   4. דגירה omenta עם השעיה תא במשך 6 שעות על 37 מעלות צלזיוס בסביבת CO ₂ של 5%. מוציא בזהירות ולשטוף את omenta עם ~ 10 מיליליטר של PBS. דמיינו מוקדי תאי סרטן ניאון באמצעות מערכת הדמיה ניאון מתאימה ^10.

תוצאות

זיהוי ובדיקה היסטולוגית מאגרי שומן הצפק

נתיחה אנטומיים גולמית מאפשרת זיהוי של ארבעה מחמשת המקורות העיקריים של שומן הצפק (איור 1 א). נע בכיוון השעון מהמרכז העליון הם: omentum (OM; התווה) ממוקם על הבטן והטחול, שומן האשכי...

Discussion

פיתוח של טיפולים למקד תאים הפיצו דורש הבנה מכניסטית של קולוניזציה גרורתית, הצעד הראשון הקריטי בהתפתחות של מחלה הצפק. כדי לטפל בבעיות אלה אנו מדווחים גישות שניתן להשתמש כדי להבחין איך הרכב של omentum ייחודי רקמה והאדריכלות לקדם קולוניזציה גרורתית סרטן השחלות. מאפיי...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dissection Tools	Fine Science Tools	NA
Geimsa	Fluka/Sigma Aldrich	48900
5% Formalin	Sigma	HT501320
DMEM	Corning	10-013-CV
Trypsin	Gibco	25200-056
PBS	Corning	21-040-CV	Without calcium and Magnesium
26 gauge needle	BD	329652
BSA	Sigma	A7906
Collagenase	Worthington	LS004196
Stomacher	Seward Labsystems	Stomacher 80 Biomaster
Microstomacher bag	Stomacher Lab Systems	BA6040/Micro
ACK Lysis Buffer	Gibco	A10492-01
Millicell culture plate insert	Millipore	PICM01250
Cell-Tak	Corning	354240