Caracterização de Thymic Settling Progenitores no embrião do rato Usando<em&gt; In Vivo</em&gt; E<em&gt; In Vitro</em&gt; Os ensaios

Resumo

This article describes in vivo and in vitro methodology to characterize the thymic settling progenitors by the analysis of the kinetics of generation, phenotype and numbers of their T cell progeny.

Resumo

Caracterização do timo resolver progenitores é importante compreender as fases de pré-timo de desenvolvimento de células T, essencial para elaborar estratégias de substituição de células T nos pacientes linfopênicos. Foram estudados timo decantação progenitores de murídeo dia embrionário 13 e 18 por dois timos complementar in vitro e in vivo técnicas, ambos com base no método "gota em suspensão". Este método permitiu colonizar lobos do timo fetal irradiados com E13 e / ou E18 progenitores timo distinguidos por CD45 marcadores alotípicos e, portanto, após a sua progênie. A colonização com populações mistas permitem analisar as diferenças celulares autônomos em propriedades biológicas dos progenitores enquanto colonização tanto com população remove possíveis pressões seletivas competitivos. Os lobos do timo colonizados também podem ser enxertados em ratos imunodeficientes beneficiários do sexo masculino que permitam a análise da progênie de células T maduras in vivo, tais como a dinâmica populacional de tele periféricos do sistema imunitário e colonização de diferentes tecidos e órgãos. Culturas de órgãos timo fetal revelou que progenitores E13 desenvolveu-se rapidamente a toda a amadurecer células CD3 ⁺ e deu origem ao subconjunto de células T γδ canônica, conhecidas como células T epiteliais dendríticas. Em comparação, os progenitores E18 tiver uma diferenciação retardada e não foram capazes de gerar células epiteliais dendríticas T. A monitorização do sangue periférico de enxertados do timo CD3 ^{- / -} ratos mostraram também que progenitoras E18 tímico sedimentação gerar, com o tempo, um maior número de células T maduras do que as suas contrapartes E13, uma característica que não pode ser apreciado no timo fetal de curto prazo culturas de órgãos.

Introdução

Linfócitos T, tendo o αβ ou o receptor de células T γδ (TCR), em diferenciar um órgão especializado, o timo. O timo totalmente desenvolvido está organizado em duas regiões distintas: o córtex, onde progenitores timo desenvolver e onde timócitos que produtivamente reorganizar a β TcR e genes da cadeia α são resgatados da morte programada (um processo conhecido como seleção positiva); e da medula, onde selecionado timócitos com demasiado forte reatividade a auto-ligantes são excluídos (seleção negativa) ^1,2. O timo tem origem a partir da camada endodérmica do terceiro bolsa faríngea posterior que está rodeado por células mesenquimais ^3. Ele é colonizada por células progenitoras hematopoiéticas a partir de dia embrionário E12 e, depois disso, o recrutamento contínua é necessária para o desenvolvimento das células T normais ^4. Imigrantes timo evoluir através de sucessivos estágios de desenvolvimento, orquestrada por um programa bem regulamentado, iniciado e maintained pela activação da via de sinalização de Notch em timócitos após interacção com o seu ligando, como Delta 4, expressa em células epiteliais tímicas (TEC) ^5.

Desenvolvimento de timócitos começa no chamado CD4 ^- CD8 ^- (DN) estágios dupla negativos. Timócitos DN pode ser subdividida de acordo com a expressão de CD25 e CD44 em DN1 (CD25 ^- CD44 ^+), DN2 (CD25 ⁺ CD44 ^+), DN3 (CD25 ⁺ CD44 ^-) e DN4 (CD25 ^- CD44 ^-). CD24 (HSA) e CD117 (c-Kit) subdivide ainda mais o compartimento DN1 em cinco subconjuntos onde DN1a e b correspondem aos progenitores timo primeiros (PTE). Timócitos reorganizar as δ, β e α cadeias de TCR na fase DN e passam por pré-seleção TcR (estágios DN3-DN4). Eles ainda mais trânsito para o compartimento duplo positivo (DP) CD4 ⁺ CD8 ^+, onde a cadeia α TcR reorganiza antes da sele positivo e negativoction. Nesta fase, a maioria dos timócitos são eliminadas e apenas uma pequena percentagem (3-5%) chegar ao CD4 ⁺ ou CD8 ⁺ T maduras compartimento da célula.

A via de diferenciação linfóide progride através dos estágios de HSCs que geram progenitores multipotentes (MPP) e progenitores multipotentes ferrado-linfóides (LMPP) que perderam o eritrócitos e megakaryocyte potencial ^6. LMPP são fenotipicamente definida pela ausência de marcadores celulares no sangue diferenciadas (linhagem negativa, Lin ^-), a expressão de c-Kit (CD117), Sca-1 e Flt3 / Flk2 (CD135) e a ausência de níveis detectáveis ​​de interleucina ( IL) -7 receptor α cadeia (IL-7rα ou CD127). LMPPs diferenciar ainda mais em progenitores comuns linfóides (CLP) ⁷ que por essa fase perderam a capacidade de gerar células mielóides. CLP reter de linfócitos (células T e B), células NK, células linfóide e DC inata (ILC) potencial, e diferem de LMPP pela expressão de CD127 e a ausência de níveis elevados de Sca-1.

Embora a natureza dos timo resolver progenitores (PTS) tem sido amplamente debatido ^8, tornou-se recentemente claro que a mudança TSP fenótipo, potencial e função de diferenciação, ao longo do desenvolvimento ^9. Foram realizadas in vitro e in vivo em ensaios para caracterizar o TSP, isolado por separação de células a partir de FACS ou E13 (primeira onda) ou E18 (segundo grupo). Fetais culturas de órgãos timo (FTOC) com lobos do timo irradiados colonizados por um número igual de E13 e E18 progenitores, tendo diferentes marcadores alotípicos, autorizada após sua progênie em um ambiente de desenvolvimento semelhantes e revelou propriedades intrínsecas celulares, diferentes entre ambos os tipos de células progenitoras. Lobos do timo colonizados por qualquer E13 ou E18 TSP permitiu o desenvolvimento sem seleção devido à concorrência entre ambos os progenitores. In vivo transplante dos lobos do timo colonizados revelou ainda que também tele progênie madura de E13 e E18 TSP têm diferentes propriedades biológicas in vivo. TSPs da primeira onda gerar rapidamente as células T, mas dar origem a baixos números de células T γδ e αβ. Entre estes últimos foram detectados Vγ5Vδ1 células epiteliais dendríticas T (DETC), que têm um TcR invariante, migrar para a epiderme onde exercem uma função na cicatrização de feridas e só são produzidos durante o desenvolvimento embrionário ^10. Em contraste, TSP a partir da segunda onda demorar mais tempo para gerar números elevados de células T ⁺ TcR e são incapazes de gerar DETC.

Protocolo

Declaração de ética: todos os experimentos foram realizados de acordo com a Carta Ética Instituto Pasteur, aprovado pelo Ministério da Agricultura francês, e com as orientações da UE. Um manipulador com formação em cirurgia pequeno roedor, certificado pelo Ministério da Agricultura francês, executa todas as intervenções cirúrgicas.
NOTA: Ver em anexo Quadro 1 mostra o procedimento plano de 5 passos.

1. Selecção dos embriões

1. Use 36 fêmeas C57BL / 6 CD45.2, 12 fêmeas CD45.1, 12 C57BL / 6 do sexo masculino e 12 CD45.1 C57BL / 6 machos CD45.2. Cruzando os fêmeas com qualquer genótipo masculino irá produzir embriões CD45.1 / 2 e CD45.1 usado como uma fonte de TSP CD45.2 ou usado como uma fonte de receptores lóbulos do timo. Casa todos os machos individualmente.
2. Para obter embriões para E18 TSP isolamento, coloque 2 fêmeas em uma gaiola com um macho CD45.1 às 6 da tarde, 21 dias antes do experimento enxertia. Verifique a presença de um tampão vaginal no dia seguinte, antes do meio-dia. Sepaavaliar as fêmeas conectados.
3. Para obter embriões E14 a ser colonizada por TSP, repita o procedimento acima (1.2), utilizando machos CD45.2, 17 dias antes do experimento enxertia.
4. Para obter embriões para isolar E13 TSP, repita o procedimento acima (1.2), utilizando machos C57BL / 6 CD45.1, 16 dias antes do experimento enxertia.

2. Dissecção da Embriões Sob um Horizontal capela de fluxo laminar

NOTA: Dois dias antes do experimento enxertia.

1. Sacrificar as fêmeas prenhes por deslocamento cervical ou por administração progressiva de gás _CO2 durante pelo menos 5 minutos, numa câmara fechada saturação. Certifique-se de morte por prisão definitiva dos movimentos cardio-respiratória. Molhar o abdômen com etanol 70%.
2. Adicione uma incisão longitudinal na pele na linha média do abdómen e abri-lo por puxar a pele separados. Abra o peritoneu com fórceps e tesouras, sem tocar no tracto digestivo. Puxe o uter bífidanos e separá-lo da vagina com a tesoura.
3. Inserir o útero num prato de 90 x 15 mm de Petri contendo 40-50 ml de DPBS e cortar transversalmente entre decídua de cada embrião.
4. Com a tesoura de ponta fina e uma pinça fina remover a membrana muscular do útero, tirar os embriões cortando entre a placenta eo saco vitelino, e remover os amnios, que está retendo os embriões.
5. Colocar os embriões numa placa de Petri de 90 x 15 mm contendo HBSS + 1% de soro fetal de vitelo (FCS). Para os embriões mais velhos do que E15, retire as cabeças com um par de tesouras antes de qualquer outra dissecação.

3. Isolamento do timo

1. Sob a lupa binocular, coloque o embrião, deitado em decúbito dorsal (vista ventral), em uma cama gaze molhada.
2. Insira um fórceps longitudinalmente ao longo da cartilagem do esterno, beliscar e abrir a grade torácica. Com uma pinça curva, puxe a parede torácica de lado para visualizar o thymic lóbulos de cada lado da traqueia.
3. Segure cuidadosamente cada lobo por beliscar por baixo com uma pinça fina e colocá-los em uma placa de Petri contendo 1 ml de HBSS + FCS a 1%. Isolar os lobos e remover o tecido conjuntivo adjacente com duas seringas de 1 ml + 26 G ⅜ "agulhas, sem danificar a cápsula.
4. Lavar os lóbulos em 3 mL de HBSS + FCS a 1% para eliminar as células do sangue.
   NOTA: Antes E15, lóbulos tímicos estão localizados em cada lado da traqueia e depois fusível no meio para constituir um órgão de bi-lobar.

4. As suspensões celulares

1. Separar os lóbulos sob a lupa binocular, com duas agulhas 26 G montados em seringas de 1 ml, em HBSS + FCS a 1%. Filtra-se a suspensão de células através de uma malha de nylon.

5. Coloração com anticorpos fluorescentes e Seleção celular

NOTA: Todos os anticorpos são previamente titulado para obter definição óptima das populações (o titratde iões pode variar de acordo com o lote de anticorpo).

1. Incubar os timócitos (E13 ou E18) durante 15-30 min a 4 ° C com 100 uL de um cocktail de anticorpos biotinilados para corar as células de linhagem positivos (anti-CD19, anti-Gr1, anti-Ter119, anti-NK1.1 , anti-CD11c, anti-CD3, anti-CD4, anti-CD8, anti-CD25).
2. Para lavar o excesso de anticorpos girar os tubos com 4 mL de HBSS + FCS a 1% a 280 xg durante 7 minutos, para eliminar o sobrenadante e re-suspensão da pelota em HBSS + FCS a 1%. Voltar a centrifugar.
3. Incubar as células marcadas com biotina E18 com microesferas de estreptavidina durante 15 min a 4 ° C e lavar as células duas vezes em HBSS 1% de FCS. Re-suspender as células em 2 ml de HBSS + FCS a 1%. A maioria dos timócitos E13 são linhagem negativa e, portanto, não precisa de MACS enriquecimento antes da separação de células.
4. Passar as células na coluna LS, de acordo com as instruções do fabricante. Quando toda a suspensão de células entrou na coluna de adicionar 2 mL de HBSS + FCS a 1%. Recuperar o4 ml da coluna de fluxo, através de centrifugação e as células durante 7 minutos a 280 x g.
5. Re-suspender o grânulo de qualquer das empobrecido E18 ou E13 total de timócitos em 50 ul da mistura de TSP anticorpo (anti-CD117 APC, anti-CD135 PE, anti-CD127 PECy7, anti-CD24 FITC, anti-CD44 e estreptavidina APCCy7 Pacific Blue ) e incubar durante 20 min a 4 ° C no escuro.
6. Lavam-se as células com 4 mL de HBSS + FCS a 1% e re-suspender as células em 1 mL de HBSS + FCS a 1% com iodeto de propídio.
7. Ordenar a TSPs Lin ^- CD135 ⁺ células CD44 ⁺ CD117 ⁺ CD24 ⁺ CD127 ^baixo em um FACS (com 4 lasers) sobre uma tubos de 1,5 ml contendo 200 ul de meio completo + 20% FCS. Portão primeiro as células de acordo com seu tamanho e granulosidade na FSC e canais ES. Eliminar as células mortas (coloração com iodeto de propídio), porta para fora parelhas e marcar a fluorescência em escalas exponenciais. Cerca de 100 ou 600 TSPs pode ser obtido a partir de um E13 ou E18 um timo, respectivEly.

6. A colonização da E14 Thymic Lobes com Progenitores: Suspensão técnica da gota

1. Irradiar (30 Grays = 30 Gy) E14 lóbulos timo a partir de embriões CD45.2, 3 horas antes da cultura.
   NOTA: E14 ou E15 lóbulos do timo foram usados ​​com sucesso como receptor de progenitores de células T. Usando receptores de lobos do timo posteriores dias de gestação resulta em necrose prematura devido ao tamanho maior do órgão enquanto lobos do timo nos dias gestacionais mais precoces desenvolver mal, provavelmente devido ao desenvolvimento incompleto das células epiteliais.
2. Centrifugar classificados TSP e suspender novamente as células em meio de cultura (meio OPTI-MEM meio completo com 10% de FCS, penicilina (50 unidades / ml), estreptomicina (50 ug / ml) e 2β-mercaptoetanol (50 pM)) de tal modo que 35 ul conter 500 TSP.
3. Colocar uma gota de 35 ul de suspensão de células a cada poço de uma outra placa de 60 bem Terasaki.
   NOTA: 35 gotas ul podem fundir-se se eles são colocados em poços contíguos.
4. Inserir um lóbulo irradiado sobre a superfície de cada gota. Feche a placa Terasaki e vire a placa de cabeça para baixo para deixar as células atingem o pólo apical da queda por gravidade.
5. Bater suavemente na parte lateral superior da placa invertida para forçar os lóbulos para deslizar para a extremidade apical da gota. Incubar a placa Terasaki invertida numa incubadora humidificada, durante 48 horas a 37 ° C + 5% de CO _2. Após a colonização, ou cultura E14 thymi em FTOC ^7, ou enxerto sob a cápsula renal de um rato adulto destinatário ^8.

7. Fetal Thymic Órgão Cultura

1. Colocar 3 ml de meio completo numa placa de Petri de 35 mm. Inserir um filtro de membrana isopore flutuante no meio. Colocar os lóbulos reconstituídos na extremidade da membrana com uma pinça (não mais do que oito lóbulos sobre uma membrana).
2. Colocar as placas de Petri contendo os lóbulos do timo dentro de um prato de 90 milímetros de Petri, em conjunto com um prato de 35 mm, sem tampa, contendo 2 ml de water, para assegurar a humidade óptima. Incubar 12 dias a 37 ° C + 5% de CO _2.

8. Os enxertos sob a cápsula renal em condições estéreis

NOTA: O parênquima renal está rodeado por um tecido conjuntivo que forma uma cápsula. A região sub-capsular é particularmente rica em vasos sanguíneos e linfáticos, proporcionando assim um ambiente adequado para o desenvolvimento de enxertos (por exemplo, lobos do timo, ilhotas pancreáticas ou corações recém-nascidos). Enxertos se realiza no rim esquerdo, porque é mais acessível do que o rim direito. CD3 ^{- / -} camundongos machos foram usados ​​como destinatários evitando assim enxerto contra reacção do hospedeiro devido a antígenos de histocompatibilidade menores ligados ao cromossomo Y, porque a determinação do sexo antes de E15 não é feito facilmente.

1. Esterilizar os instrumentos e usa luvas esterilizadas ao longo da cirurgia. Anestesiar o rato por injecção intra-peritoneal de uma solução de cetamina 10 mg / ml + xilazina 1 mg /ml diluído em PBS: (50 a 100 mL por 10 g de peso corporal), utilizando uma seringa de 1 ml. Verifique anestesia, verificando falta de reflexos interdigitais. Coloque uma gota de gel hidro-Optimune em cada olho para prevenir o ressecamento durante a anestesia.
   NOTA: A solução deve ser preparada extemporaneamente e aquecida à temperatura ambiente antes da injecção. A anestesia dura pelo menos 20 min. O grau de anestesia deve ser controlada ao longo de toda a cirurgia. A anestesia pode ser prolongada por injecção intra-peritoneal de metade da dose a cada 20 min.
2. Posicione o mouse sobre o seu lado direito, em uma capela de fluxo lâmina horizontal. Esteriliza-se o campo cirúrgico com etanol a 70% e 10% de solução de iodeto de dérmica. Com uma peça pinça o cabelo do rato ao longo de um comprimento de apenas dois centímetros acima da articulação da perna traseira. Raspar a área cirúrgica.
3. Com um bisturi, fazer uma incisão de 1,5 centímetros de comprimento em primeiro lugar, o tecido cutâneo, em seguida, com uma tesoura cortar o tecido muscular. Aplicar uma ligeira pressão a ambos os lados da incisão, O que forçará o rim para fora da cavidade abdominal.
4. Aplicar soro fisiológico com um algodão-broto para manter o rim úmido. Se você tiver dificuldades em expor o órgão, use uma pinça planos para retirar o tecido circundante para adipócitos que o rim está ligado. Manter o rim para fora da cavidade retroperitoneal por um cotonete colocado por baixo do órgão.
5. Com dois pinça fina, faça um furo 2-3 mm na cápsula (evite tocar no parênquima para evitar sangramento). Durante todo o procedimento cirúrgico manter a cápsula renal exposta continuamente humedecido.
6. Insira cuidadosamente os lóbulos sob a cápsula renal, mantendo a parede da cápsula aberta e o enxerto deslize sob a cápsula para o pólo borda. Coloque até 6 lóbulos por rim.
7. Substitua o rim na cavidade retro-peritoneal. Suturar as aponeuroses do músculo, em seguida, a pele com nós cirurgião individuais. Molhar a ferida com uma solução de iodeto de povidona 10%. Posicione o mouse em um pa aquecidad a 37 ° C.
8. Inquérito sobre o mouse transplantado até a recuperação completa da anestesia pelo controle de cardíacas, respiratórias e suiça movimentos, cores da mucosa até a recuperação total de visto por auto contidos movimentos.
   NOTA: Recomendamos a injeção de solução analgésica (buprenorfina, 0,1 mg / kg) de músculo intra logo após a cirurgia e os 2 dias após a cirurgia para evitar a dor pós-operatória.
9. Mantenha o animal operado em isolamento até que esteja totalmente recuperado. Inspeccionar a cada dois dias os pontos de malha da ferida para verificar e prevenir a infecção. Nunca observada infecção da ferida seguindo este procedimento.
   NOTA: análise semanal de células de sangue periférico a partir do CD3 ^{- / -} murganhos enxertados nos permite detectar o timo populações derivados originado a partir de qualquer E13 ou E18 progenitores usando o marcador CD45 alotípica linhagem de células T e anticorpos específicos (figura 3).

9. Análise da progénie de TSP por Citometria de Fluxo

1. Tease os FTOCs individualmente obter suspensões de células individuais (ver secção protocolo 4).
2. Suspensões de células mancha de lobos individuais com uma mistura de anticorpos contendo anticorpos que reconhecem CD45.1 PECy7, CD45.2 AmCyan, CD4 APCCy7, CD8 APC, CD3 Pacific Blue, Vγ5 FITC, Vδ1 PE e incubar conforme descrito no capítulo 5.
3. Re-suspender as células em HBSS + FCS a 1% + iodeto de propídio e análise de citometria de fluxo (ver resultados na Figura 2).

Resultados

A fim de escolher um método para esgotar lobos do timo de timócitos endógenos que permitam o melhor desenvolvimento de células progenitoras colonizadoras, comparamos os níveis de T reconstituição celular nos lobos do timo colonizados após a irradiação ou um desoxi-guanosina 5 dias (d-Gua) tratamento. Os resultados mostram que, enquanto não há nenhuma diferença no dia 9 de cultura, lobos irradiados continham mais células T do que aqueles tratados com d-Gua, no dia 12. Assim, a irradiação é mais apropriad...

Discussão

Dois ensaios principais podem ser usadas para analisar a diferenciação de células T ex vivo. O mais recentemente relatada é a co-cultura de células progenitoras hematopoiéticas, com células estromais da BM, OP9, expressar os ligandos de Noth1 delta, como 1 ou 4 ^12. Este ensaio de 2-D é fácil de executar, altamente eficientes e sensíveis, permitindo a análise o nível de uma única célula. No entanto, isso nem apoia o desenvolvimento de células T além da fase de DP nem a geração de γ?...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
90 x 15 mm and 35 x 15 mm plastic tissue culture petri dishes.	TPP	T93100/T9340	Sampling
26GA 3/8 IN 0.45x10mm syringes with needles Beckton-Dickinson Plastipak.	BD Plastipak	300015	Cell suspension
Nylon mesh bolting cloth sterilized 50/50 mm pieces.	SEFAR NITEX	03-100/32	Filtration of cells
Ethanol 70%.	VWR	83801.36	Sterility Actions
Iodide Povidone 10% (Betadine)	MEDA Pharma	314997.8	Sterility Actions
Ketamine 100mg/ml (stock solution)	MERIAL	-	Anesthesic
Xylazine 100mg/ml in PBS (stock solution)	Sigma	X1251-1G	Anesthesic and muscle relaxant
Buprenorphin 0.3mg/ml stock solution	AXIENCE	-	Morphinic analgesic
Ophtalmic gel (0.2% cyclosporin)	Schering-Plough Animal Health	-	Eyes protection
DPBS (+ CaCl2, MgCl2)	GIBCO Life Technology	14040-174	to isolate embryos
HBSS Hanks' Balanced Salt Solution (+ CaCl2, MgCl2)	GIBCO Life Technology	24020-091	to wash out the blood and dissect the embryos
OPTI-MEM I GlutaMAX I	GIBCO Life Technology	51985-026	Medium for cultures
Fœtal Calf serum	EUROBIO	CVFSVF00-0U	additive for cultures
Penicilin and Streptomycin	GIBCO Life Technology	15640-055	Antibiotics for cultures
2 b mercapto ethanol	GIBCO Life Technology	31350010	additive for cultures
LEICA MZ6 Dissection microscope	LEICA	MZ6 10445111	Occular W-Pl10x/23
Cold lamp source	SCHOTT VWR	KL1500 compact	Two goose neck fibers adapted
Silicone elastomer	World Precision Instruments	SYLG184	Dissecting Pad
Spoon, round and perforated	Fine Science Tools	10370-18	Dissection tools
Fine Iris Scissors	Fine Science Tools	14090-09	Dissection tools
Vannas spring Scissors	Fine Science Tools	15018-10	Dissection tools
Forceps : Dumont #5/45 Inox 11 cm	F.S.T.	11253-25	Dissection tools
Two pairs of fine straight watchmakers’ forceps Dumont #5 11 cm fine tips.	Fine Science Tools	11295-20	Dissection tools
Polyamid thread with needle 6-0   C-3 3/8c	ETHICON	F2403	for sutures
Needle-holder	MORIA/F.S.T.	12060-02	for sutures
Heating pad	VWR	100229-100	To maintain mouse temperature during anesthesy
Membrane Isopore RTTPO2500	DUTSCHER	44210	For FTOC
Terasaki 60 wells plates	FISHER	1x270 10318801	For hanging drop technique
Gauze swabs steriles 7.5cmx7.5cm	Hydrex	11522	To apply disinfecting solution
Fluorescence or biotin labelled antibodies	BD Biosciences, Biolegend or e-Biocsiences	Clone Number see table below	Staining cells
MACS Columns/Streptavidin Microbeads	Miltenyi Biotec	130-042-401/130-048-101	Cell depletion
Mice	Charles Rivers Laboratories (CD45.1) and Janvier Labs  (CD45.2)	C57BL/6 CD45.1 OR CD45.2	Source of cells and thymic lobes
Mice	CDTA Orléans, France	CD 3 epsilon Ko CD45.2	Grafting experiment