Caracterización de tímico Instalarse Progenitores en el embrión de ratón Uso<em&gt; En Vivo</em&gt; Y<em&gt; In Vitro</em&gt; Ensayos

Resumen

This article describes in vivo and in vitro methodology to characterize the thymic settling progenitors by the analysis of the kinetics of generation, phenotype and numbers of their T cell progeny.

Resumen

La caracterización del timo resolver progenitores es importante comprender las etapas de pre-timo de desarrollo de las células T, esencial para diseñar estrategias para el reemplazo de las células T en pacientes lymphopenic. Estudiamos timo resolver progenitores desde el día embrionario murino 13 y 18 timos por dos complementarios in vitro e in vivo técnicas, ambos basados ​​en el método de la "gota colgante". Este método permitió colonizar lóbulos tímicos fetales irradiados con E13 y / o E18 progenitores timo que se distinguen por CD45 marcadores alotípicos y por lo tanto después de su progenie. La colonización con poblaciones mixtas permite analizar las diferencias autónomas celulares en propiedades biológicas de los progenitores, mientras que la colonización, ya sea con la población elimina posibles presiones selectivas competitivos. Los lóbulos tímicos colonizados también pueden ser injertados en ratones receptores masculinos inmunodeficientes que permiten el análisis de la madura progenie de células T in vivo, como la dinámica de la población de tél periférica sistema inmunológico y colonización de diferentes tejidos y órganos. Cultivos de órganos del timo fetal revelaron que los progenitores E13 desarrollaron rápidamente en todos maduran las células CD3 ⁺ y dieron lugar al subconjunto de células T γδ canónica, conocidas como células T epiteliales dendríticas. En comparación, los progenitores E18 tienen una diferenciación retardada y no fueron capaces de generar células epiteliales T dendríticas. El seguimiento de sangre periférica de timo-injertado CD3 ^{- / -} ratones mostró además que los progenitores E18 tímico de sedimentación generan, con el tiempo, un mayor número de células T maduras que sus contrapartes E13, una característica que no se pudo apreciar en el corto plazo del timo fetal cultivos de órganos.

Introducción

Linfocitos T, que lleva el αβ o γδ receptor de células T (TCR), se diferencian en un órgano especializado, el timo. El timo plenamente desarrollado está organizado en dos regiones distintas: la corteza, donde se desarrollan los progenitores del timo y en timocitos que productivamente reorganizan los β TCR y genes de la cadena α son rescatados de la muerte programada (un proceso conocido como selección positiva); y la médula, donde selecciona timocitos con demasiado fuerte reactividad a auto-ligandos se borran (selección negativa) ^1,2. El timo se origina en la capa endodérmico de la tercera bolsa faríngea que más tarde se encuentra rodeada por las células mesenquimales ^3. Se colonizada por progenitores hematopoyéticos a partir de día embrionario E12 y, a partir de entonces, se requiere el reclutamiento continuo para el desarrollo de células T normales ^4. Inmigrantes tímicos evolucionan a través de sucesivas etapas de desarrollo, orquestada por un programa estrictamente regulados, iniciado y maintained por la activación de la vía de señalización Notch en los timocitos tras la interacción con su ligando, como delta 4, expresado en las células epiteliales del timo (TEC) ^5.

Desarrollo de los timocitos comienza en la llamada CD4 ^- CD8 ^- (DN) etapas doble negativos. Timocitos DN pueden subdividirse de acuerdo con la expresión de CD25 y CD44 en DN1 (CD25 ^- CD44 ^+), DN2 (CD25 ⁺ CD44 ^+), DN3 (CD25 ⁺ CD44 ^-) y DN4 (CD25 ^- CD44 ^-). CD24 (HSA) y CD117 (c-Kit) subdivide aún más el compartimento DN1 en 5 subgrupos donde DN1A ayb corresponden a los progenitores tímicas tempranas (PTE). Timocitos reorganizar las δ, β y α cadenas de TCR en la etapa de DN y se someten a pre-TcR selección (etapas DN3-DN4). Ellos aún más el tránsito a la doble positivo (DP) compartimento CD4 ⁺ CD8 ⁺ en la cadena α TcR reorganiza antes de la sele positivo y negativocción. En esta etapa la mayoría de los timocitos se eliminan y sólo un pequeño porcentaje (3-5%) llegan a la CD4 ⁺ o CD8 ⁺ T maduras compartimento celular.

La vía de diferenciación linfoide progresa a través de las etapas de las CMH que generan progenitores multipotentes (MPP) y progenitores multipotentes linfoides cebado (LMPP) que perdieron la eritrocitos y megacariocitos potencial ^6. LMPP son fenotípicamente define por la ausencia de marcadores de células de la sangre diferenciadas (linaje negativo, Lin ^-), la expresión de c-Kit (CD117), Sca-1 y Flt3 / Flk2 (CD135) y la ausencia de niveles detectables de la interleucina ( IL) -7 receptores α cadena (IL-7rα o CD127). LMPPs diferenciar aún más en progenitores linfoides comunes (CLP) ⁷ que por esa etapa han perdido la capacidad de generar células mieloides. CLP retener de linfocitos (B y células T), células NK, DC y células linfoides innata (ILC) potencial, y difieren de LMPP por la expresión de CD127 y la ausencia de altos niveles de Sca-1.

Aunque la naturaleza de los progenitores del timo de sedimentación (PST) se ha debatido ampliamente ^8, que recientemente se convirtió en claro que el cambio TSP fenotipo, el potencial y la función de la diferenciación, a través del desarrollo ^9. Se realizó in vitro y en ensayos in vivo para caracterizar el TSP, aislado por FACS de células de clasificación de cualquiera de E13 (primera onda) o E18 (segunda onda). Culturas timo fetales de órganos (FTOC) con lóbulos tímicos irradiados colonizados por un número igual de E13 y E18 progenitores, teniendo diferentes marcadores alotípicos, se admiten después de su progenie en un entorno de desarrollo similar y reveladas propiedades intrínsecas celulares, diferentes entre ambos tipos de progenitores. Lóbulos tímicos colonizados por cualquiera E13 o E18 TSP permite el desarrollo sin la selección debido a la competencia entre ambos progenitores. In vivo el trasplante de los lóbulos tímicos colonizados mostró además que también tque la progenie madura de E13 y E18 TSP tiene diferentes propiedades biológicas in vivo. TSP de la primera ola generan rápidamente las células T, pero dan lugar a un bajo número de αβ y γδ células T. Entre estos últimos se detectaron células dendríticas Vγ5Vδ1 epiteliales T (LTED), que tienen un TcR invariante, migrar a la epidermis donde ejercen una función en la cicatrización de heridas y sólo se producen durante el desarrollo embrionario ^10. Por el contrario, TSP de la segunda ola de tomar más tiempo para generar un gran número de células T TcR ⁺ y son incapaces de generar DETC.

Protocolo

Declaración de Ética: todos los experimentos se realizaron de acuerdo a la Carta Ética del Instituto Pasteur, aprobado por el Ministerio de Agricultura francés, ya las directrices de la UE. Un manipulador con el entrenamiento en cirugía de pequeños roedores, certificada por el Ministerio de Agricultura francés, lleva a cabo todas las intervenciones quirúrgicas.
NOTA: Vea en el anexo Tabla 1 muestra el procedimiento del plan de 5 pasos.

1. La selección de los embriones

1. Utilice 36 hembras C57BL / 6 CD45.2, 12 hembras CD45.1, 12 C57BL / 6 machos CD45.1 y 12 C57BL / 6 machos CD45.2. Cruzando las hembras, ya sea con genotipo masculino producirá embriones CD45.1 / 2 y CD45.1 utilizan como una fuente de TSP o CD45.2 utilizado como fuente de receptores lóbulos tímicos. Casa todos los hombres individualmente.
2. Para obtener embriones para el aislamiento E18 TSP, coloque 2 hembras en una jaula con un CD45.1 masculina a las 6 pm, 21 días antes del experimento injerto. Compruebe la presencia de un tapón vaginal al día siguiente, antes del mediodía. Sepaevaluar las hembras enchufados.
3. Para obtener embriones E14 a ser colonizada por TSP, repita el procedimiento anterior (1.2), utilizando machos CD45.2, 17 días antes del experimento injerto.
4. Para obtener embriones para aislar E13 TSP, repita el procedimiento anterior (1.2), utilizando machos C57BL / 6 CD45.1, 16 días antes del experimento injerto.

2. Disección de los embriones Bajo un Horizontal de Flujo Laminar Capucha

NOTA: Dos días antes del experimento injerto.

1. Sacrificar las mujeres embarazadas por dislocación cervical o por administración progresiva de CO ₂ de gas durante al menos 5 minutos, en una cámara cerrada saturando. Asegúrese de muerte por paro definitivo de movimientos cardio-respiratorio. Moje el abdomen con etanol al 70%.
2. Haga una incisión longitudinal en la piel en el abdomen en la línea media y abrirlo tirando de la piel a pedazos. Abra el peritoneo con pinzas y tijeras sin tocar el tracto digestivo. Saque el uter bífidanosotros y separarla de la vagina con las tijeras.
3. Coloque el útero en un plato de 90 x 15 mm de Petri que contiene 40 a 50 ml de DPBS y cortar transversalmente entre decidua de cada embrión.
4. Con el par de tijeras de punta fina y unas pinzas finas quitar la membrana muscular del útero, sacar los embriones cortando entre la placenta y el saco vitelino, y quitar el amnios, que está reteniendo los embriones.
5. Coloque los embriones en un plato de Petri 90 x 15 mm que contienen HBSS + 1% de suero de ternera fetal (FCS). Para los embriones mayores de E15, retire las cabezas con un par de tijeras antes de la disección más.

3. Aislamiento del timo

1. Bajo la lupa binocular, colocar el embrión, tumbado en posición supina (vista ventral), en una ropa de cama de gasa húmeda.
2. Inserte un fórceps longitudinalmente a lo largo del cartílago del esternón, pellizcar y abra la rejilla torácica. Con pinzas curvas, tire de la pared torácica a un lado para visualizar el thymic lóbulos en cada lado de la tráquea.
3. Sostenga con cuidado cada lóbulo pellizcando debajo con una pinzas finas y colocarlas en una placa de Petri que contiene 1 ml de HBSS + 1% de FCS. Aislar los lóbulos y eliminar el tejido conectivo que rodea con dos jeringas de 1 ml + 26 G ⅜ "agujas, sin dañar la cápsula.
4. Lavar los lóbulos en 3 ml de HBSS + 1% de FCS para eliminar las células sanguíneas.
   NOTA: Antes de E15, lóbulos tímicos se encuentran en cada lado de la tráquea y el fusible más tarde en el medio para constituir un órgano bi-lobar.

4. Las suspensiones celulares

1. Desmenuzar los lóbulos bajo la lupa binocular, con dos agujas 26 G montados en 1 ml jeringas, en HBSS + 1% de FCS. Se filtra la suspensión celular a través de una malla de nylon.

5. La tinción con anticuerpos fluorescentes y clasificación de células

NOTA: Todos los anticuerpos se titulan previamente para obtener la definición óptima de las poblaciones (la titration puede variar con el lote de anticuerpo).

1. Incubar los timocitos (E13 o E18) durante 15-30 min a 4 ° C con 100 l de un cóctel de anticuerpos biotinilados para teñir las células de linaje positivos (anti-CD19, anti-Gr1, anti-Ter119, anti-NK1.1 , CD11c anti-, anti-CD3, anti-CD4, anti-CD8, anti-CD25).
2. Para lavar el exceso de anticuerpos giran por los tubos con 4 ml de HBSS + 1% de FCS a 280 xg durante 7 minutos, eliminar el sobrenadante y volver a suspender el sedimento en fresco HBSS + 1% de FCS. Repetir la centrifugación.
3. Se incuban las células marcadas con biotina E18 con microperlas de estreptavidina durante 15 min a 4 ° C y se lavan las células dos veces en HBSS 1% de FCS. Vuelva a suspender las células en 2 ml de HBSS + 1% de FCS. La mayoría de los timocitos E13 son linaje negativo y por lo tanto no necesitan MACS enriquecimiento antes de la clasificación de células.
4. Pasar las células en la columna de la LS, de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Cuando toda la suspensión de células entró en la columna de añadir 2 ml de HBSS + 1% de FCS. Recuperar el4 ml de la columna de flujo a través y centrifugar las células durante 7 min a 280 x g.
5. Vuelva a suspender el sedimento de cualquiera empobrecido E18 o E13 timocitos totales en 50 l de la mezcla de anticuerpos TSP (anti-CD117 de APC, anti-CD135 PE, anti-CD127 PECy7, anti-CD24 FITC, anti-CD44 APCCy7 y estreptavidina Pacific Blue ) y se incuba durante 20 min a 4 ° C en la oscuridad.
6. Lavar las células con 4 ml de HBSS + 1% de FCS y volver a suspender las células en 1 ml de HBSS + 1% de FCS con yoduro de propidio.
7. Ordenar la TSP Lin ^- CD44 ⁺ CD117 ⁺ CD24 ⁺ CD135 ^baja CD127 ⁺ células en un FACS (con 4 lasers) sobre un tubos de 1,5 ml que contienen 200 l medio completo + 20% FCS. Gate primero las células en función de su tamaño y granularidad de FSC y SSC canales. Elimina las células muertas (tinción con yoduro de propidio), puerta a cabo dobletes y anotar la fluorescencia en las escalas exponenciales. Alrededor de 100 o 600 TSP se pueden obtener de uno E13 o E18 uno timo, respectively.

6. La colonización de E14 tímico lóbulos con Progenitores: Colgante Técnica gota

1. Irradiar (30 Grays = 30 Gy) E14 lóbulos tímicos a partir de embriones CD45.2, 3 hr antes del cultivo.
   NOTA: E14 o E15 lóbulos tímicos se han utilizado con éxito como receptor de células T progenitoras. El uso de receptores lóbulos tímicos de posteriores días de gestación produce necrosis prematura debido al mayor tamaño del órgano, mientras que los lóbulos del timo en días anteriores gestacional desarrollan mal, probablemente debido a un desarrollo incompleto de las células epiteliales.
2. Centrifugar ordenadas TSP y resuspender las células en medio de cultivo (medio completo OPTI-MEM con 10% de FCS, penicilina (50 unidades / ml), estreptomicina (50 mg / ml) y 2β-mercaptoetanol (50 M)) tal que 35 l contiene 500 TSP.
3. Coloque una gota 35 l de suspensión de células cada otro pocillo de una placa Terasaki bien 60.
   NOTA: 35 gotas mu l pueden fusionarse si se colocan en pozos contiguos.
4. Coloque un lóbulo irradiado en la superficie de cada gota. Cierre la placa Terasaki y girar la placa boca abajo para permitir que las células alcanzan el polo apical de la caída por gravedad.
5. Hit suavemente el lado superior de la placa invertida para forzar a los lóbulos a deslizarse hacia el borde apical de la gota. Incubar la placa Terasaki invertida en un incubador humidificado durante 48 horas a 37 ° C + 5% de CO _2. Después de la colonización, ya sea cultura E14 timos en FTOC ^7, o injerto bajo la cápsula renal de un receptor de ratón adulto ^8.

7. fetal timo Órgano Cultura

1. Coloque 3 ml de medio completo en un plato de 35 mm Petri. Publicar un filtro de membrana isopore flotando en el medio. Coloque los lóbulos reconstituidos en el borde de la membrana con un fórceps (no más de 8 lóbulos en una membrana).
2. Colocar las placas de Petri que contienen los lóbulos tímicos dentro de un plato Petri de 90 mm, junto con un plato de 35 mm, sin cubierta, que contiene 2 ml de water, para asegurar la humedad óptima. Incubar 12 días a 37 ° C + 5% de CO _2.

8. Injertos bajo la cápsula renal Bajo estériles Condiciones

NOTA: El parénquima renal está rodeado por tejido conectivo formando una cápsula. La región sub-capsular es particularmente rica en vasos sanguíneos y linfáticos, proporcionando así un ambiente adecuado para el desarrollo de injertos (por ejemplo, los lóbulos del timo, islotes pancreáticos o corazones de recién nacidos). Los injertos se realizan generalmente en el riñón izquierdo debido a que es más accesible que el riñón derecho. CD3 ^{- / -} ratones machos fueron utilizados como receptores evitando así reacción injerto contra huésped, debido a los antígenos de histocompatibilidad menores vinculados con el cromosoma Y porque la determinación del sexo antes del E15 no es fácil de hacer.

1. Esterilizar los instrumentos y usar guantes estériles a lo largo de la cirugía. Anestesiar al ratón mediante inyección intraperitoneal de una solución de ketamina 10 mg / ml + xilazina 1 mg /ml diluido en PBS: (50 a 100 l por 10 g de peso corporal), usando una jeringa de 1 ml. Verificar la anestesia mediante la comprobación de falta de reflejos interdigitales. Coloque una gota de hidro-Optimune gel en cada ojo para evitar la sequedad durante la anestesia.
   NOTA: La solución debe ser preparada extemporáneamente y se calentó a temperatura ambiente antes de la inyección. La anestesia dura por lo menos 20 min. El grado de la anestesia debe ser controlada a lo largo de la cirugía. La anestesia puede ser prolongada por inyección intra peritoneal de media dosis cada 20 min.
2. Coloca el ratón sobre su lado derecho, bajo una campana de flujo lamina horizontal. Esterilizar el campo quirúrgico con etanol al 70% y 10% de solución de yoduro de dérmica. Con una parte fórceps el pelo del ratón a lo largo de una longitud de 2 cm justo por encima de la articulación de la pata trasera. Afeitarse el área quirúrgica.
3. Con un bisturí, hacer una incisión de 1,5 cm de longitud de primera, el tejido cutáneo, a continuación, con las tijeras cortan el tejido muscular. Aplicar una ligera presión a ambos lados de la incisión, Lo que obligará al riñón fuera de la cavidad abdominal.
4. Aplicar una solución salina con un algodón yema para mantener el riñón húmedo. Si tiene dificultades para exponer el órgano, utilice unas pinzas planas para sacar el tejido que rodea los adipocitos a la que se adjunta el riñón. Mantener el riñón fuera de la cavidad retroperitoneal por un bastoncillo de algodón colocado debajo del órgano.
5. Con dos pinzas finas, hacer un agujero de 2-3 mm en la cápsula (evite tocar el parénquima para prevenir el sangrado). Durante todo el procedimiento quirúrgico mantener la cápsula renal expuestos humedecido continuamente.
6. Inserte cuidadosamente los lóbulos bajo la cápsula renal, mediante el mantenimiento de la pared de la cápsula se abrió y deslice el injerto bajo la cápsula hacia el polo borde. Coloque hasta 6 lóbulos por riñón.
7. Vuelva a colocar el riñón en la cavidad retroperitoneal. Suturar la aponeurosis del músculo, entonces la piel con nudos cirujano individuales. Moje la herida con una solución de povidona yoduro de 10%. Coloque el ratón en un pa climatizadad a 37 ° C.
8. Encuesta del ratón trasplantado hasta la recuperación total de la anestesia por el control del cardiacas, respiratorias y bigotes movimientos, colores de la mucosa hasta la recuperación total visto por uno mismo contenía movimientos.
   NOTA: Se recomienda la inyección de solución analgésica (buprenorfina, 0,1 mg / kg) de músculo intra justo después de la cirugía y los 2 días después de la cirugía para prevenir el dolor después de la cirugía.
9. Mantenga el animal operado de manera aislada hasta que se recupere totalmente. Inspeccionar cada otro día los puntos de sutura de la herida para verificar y prevenir la infección. Nunca observado infección de la herida después de este procedimiento.
   NOTA: análisis semanal de las células de sangre periférica de la CD3 ^{- / -} ratones injertados nos permiten detectar el timo poblaciones derivadas originó a partir de cualquiera de E13 o E18 progenitores utilizando el marcador alotípica CD45 y el linaje de células T anticuerpos específicos (Figura 3).

9. Análisis de la progenie TSP por citometría de flujo

1. Tease los FTOCs individualmente para obtener suspensiones de células individuales (ver sección protocolo 4).
2. Suspensiones celulares de manchas de lóbulos individuales con una mezcla de anticuerpos que contiene anticuerpos que reconocen CD45.1 PECy7, CD45.2 AmCyan, CD4 APCCy7, CD8 APC, CD3 Pacific Blue, Vγ5 FITC, PE Vδ1 e incubar como se describe en la sección 5.
3. Vuelva a suspender las células en HBSS + 1% de FCS + yoduro de propidio y analizar en un citómetro de flujo (ver resultados en la Figura 2).

Resultados

Con el fin de elegir un método para agotar lóbulos tímicos de timocitos endógenas que permitan el mejor desarrollo de los progenitores que colonizan, se compararon los niveles de reconstitución de células T en los lóbulos tímicos colonizados después de la irradiación o un desoxi-guanosina 5 días de tratamiento (d-Gua). Los resultados muestran que, si bien no hay ninguna diferencia en el día 9 de la cultura, lóbulos irradiados contenían más células T que los tratados con d-Gua, en el día 12. Así, la irr...

Discusión

Dos ensayos principales pueden ser utilizados para analizar la diferenciación de células T ex vivo. El es la más reciente informó el co-cultivo de células progenitoras hematopoyéticas con células estromales de BM, OP9, expresando los ligandos de Noth1, delta como 1 o 4 ^12. Este ensayo 2-D es fácil de realizar, altamente eficiente y sensible, lo que permite el análisis en el nivel de células individuales. Sin embargo, no apoya el desarrollo de células T más allá de la etapa de DP ni la ge...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
90 x 15 mm and 35 x 15 mm plastic tissue culture Petri dishes.	TPP	T93100/T9340	Sampling
26 G ⅜" 0.45 x 10 mm syringes with needles	BD Plastipak	300015	Cell suspension
Nylon mesh bolting cloth sterilized 50/50 mm pieces.	SEFAR NITEX	03-100/32	Filtration of cells
Ethanol 70%.	VWR	83801.36	Sterility actions
Iodide Povidone 10% (Betadine)	MEDA Pharma	314997.8	Sterility actions
Ketamine 100 mg/ml (stock solution)	MERIAL		Anesthesic
Xylazine 100 mg/ml in PBS (stock solution)	Sigma	X1251-1G	Anesthesic and muscle relaxant
Buprenorphin 0.3 mg/ml stock solution	AXIENCE		Morphinic analgesic
Ophtalmic gel (0.2% cyclosporin)	Schering-Plough Animal Health		Eye protection
DPBS (+ CaCl2, MgCl2)	GIBCO Life Technology	14040-174	to isolate embryos
HBSS Hanks' Balanced Salt Solution (+ CaCl2, MgCl2)	GIBCO Life Technology	24020-091	to wash out the blood and dissect the embryos
OPTI-MEM I GlutaMAX I	GIBCO Life Technology	51985-026	Medium for cultures
Fetal calf serum	EUROBIO	CVFSVF00-0U	additive for cultures
Penicilin and streptomycin	GIBCO Life Technology	15640-055	Antibiotics for cultures
2-Mercaptoethanol	GIBCO Life Technology	31350010	additive for cultures
LEICA MZ6 Dissection microscope	LEICA	MZ6 10445111	Occular W-Pl10x/23
Cold lamp source	SCHOTT VWR	KL1500 compact	Two goose neck fibers adapted
Silicone elastomer	World Precision Instruments	SYLG184	Dissecting Pad
Spoon, round and perforated	Fine Science Tools	10370-18	Dissection tools
Fine iris scissors	Fine Science Tools	14090-09	Dissection tools
Vannas spring scissors	Fine Science Tools	15018-10	Dissection tools
Forceps: Dumont #5/45 Inox 11 cm	F.S.T.	11253-25	Dissection tools
2 pairs of fine straight watchmakers’ forceps Dumont #5 11 cm fine tips.	Fine Science Tools	11295-20	Dissection tools
Polyamid thread with needle 6-0 C-3 3/8c	ETHICON	F2403	for sutures
Needle-holder	MORIA/F.S.T.	12060-02	for sutures
Heating pad	VWR	100229-100	To maintain mouse temperature during anesthesy
Membrane Isopore RTTPO2500	DUTSCHER	44210	For FTOC
Terasaki 60 wells plates	FISHER	1x270 10318801	For hanging drop technique
Gauze swabs steriles 7.5 x 7.5 cm	Hydrex	11522	To apply disinfecting solution
Fluorescence or biotin labelled antibodies	BD Biosciences, Biolegend or e-Biocsiences	Clone Number see table below	Staining cells
MACS Columns/Streptavidin Microbeads	Miltenyi Biotec	130-042-401/130-048-101	Cell depletion
Mice	Charles Rivers Laboratories (CD45.1) and Janvier Labs  (CD45.2)	C57BL/6 CD45.1 OR CD45.2	Source of cells and thymic lobes
Mice	CDTA Orléans, France	CD 3 epsilon Ko CD45.2	Grafting experiment