Timus Karakterizasyonu kullanma Fare Embriyo atalarıdır Settling<em&gt; In Vivo</em&gt; Ve<em&gt; In Vitro</em&gt; Tahliller

Özet

This article describes in vivo and in vitro methodology to characterize the thymic settling progenitors by the analysis of the kinetics of generation, phenotype and numbers of their T cell progeny.

Özet

Timik çökelme progenitörlerin karakterize lenfopeni hastada T hücresi değiştirilmesi için stratejiler geliştirmek için gerekli T hücresi gelişiminin önceden timik aşamaları anlamak önemlidir. Biz in vitro tamamlayıcı iki ile fare embriyonik gün 13 ve 18 Thymi gelen atalarıdır yerleşme timus okudu ve in vivo tekniklerin, hem "asılı damla" yöntemine dayalı. Bu yöntem, E13 ve / veya E18 onların soyu takip böylece CD45 alotipik belirteçler ve ayırt timik ataları ile ışınlanmış fetal timus lobları kolonize izin verdi. Nüfusu ile ya kolonizasyon olası rekabet seçici baskıları kaldırır ise karışık nüfusa sahip kolonizasyon atalarıdır biyolojik özelliklerinde hücre özerk farklılıkları analiz sağlar. kolonize timik lobları aynı zamanda t nüfus dinamikleri olarak in vivo olgun T hücre soyu analizi sağlayan bağışık yetmezliği erkek alıcı fareler, aşılı olabilirO bağışıklık sistemini ve farklı doku ve organlarda kolonizasyonu periferik. Fetal timik organ kültürleri E13 ataları içine tüm hızla gelişmiştir CD3 ⁺ hücreleri olgun ortaya ve dendritik epitel T hücreleri olarak bilinen kurallı γδ T hücre alt kümesi, doğurdu. Buna karşılık, E18 ataları gecikmiş farklılaşma ve dendritik epitel T hücrelerini oluşturmak için koyamadık. ^{/ - -} timus aşılı CD3 periferik kan izleme farelerin daha E18 timik çökelme ataları, zamanla, kısa vadeli fetal timus takdir edilemedi bir özellik onların E13 muadillerine göre daha olgun T hücrelerinin büyük sayılar üretmek olduğunu gösterdi organ kültürleri.

Giriş

T lenfositleri, αβ ya γδ T hücresi reseptörü (TcR) taşıyan, özel bir organ timus ayırt eder. tam gelişmiş timus iki ayrı bölgeye düzenlenmiştir: verimli TcR β ve α zincir genleri yeniden timositleri programlanmış ölüm (pozitif seleksiyon olarak bilinen bir süreç) kurtarıldı olan timik ataları geliştirmek korteks ve; ve öz-ligantlarına çok güçlü reaktivitesi olan timositleri seçilen medulla, (negatif seleksiyon) ^1,2 silinir. timus sonra mezenkimal hücreler ³ ile çevrilidir üçüncü faringeal kese endodermal tabakasının kaynaklanır. Bu tarihten sonra, sürekli işe normal T hücre gelişimi ⁴ için gerekli olan embriyonik gün E12 ve başlayan hematopoetik atalarıdır tarafından kolonize edildi. Timik göçmenler sıkıca düzenlenmiş bir program başlatılan ve mai tarafından orkestra, ardışık gelişim aşamalardan gelişmeye4 gibi bir ligandı ile etkileşimi üzerine timositler ile Çentik sinyal yolunun aktivasyonu, delta ile ntained, timik epitelial hücreler (Tecs) üzerinde eksprese ^5.

Timosit geliştirme sözde CD4 başlar ^- CD8 ^- çift negatif (DN) aşamaları. , DN2 (CD25 ⁺ CD44 ^+), DN3 (CD25 ⁺ CD44 ^-) ve DN4 (CD25 ^- CD44 ^{-) -} DN timositleri, daha DN1 (CD44 ⁺ CD25) içerisine CD25 ve CD44 ekspresyonu göre bölünebilir. CD24 (HSA) ve CD117 (c-Kit) daha DN1a b erken timik atalarıdır (ETP) karşılık 5 alt içine DN1 bölmesi subdivides. Timositleri DN aşamada TcR δ, β ve α zincirleri yeniden düzenlemek ve pre-TcR seçimi (DN3-DN4 aşamaları) tabi. TcR α zincir pozitif ve negatif sele öncesinde yeniden düzenler CD4 ⁺ CD8 ⁺ çift pozitif (DP) bölmeye Onlar daha geçişction. Bu aşamada en timositleri ortadan kalkar ve sadece küçük bir yüzdesi (% 3-5) CD4 ⁺ ulaşmak veya CD8 ⁺ T hücre bölmesini olgun.

lenfoid farklılaşma yolu multipotent atalarıdır (MPP) ve eritrosit ve megakaryosit ⁶ potansiyel kayıp lenfoid hazırlanmış multipotent atalarıdır (LMPP) oluşturmak HKH'lerin aşamalarında ilerler. , C-Kit (CD117) ekspresyonunu, Sca-1 ve Flt3 / flk2 (CD135) ve interlökin saptanamaz düzeylerde yokluğunda ^(- LMPP fenotipik (soy negatif Lin) farklılaşmış kan hücresi belirleyicilerinin olmaması ile tanımlanır IL) -7 zincir α reseptörü (IL-7rα veya CD127). LMPPs ayrıca bu aşamada tarafından miyeloid hücreleri üretmek için kapasite kaybetmiş ortak lenfoid atalarıdır (CLP) ⁷ ayırt. CLP lenfosit (B ve T hücresi), NK hücre, DC ve doğal lenfoid hücre (LAK) potansiyelini korumak ve CD1 ifadesi ile LMPP farklılık27 ve Sca-1, yüksek düzeyde olmaması.

Timik yerleşme atalarıdır (TSP) doğası yoğun ^8'e tartışılan olmasına rağmen, son zamanlarda belli oldu bu gelişme ⁹ boyunca TSP değişim fenotip, farklılaşma potansiyeli ve fonksiyon. Biz E13 (ilk dalga) ya da E18 (ikinci dalga) arasından sıralama FACS hücre tarafından izole TSP karakterize in vitro ve in vivo deneyler gerçekleştirildi. Eşit E13 ve E18 progenitörlerinin numaraları, farklı alotipik belirteçleri taşıyan tarafından kolonize benzer gelişimsel ortamda döl aşağıdaki izin ve atalarıdır her iki tip arasındaki farklı hücre içsel özellikleri, ortaya ışınlanmış timik loblar fetal timus organ kültürleri (FTOC). E13 veya E18 TSP biri tarafından kolonize timik lob nedeniyle her iki atalarıdır arasındaki rekabete seçim olmadan gelişmesini sağladı. Kolonize timik lobların in vivo nakli daha göstermiştir ki, aynı zamanda tO E13 olgun döl ve E18 TSP in vivo olarak farklı biyolojik özelliklere sahip. Ilk dalganın gelen TSPs hızlı bir şekilde T hücreleri oluşturmak ancak αβ ve γδ T hücrelerinin sayısının az neden olmaktadır. İkincisi arasında biz bir değişmez TcR'ler, onlar yara iyileşmesinde bir işlev uygulamayın ve sadece embriyonik gelişim sırasında ¹⁰ üretilen epidermis göç var Vγ5Vδ1 dendritik epitel T hücrelerini (DETC), algıladı. Buna karşılık, TSP ikinci dalga gelen TcR ⁺ T hücrelerinin yüksek sayıda üretmek için uzun zaman alabilir ve DETC üretmek mümkün değildir.

Protokol

Etik deyimi: Bütün deneyler Fransız Tarım Bakanlığı tarafından onaylanmış Pasteur Enstitüsü Etik Şartı göre gerçekleştirilen ve AB direktiflerine bulundu. Fransa Tarım Bakanlığı tarafından onaylı küçük kemirgen cerrahisi eğitimi olan bir manipülatör, tüm cerrahi müdahaleler yapar.
NOT: 5 aşamalı planı prosedürünü gösteren Ek Tablo 1'de bakın.

Embriyolar 1. Seçim

1. 36 C57BL / 6 CD45.2 kadın, 12 kadın CD45.1, 12 C57BL / 6 CD45.1 erkek ve 12 C57BL / 6 CD45.2 erkekler kullanın. Erkek genotip ile ya kadın Geçiş embriyolar CD45.1 / 2 ve CD45.1 alıcı timik lobların bir kaynak olarak kullanılabilir veya TSP CD45.2 bir kaynak olarak kullanılabilir üretecektir. Ev tek bütün erkekler.
2. , E18 TSP izolasyonu için embriyolar elde 21 gün aşılama deneyden önce 06:00, az bir erkek CD45.1 ile bir kafes içinde 2 kadın yerleştirmek için. Öğleden önce, ertesi gün bir vajinal fiş varlığını kontrol edin. Sepatakılı kadın oranı.
3. E14 embriyolar elde etmek için TSP tarafından kolonize edilmesi, 17 gün aşılama deneyden önce erkek CD45.2 kullanarak, (1.2) Yukarıdaki işlemi tekrarlayın.
4. E13 TSP izole etmek için embriyolar elde etmek için, 16 gün aşılama deneyden önce, erkek C57BL / 6 CD45.1 kullanarak, (1.2) Yukarıdaki işlemi tekrarlayın.

Bir yatay Laminar Flow Hood altında Embriyolar 2. diseksiyonu

NOT: aşılama deneyden önce iki gün.

1. Bir doyurarak kapalı bir odada, en az 5 dakika boyunca, servikal dislokasyon ile veya _CO2 gazı aşamalı uygulama hamile kadın Kurban. Kardiyo-solunum hareketlerinin kesin tutuklama ile ölüm sağlayın. % 70 etanol ile karın ıslak.
2. Orta hat karın derisinde uzunlamasına bir kesi yapmak ve birbirinden cilt çekerek açın. Sindirim sistemi dokunmadan forseps ve makas ile periton açın. Bifid uter çekinBizim makas ile vajinadan ayırmak ve.
3. 40-50 ml DPBS içeren 90 x 15 mm Petri kabındaki rahim yerleştirin ve her embriyonun desidua arasında enine kesti.
4. Ince uçlu makas çifti ve ince forseps ile rahim kas membran kaldırmak plasenta ve yolk kesesi arasındaki kesim tarafından embriyoların almak ve embriyoların istinat olduğu amnios kaldırmak.
5. Petri kabı embriyolar yerleştirin HBSS +% 1 fetal buzağı serumu içeren 90 x 15 mm (FCS) üretildi. E15 daha embriyolar yaşlı için, başka diseksiyonu önce bir makas ile kafaları çıkarın.

Thymus 3. İzolasyonu

1. Binoküler büyütücü mercek altında, ıslak bir gazlı yatak üzerinde, yatar pozisyonda (ventral görünüm) yatan, embriyo yerleştirin.
2. Uzunlamasına sternum kıkırdak boyunca bir forseps yerleştirin çimdik ve göğüs ızgara açın. Kavisli bir forseps ile t görselleştirmek için bir kenara göğüs duvarı çekintrakea her iki tarafında hymic loblar.
3. Dikkatle ince bir forseps ile altında sıkıştırılarak her lob tutun ve 1 ml HBSS +% 1 FCS içeren bir Petri kabındaki koyun. Lobları yalıtmak ve kapsül zarar vermeden, iki 1 ml şırınga + 26 G ⅜ "iğneler ile çevresindeki bağ dokusu çıkarın.
4. Kan hücrelerinin ortadan kaldırmak için HBSS +% 1 FCS, 3 ml loblar yıkayın.
   Not: E15 önce, timik loblar iki-lob organı teşkil etmek ortasında trakea ve daha sonra sigorta her iki tarafında yer almaktadır.

4. Hücre süspansiyonları

1. HBSS +% 1 FCS 1 ml şırınga üzerine monte edilen iki 26 G iğne ile, binoküler büyütücü mercek altında lobları ayrı kızdırmak. Bir naylon örgü ile hücre süspansiyonu Filtre.

Floresan Antikor ve Hücre Sorting 5. Boyama

NOT: Tüm antikorlar daha önce nüfus optimal tanımı (titrat elde etmek için titre ediliriyon) antikor, parti ile değişebilir.

1. Soy pozitif hücreleri boyamak için biyotinile edilmiş antikorların bir karışımı içinde bir 100 ul ile 4 ° C sıcaklıkta, 15-30 dakika boyunca timositleri (E13 ya da E18) inkübe (anti-CD19, anti-Gr1 anti-Ter119 anti-NK1.1 , anti-CD11c, anti-CD3, anti-CD4, anti-CD8, anti-CD25).
2. Antikorlar 7 dakika boyunca 280 xg'de 4 ml HBSS +% 1 FCS tüpler aşağı spin uzakta fazlalığının yıkamak için, süpernatant ortadan kaldırmak ve yeniden askıya taze HBSS +% 1 FCS pelet. Santrifüj tekrarlayın.
3. 4 ° C'de 15 dakika boyunca streptavidin ile mikro E18 biyotin-etiketli hücreler inkübe ve iki kez HBSS% 1 FCS hücreleri yıkayın. 2 ml HBSS +% 1 FCS hücreleri yeniden askıya. En E13 timositleri soy negatif ve bu nedenle hücre sıralama öncesinde MACS zenginleştirme gerekmez.
4. Üreticinin talimatlarına göre, LS sütun üzerinde hücrelere geçerler. Tüm hücre süspansiyonu girdiğinde sütun 2 ml HBSS +% 1 FCS ekleyin. KurtarmakSütun 4 ml 280 x g'de, 7 dakika boyunca hücreler akmasına ve santrifüjlenir.
5. Yeniden askıya tükenmiş E18 ya TSP antikor karışımı, 50 ul (anti-CD117 APC, anti-CD135 PE, anti-CD127 PECy7, anti-CD24 FITC, anti-CD44 APCCy7 ve streptavidin Pacific Blue toplam E13 timositlerin ya pelet ) ve karanlıkta 4 ° C'de 20 dakika inkübe edilir.
6. 4 ml HBSS +% 1 FCS ve hücreleri yıkayın 1 ml HBSS propidium iyodür ile +% 1 FCS hücreleri yeniden askıya.
7. Sıralama TSPs Lin ^- 200 ul komple ortam +% 20 FCS içeren bir 1.5 ml tüpler üzerine (4 lazerler ile) FACS CD44 ⁺ CD117 ⁺ CD24 ^düşük CD127 ⁺ CD135 ⁺ hücreler. FSC ve SSC kanallarda boyutu ve ayrıntı gibi kapı İlk hücre. (Propidyum iyodür ile boyama), ölü hücreleri, kapı dışarı çiftleri ortadan kaldırmak ve üstel ölçeklerde floresan puan. 100 civarında veya 600 TSPs bir E13 ya da bir E18 timus, respectiv elde edilebilirely.

Progenitörlerin 6. Kolonizasyon E14 ve Timik lobları: Asma Bırak Tekniği

1. (30 Griler = 30 Gy) CD45.2 embriyolardan E14 timik lobları, kültür önce 3 saat ışın tedavisi.
   NOT: E14 veya E15 timik loblar başarılı bir şekilde, T hücresi soylarının alıcı olarak kullanılmıştır. Erken gebelik günlerde timik lob kötü geliştirmek ise muhtemelen epitel hücrelerinin eksik gelişimine nedeniyle organın büyük boyutuna erken nekroz sonraki gebelik günler sonuçlarının alıcı timus lobları kullanma.
2. Santrifüj TSPs ve yeniden askıya hücreleri kültür ortamında (% 10 FCS ile OPTI-MEM tam ortam, penisilin (50 birim / ml), streptomisin (50 ug / ml) ve 2β-merkaptoetanol (50 uM)) kriteri şekilde 35 ul 500 TSP içerir.
3. 60 de Terasaki plakanın her sıra hücre süspansiyonu, 35 ul damla yerleştirin.
   NOT: bitişik kuyular yerleştirilir eğer 35 ul damla sigorta olabilir.
4. Her damla yüzeyinde biri ışınlanmış lobunu yerleştirin. Terasaki plakasını kapatın ve hücreler yerçekimiyle damla apikal kutbu ulaşmak izin ters plaka çevirin.
5. Hit yavaşça ters plakanın üst tarafı damla apikal kenarına slayt lobları zorlamak için. 37 ° C ila +% 5 _CO2 seviyesinde 48 saat boyunca nemlendirilmiş bir kuluçka makinesi içinde ters Terasaki tabağı inkübe edin. Bir alıcı yetişkin fare ⁸ böbrek kapsülü altında kolonizasyon ya kültür E14 FTOC ⁷ Thymi veya greft sonra.

7. Fetal Timik Organ Kültürü

1. 35 mm Petri tabağına tam ortam 3 ml yerleştirin. Ortam üzerinde yüzen bir isopore zar filtresi yerleştirin. Forseps (bir membran üzerinde en fazla 8 lob) zarın kenarında yeniden loblar yerleştirin.
2. Su sağlama 2. ml içeren, kapaksız, bir 35 mm çanak ile birlikte, bir 90 mm Petri kabı içinde timik lobu içeren Petri kapları yerleştirinr, uygun nem sağlamak. 37 ° C ila +% 5 _CO2 seviyesinde 12 gün inkübe edilir.

Steril Koşullarda Böbrek Kapsül altında 8. Greftler

Not: Böbrek parenşiması bir kapsül oluşturan bağ dokusu ile çevrilidir. Alt kapsül bölge kan ve böylece greft gelişmesi için uygun bir ortam (örneğin timik lobları, pankreas adacıkları veya yenidoğan kalpleri) sağlayan lenfatik damarlarda özellikle zengindir. Doğru böbrek daha erişilebilir olduğundan greftler genellikle sol böbrek yapılır. CD3 ^{- / -} erkek fareler E15 önce cinsiyet belirleme kolaylıkla yapılabilir çünkü alıcılar böylece nedeniyle Y kromozomu bağlantılı küçük doku uygunluk antijenleri konakçı tepkimesiyle kaçınarak olarak kullanılmıştır.

1. Aletleri sterilize ve ameliyat boyunca steril eldiven giyin. Ketamin 10 mg / ml + Ksilazin, 1 mg içeren bir çözeltiye içi enjeksiyonu ile fare anestezisi /ml PBS içinde seyreltilmiş (10 g vücut ağırlığı başına 50-100 ul), bir 1 ml şırınga ile. Interdijital reflekslerin eksikliğini kontrol ederek anestezi doğrulayın. Anestezi sırasında kurumasını önlemek için her gözün üzerine hidro-Optimune jel damla yerleştirin.
   NOT: Çözelti ekstemporane şekilde hazırlanır ve enjeksiyondan önce oda sıcaklığında ısıtılmalıdır. Anestezi en az 20 dakika sürer. Anestezi derecesi, tüm ameliyat boyunca kontrol edilmelidir. Anestezi, her 20 dakikada bir doz devre içi enjeksiyonu ile uzatılabilir.
2. Yatay lamina akış kaputu altında, onun sağ tarafta fare yerleştirin. % 70 etanol ve% 10 iyodid dermal çözeltisi ile cerrahi alanında sterilize edin. Bir forseps kısmı ile sadece arka bacak eklem üzerinde 2 cm uzunluğu boyunca fare saç. Cerrahi alan tıraş.
3. Bir neşter ile, makas kas dokusu kesim daha sonra, ilk olarak, cilt dokusuna bir insizyon 1.5 cm uzunluğunda tercih. Kesi her iki taraf için hafif bir basınç uygulayın, Karın boşluğu dışında böbrek zorlar hangi.
4. Nemli böbreği korumak için pamuk tomurcuğu ile tuzlu su uygulayın. Eğer organa açığa zorluklar varsa, böbrek bağlı olduğu çevredeki adiposit doku çekerek düz forseps kullanabilir. Organın altına yerleştirilen bir pamuklu çubukla ile retroperitoneal boşluğundan dışarı böbrek koruyun.
5. İki ince forseps ile, (kanamayı önlemek için parankimi dokunmaktan kaçının) kapsül içinde 2-3 mm'lik bir delik yapmak. Bütün cerrahi işlem sırasında sürekli olarak nemli maruz böbrek kapsülü tutun.
6. Açılan kapsülün duvarı koruyarak, böbrek kapsülü altında dikkatlice lobları yerleştirin ve kenar kutup doğru kapsülün altında greft kaydırın. Böbrek başına 6 lobları kadar yerleştirin.
7. Retro periton boşluğuna böbrek değiştirin. Kas aponörozlar, bireysel cerrah knot daha sonra deriyi dikin. % 10 iyodür povidon solüsyonu ile yarayı ıslatın. Isıtmalı pa üzerinde fare yerleştirin37 ° C 'de, d.
8. Kalp, solunum ve bıyık hareketler, kendi tarafından görülen toplam kurtarma hareketleri içeriyordu kadar mukozal renklerin kontrolü ile anesteziden tam iyileşme kadar nakledilen fare Anketi.
   NOT: Biz sadece cerrahi sonrası analjezik solüsyonu (Buprenorphin, 0.1 mg / kg) içi kas enjeksiyonu tavsiye ve 2 gün ameliyat sonrası ağrıyı önlemek için ameliyat takip.
9. Tamamen iyileşene kadar tecrit işletilen hayvan tutun. Doğrulamak ve enfeksiyonu önlemek için her geçen gün yara dikiş kontrol edin. Bu prosedür takip yara enfeksiyonu gözlendi asla.
   NOT: CD3, periferal kan hücrelerinin haftalık analizi ^{- / -} aşılanmış farenin bize toplumlarında CD45 allotipik işaretleyici ve T hücre soyu spesifik antikorlar (Şekil 3) kullanılarak E13 ya da E18 progenitörlerinin ya kaynaklanan timus algılamasını sağlar.

Akış Sitometrisi ile TSP döl 9. Analizi

1. tek hücre süspansiyonları (protokol Bölüm 4'e bakınız) elde etmek için tek tek FTOCs Tease.
2. Bir antikor karışımı CD45.1 PECy7, CD45.2 AmCyan CD4 APCCy7 CD8 APC, CD3 Pacific Blue, Vγ5 FITC, PE Vδ1 tanıyan antikorları içeren ve bölüm 5'de tarif edildiği gibi inkübe bireysel loblar Leke hücre süspansiyonları.
3. HBSS +% 1 FCS + propidyum iyodür hücreleri yeniden askıya alma ve (Şekil 2'de B deki sonuçlara bakınız), bir akış sitometresiyle analiz.

Sonuçlar

Kolonize atalarıdır iyi gelişmesini sağlayan endojen timositlerin timus lobları tüketmek için bir yöntem seçmek için, biz ışınlama sonrası kolonize timik loblarda T hücre sulandırma seviyelerini veya 5 günlük deoksi-guanozin (d-Gua) tedavisi karşılaştırıldı. Sonuçlar kültür 9. günde fark varken, ışınlanmış loblar Böylece 12. gün ile ışınlama sonra T hücresi gelişimini elde etmek üzere D-Gua tedaviden daha uygun olduğunu, d-Gua ile tedavi edilenlerden daha fazla T hücrelerini i?...

Tartışmalar

İki temel deneyler T hücre farklılaşmasını ex vivo olarak analiz etmek için kullanılabilir. En son bildirilen 1 veya 4 ¹² gibi Noth1 ligandlar, delta ifade BM stromal hücreler, OP9 ile hematopoetik atalarıdır ko-kültür. Bu 2 D tahlili de analiz sağlayan, son derece verimli ve hassas gerçekleştirmek kolay Tek hücreli seviyesi. Ancak, ne timik epitel ile doğrudan etkileşimleri gerektiren her ikisi de DP aşamasında ne γδ DETC ¹³ nesil ötesinde T hücre gelişimini dest...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
90 x 15 mm and 35 x 15 mm plastic tissue culture petri dishes.	TPP	T93100/T9340	Sampling
26GA 3/8 IN 0.45x10mm syringes with needles Beckton-Dickinson Plastipak.	BD Plastipak	300015	Cell suspension
Nylon mesh bolting cloth sterilized 50/50 mm pieces.	SEFAR NITEX	03-100/32	Filtration of cells
Ethanol 70%.	VWR	83801.36	Sterility Actions
Iodide Povidone 10% (Betadine)	MEDA Pharma	314997.8	Sterility Actions
Ketamine 100mg/ml (stock solution)	MERIAL	-	Anesthesic
Xylazine 100mg/ml in PBS (stock solution)	Sigma	X1251-1G	Anesthesic and muscle relaxant
Buprenorphin 0.3mg/ml stock solution	AXIENCE	-	Morphinic analgesic
Ophtalmic gel (0.2% cyclosporin)	Schering-Plough Animal Health	-	Eyes protection
DPBS (+ CaCl2, MgCl2)	GIBCO Life Technology	14040-174	to isolate embryos
HBSS Hanks' Balanced Salt Solution (+ CaCl2, MgCl2)	GIBCO Life Technology	24020-091	to wash out the blood and dissect the embryos
OPTI-MEM I GlutaMAX I	GIBCO Life Technology	51985-026	Medium for cultures
Fœtal Calf serum	EUROBIO	CVFSVF00-0U	additive for cultures
Penicilin and Streptomycin	GIBCO Life Technology	15640-055	Antibiotics for cultures
2 b mercapto ethanol	GIBCO Life Technology	31350010	additive for cultures
LEICA MZ6 Dissection microscope	LEICA	MZ6 10445111	Occular W-Pl10x/23
Cold lamp source	SCHOTT VWR	KL1500 compact	Two goose neck fibers adapted
Silicone elastomer	World Precision Instruments	SYLG184	Dissecting Pad
Spoon, round and perforated	Fine Science Tools	10370-18	Dissection tools
Fine Iris Scissors	Fine Science Tools	14090-09	Dissection tools
Vannas spring Scissors	Fine Science Tools	15018-10	Dissection tools
Forceps : Dumont #5/45 Inox 11 cm	F.S.T.	11253-25	Dissection tools
Two pairs of fine straight watchmakers’ forceps Dumont #5 11 cm fine tips.	Fine Science Tools	11295-20	Dissection tools
Polyamid thread with needle 6-0   C-3 3/8c	ETHICON	F2403	for sutures
Needle-holder	MORIA/F.S.T.	12060-02	for sutures
Heating pad	VWR	100229-100	To maintain mouse temperature during anesthesy
Membrane Isopore RTTPO2500	DUTSCHER	44210	For FTOC
Terasaki 60 wells plates	FISHER	1x270 10318801	For hanging drop technique
Gauze swabs steriles 7.5cmx7.5cm	Hydrex	11522	To apply disinfecting solution
Fluorescence or biotin labelled antibodies	BD Biosciences, Biolegend or e-Biocsiences	Clone Number see table below	Staining cells
MACS Columns/Streptavidin Microbeads	Miltenyi Biotec	130-042-401/130-048-101	Cell depletion
Mice	Charles Rivers Laboratories (CD45.1) and Janvier Labs  (CD45.2)	C57BL/6 CD45.1 OR CD45.2	Source of cells and thymic lobes
Mice	CDTA Orléans, France	CD 3 epsilon Ko CD45.2	Grafting experiment