胸腺の特性を用いてマウス胚における前駆細胞をセトリング<em&gt;インビボ</em&gt;と<em&gt;インビトロ</em&gt;アッセイ

要約

This article describes in vivo and in vitro methodology to characterize the thymic settling progenitors by the analysis of the kinetics of generation, phenotype and numbers of their T cell progeny.

要約

胸腺沈降前駆細胞を特徴づけることはリンパ球減少患者におけるT細胞の交換のための戦略を考案することが不可欠、T細胞の発達の前胸腺の段階を理解することが重要です。我々は、in vitroおよびin vivo技術 、「ハンギングドロップ」法に基づいて、両方の中の相補的な2によってマウス胚13日目と18胸腺から前駆細胞を沈降胸腺を検討しました。この方法は、その子孫以下こうしてCD45アロタイプマーカーとで区別E13および/またはE18胸腺前駆細胞を照射した胎児胸腺葉に定着させました。混合集団との植民地は、人口のいずれかでのコロニー形成が可能で競争力のある選択圧を除去しながら、前駆細胞の生物学的性質の細胞自律的な差異を分析することができます。植民地化胸腺葉はまた、Tの人口動態などのin vivoでの成熟T細胞子孫の分析可能にする免疫不全の雄レシピエントマウスに移植することができます彼異なる組織や器官の末梢免疫系と植民地化。胎児胸腺器官培養物を、E13前駆細胞はすべてに急速に発展し、CD3 ⁺細胞に成熟することを明らかにした樹状上皮T細胞として知られている標準的なγδのT細胞サブセット、を生じました。対照的に、E18の前駆細胞は分化遅延を有し、樹状上皮T細胞を生成することができませんでした。 ^{/ - -}胸腺移植されたCD3の末梢血のモニタリングマウスはさらにE18の胸腺沈降前駆細胞は、時間の経過とともに、短期的胎児胸腺に理解することができなかった機能をそのE13の対応よりも成熟T細胞のより大きな数を生成することを示しました器官培養。

概要

Tリンパ球は、αβまたはγδT細胞受容体（TCR）を有する、特殊な器官における胸腺を区別する。十分に発達した胸腺は、2つの異なる領域で構成されています。生産性のTCRβおよびα鎖遺伝子を再配置胸腺細胞がプログラム死（正の選択として知られるプロセス）から救出された胸腺前駆細胞の開発皮質、および;自己リガンドに強すぎる反応性を有する胸腺細胞を選択した髄質は、（負の選択^）1,2削除されます。胸腺は、後に間葉細胞³に囲まれている第三の咽頭嚢の内胚葉層に由来します。これは、胎生E12から始まる造血前駆細胞が定着され、その後、連続的な動員は、通常のT細胞の発生⁴に必要とされます。胸腺の移民が開始され、厳密に調節されたプログラムによって編成、連続した発達段階を経て進化し、舞そのリガンドとの相互作用時に胸腺細胞のNotchシグナル伝達経路の活性化によってntained、4のようなデルタ、胸腺上皮細胞（のTEC）上に発現^5。

胸腺細胞の開発は、いわゆるCD4で始まる^- CD8 ^-ダ ​​ブルネガティブ（DN）の段階。 、DN2（CD25 ⁺ CD44 ^{+）、DN3（CD25 +} CD44 ^{- ）}とDN4（CD25 ^- CD44 ^{- ） -} DN胸腺細胞は、さらにDN1（CD44 ⁺ CD25）へのCD25およびCD44の発現に応じて分割することができます。 CD24（HSA）およびCD117（c-キット）をさらにDN1aとbが早期胸腺前駆細胞（ETP）に対応する5サブセットにDN1区画を細分化。胸腺細胞は、DN段階でのTcRδ、βおよびα鎖の配置を変更し、前のTCR選択（DN3-DN4ステージを）受けます。のTCRα鎖は、正と負のSELEの前に並べ替えて、CD4 ⁺ CD8 ⁺ダブルポジティブ（DP）区画への彼らは、さらにトランジットction。この段階では、ほとんどの胸腺細胞は排除され、わずかな割合（3〜5％）は、CD4 ⁺またはCD8 ^{+ T}細胞コンパートメント成熟到達します。

リンパ分化経路は、多能前駆細胞（MPP）と赤血球と巨核球⁶の可能性を失ったリンパプライミング多能性前駆細胞（LMPP）を生成するHSCの段階を経て進行します。 （C-キット（CD117）の発現、SCA-1とのFlt3 / Flk2は（CD135）およびインターロイキンの検出可能なレベルの不在^- LMPPは、表現型（林は、系統が負）分化した血液細胞マーカーの不在によって定義されていますIL）-7受容体α鎖（IL-7RαまたはCD127）。 LMPPsはさらにその段階によって、骨髄細胞を生成する能力を失っていることを共通のリンパ系前駆細胞^（CLP）7へと分化します。 CLPは、リンパ球（B細胞およびT細胞）、NK細胞、DCおよび先天性リンパ系細胞（ILC）の可能性を保持し、CD1の発現によりLMPP異なります27とSCA-1の高レベルの不在。

前駆細胞を沈降胸腺（TSP）の性質は広範囲に^8を議論されてきたが、それは開発⁹を通じて、TSP変更表現型、分化能および機能ことが最近明らかになりました。我々は、E13（第一波）またはE18（第2波）のいずれかからFACS選別細胞による孤立し、TSPを特徴づけるために、in vitroおよびin vivoアッセイを行いました。異なるアロタイプマーカーを有するE13とE18前駆細胞の同数の植民地照射胸腺葉を持つ胎児胸腺器官培養（FTOC）は、同様の発達の環境でそれらの子孫以下の許可および前駆細胞の両方のタイプの間で異なる細胞固有の特性を明らかにしました。 E13やE18 TSPのいずれかによって植民地化胸腺ローブが原因で両方の前駆体との間の競合に選択せずに開発を可能にした。コロニー形成胸腺葉のインビボ移植、さらにまた、Tことが示されました彼は、 インビボで異なる生物学的特性を有するE13とE18 TSPの子孫を成熟します。最初の波からのTSPは、急速にT細胞を生成するが、αβおよびγδT細胞の数が少ないを生じさせます。後者の中、私たちは不変TCRは、それらは創傷治癒における機能を発揮し、唯一の胚発生の¹⁰の間に生成され、表皮に移行していVγ5Vδ1樹状上皮T細胞（DETC）を検出しました。対照的に、第二波のTSPは、TCR ⁺ T細胞の高い数を生成するために時間がかかり、DETCを生成することができません。

プロトコル

倫理文：すべての実験は、パスツール研究所の倫理憲章に従って行わフランス農業省によって承認され、EUのガイドラインに。農業のフランスの省によって認定小齧歯類手術の訓練を受けたマニピュレータは、すべての外科的処置を行います。
注：5段階の計画手順を示す附属書表1に参照してください。

胚の1選択

1. 36 C57BL / 6 CD45.2の女性、12人の女性のCD45.1、12 C57BL / 6 CD45.1の男性と12 C57BL / 6 CD45.2の男性を使用してください。いずれかの男性の遺伝子型と雌を交配すると、胚CD45.1 / 2およびCD45.1を生成する受信者の胸腺葉のソースとして使用TSPまたはCD45.2のソースとして使用。ハウス個別にすべての男性。
2. E18 TSP分離のための胚を得るために、21日グラフト実験の前に、午後6時に1人の男性CD45.1とケージに2人の女性を配置します。正午前に、次の日の膣栓の存在を確認してください。 SEPA差し込ま女性を評価します。
3. TSPによって植民地化されるE14胚を得るために、17日グラフト実験の前に、男性のCD45.2を使用して、（1.2）には、上記の手順を繰り返します。
4. E13 TSPを単離するための胚を得るために、16日間のグラフト化実験の前に、雄C57BL / 6 CD45.1を使用して、（1.2）上記の手順を繰り返します。

水平層流フードの下で胚の2解剖

注：グラフト実験前二日。

1. 飽和密室で、少なくとも5分の間に頸部脱臼によりまたはCO ₂ガスの漸進的な投与によって妊娠した雌を生け贄に捧げます。心肺運動の決定的な逮捕によって死を確認してください。 70％エタノールで腹部を濡らします。
2. 正中腹部の皮膚に縦切開を行い、離れて、皮膚を​​引っ張ってそれを開きます。消化管に触れることなく鉗子とハサミで腹膜を開きます。ビフィズスのuterを引き出し私たちとハサミで膣から分離。
3. 40〜50ミリリットルのDPBSを含む90×15ミリメートルペトリ皿に子宮を置き、各胚の脱落膜の間に横方向に切断しました。
4. 先端の細いハサミや微細な鉗子で、子宮の筋肉膜を除去胎盤および卵黄嚢との間で切断して胚を取り出して、胚を保持さamniosを、削除してください。
5. ペトリ皿に胚を置きHBSS + 1％ウシ胎児血清を含む90×15ミリ（FCS）。 E15よりも古い胚のために、任意のさらなる解剖前にハサミで頭部を削除します。

胸腺の3分離

1. 双眼拡大レンズの下では、湿ったガーゼ寝具に、仰臥位（腹ビュー）に横たわって、胚を配置します。
2. 胸部グリッドをつまんで開​​き、胸骨の軟骨に沿って長手方向に1鉗子を挿入します。湾曲鉗子で、Tを可視化するために確保胸壁を引きます気管の両側にハイミックローブ。
3. 慎重に微細な鉗子でつまんで下の各葉を保持し、1ミリリットルのHBSS + 1％FCSを含有するペトリ皿に置きます。ローブを分離し、カプセルに損傷を与えることなく、2 1ミリリットルのシリンジ+ 26 G⅜「針で周囲の結合組織を除去。
4. 血液細胞を除去するためにHBSS + 1％FCS 3mlにローブを洗います。
   注：E15の前に、胸腺ローブが二肺葉臓器を構成する途中で気管以降ヒューズの両側に配置されています。

4.細胞懸濁液

1. HBSS + 1％FCSで1ミリリットルの注射器に取り付けられた2つの26 G針で、双眼拡大レンズの下でローブを離れていじめます。ナイロンメッシュを通して細胞懸濁液をフィルタリングします。

5.蛍光抗体で染色し、細胞選別

注：すべての抗体は、以前に集団の最適な定義を得るために滴定する（titratイオン）は、抗体のバッチで変化させることができます。

1. 系統陽性細胞を染色するために、ビオチン化抗体のカクテル100μlを4℃で15〜30分間、胸腺細胞（E13またはE18）をインキュベートする（抗CD19、抗群Gr1、抗TER119、抗NK1.1 、抗CD11cの、抗CD3、抗CD4、抗CD8、抗CD25）。
2. 離れて抗体を過剰に洗浄するために7分間280×gで4ミリリットルHBSS + 1％FCSでチューブをスピンダウンし、上清を、新鮮なHBSS + 1％FCS中に再懸濁したペレットを除去します。遠心分離を繰り返します。
3. 4℃で15分間、ストレプトアビジンビーズとE18のビオチン標識された細胞をインキュベートし、HBSS、1％FCSで細胞を2回洗浄します。 2ミリリットルのHBSS + 1％FCSで細胞を再懸濁します。ほとんどのE13胸腺細胞は、系統陰性であり、従って、細胞選別の前にMACS濃縮を必要としません。
4. 製造業者の説明書に従って、LSカラム上で細胞を渡します。すべての細胞懸濁液が入ったとき、カラムを2mlのHBSS + 1％FCSを追加します。回復しますカラム4mlを280×gで7分間、細胞を通って流れ、遠心。
5. 枯渇E18またはTSP抗体ミックス（抗CD117 APC50μlの総E13の胸腺細胞、抗CD135 PE、抗CD127 PECy7、抗CD24 FITC、抗CD44 APCCy7とストレプトアビジンパシフィックブルーのいずれかのペレットを再懸濁）、暗所で4℃で20分間インキュベートします。
6. 4ミリリットルHBSS + 1％FCSとで細胞を洗浄する1ミリリットルHBSS中にヨウ化プロピジウムでの+ 1％FCSに細胞を再懸濁。
7. ソートのTSP林^- 200μlの完全培地+ 20％FCSを含む1.5 mlチューブの上に（4レーザーで）FACSにおけるCD44 ⁺ CD117 ⁺ CD24 ^低 CD127 ⁺ CD135 ⁺細胞。 FSCおよびSSCチャンネルでそれらのサイズおよび粒度に応じて第1のセルのゲート。 （ヨウ化プロピジウムで染色）死細胞、ゲートアウトダブレットを排除し、指数関数的なスケールで蛍光をスコア。 100または600の周りのTSPは、1 E13やE18 1胸腺、respectivから得ることができますエリー。

前駆細胞とE14胸腺ローブの6植民地：ハンギングドロップ法

1. （30グレイ= 30 Gyの）CD45.2胚からE14胸腺葉、文化の前に3時間を照射します。
   注：E14またはE15胸腺ローブは正常T細胞前駆細胞のレシピエントとして使用されています。以前の妊娠日目の胸腺ローブがおそらく上皮細胞の不完全な発展に、不十分ながら開発による臓器の大きいサイズに早期の壊死の後の妊娠日の結果の受信者胸腺葉を使用しました。
2. 遠心のTSPと再サスペンド細胞培養培地中で（10％FCSを含むOPTI-MEM完全培地、ペニシリン（50単位/ ml）、ストレプトマイシン（50μg/ ml）および2βメルカプトエタノール（50μM））をソートし、その結果35 μlの500 TSPが含まれています。
3. 60ウェルテラサキプレートの他のすべてのウェルの細胞懸濁液の35μlのドロップを置きます。
   注：これらは連続したウェルに入れている場合は35μlの滴が融合することができます。
4. 各液滴の表面に1照射ローブを配置します。テラサキプレートを閉じて、細胞が重力によって落下の頂端極に到達できるように逆さまにプレートを回します。
5. ドロップの頂端縁にスライドするようにローブを強制的に穏やかに反転板の上側を押してください。 37℃+ 5％CO ₂で48時間、加湿インキュベーターで反転テラサキプレートをインキュベートします。植民地化した後、培養E14 FTOC ⁷で胸腺、または受信者の成体マウス⁸の腎臓被膜下に移植片のいずれか。

7.胎児胸腺器官培養

1. 35ミリメートルペトリ皿の上に完全培地の3ミリリットルを置きます。媒体上に浮上isopore膜フィルターを置きます。鉗子（1膜上を超えない8ローブ）を有する膜の端に再構成されたローブを配置します。
2. ウォートの2ミリリットルを含む、カバーなし、35mm皿と一緒に、90ミリメートルのペトリ皿の内側に胸腺葉を含むペトリ皿を置きます最適な湿度を確保するために、R。 37℃+ 5％CO ₂で12日間インキュベートします。

無菌条件下での腎臓被膜下移植片8

注：腎実質はカプセルを形成する結合組織に囲まれています。サブ莢領域は、血液、それによって移植片の開発に適した環境（ 例えば胸腺葉、膵島または新生児の心）を提供するリンパ管において特に豊富です。それは右腎よりもアクセス可能であるため、移植片は、通常、左の腎臓で行われています。 CD3 ^{- / -}雄マウスはE15の前にセックス決意を容易に行われないため、受信者は、このように起因するY染色体にリンクされているマイナー組織適合性抗原に対する宿主反応、移植片対を回避として使用しました。

1. 楽器を殺菌し、手術に沿って滅菌手袋を着用してください。ケタミン10 mg / mlのキシラジン+ 1ミリグラム/溶液の腹腔内注射によりマウスを麻酔mlをPBS中に希釈した（体重10gあたり50〜100μl）を、1mlシリンジを使用して。すだれ状反射の欠如をチェックすることによって麻酔を確認してください。麻酔中の乾燥を防ぐために、それぞれの目にハイドロOptimuneゲルのドロップを置きます。
   注：ソリューションは、即座に調製し、注射前に室温で温めする必要があります。麻酔は、少なくとも20分間持続します。麻酔の程度は、すべての手術に沿って制御されるべきです。麻酔は、20分毎に半分の用量の腹腔内注射することにより延長することができます。
2. 水平ラミナフローフード下で、その右側にマウスを置きます。 70％エタノールおよび10％ヨウ化真皮溶液で手術領域を滅菌します。鉗子部とだけ後肢の関節上記2cmの長さに沿ってマウスの毛。手術領域を剃ります。
3. メスで、最初の切開1.5センチメートル長を行い、皮膚組織は、その後はさみで筋肉組織を切断します。切開の両側にわずかな圧力を適用します、腹腔から腎臓を強制れます。
4. 湿った腎臓を維持するために綿芽で生理食塩水を適用します。あなたは臓器を露出させることは困難である場合は、腎臓が接続されている周囲の脂肪細胞組織を引き出すために平らなピンセットを使用しています。臓器の下に配置された綿棒により後腹膜腔から腎臓を維持します。
5. 2細かい鉗子で、カプセル2-3ミリの穴を作る（出血を防ぐために実質を触れないように注意してください）​​。全体の外科的処置の間に連続的に湿らせた露出された腎臓カプセルを保持します。
6. 開かれたカプセルの壁を維持することによって、腎臓被膜下に慎重ローブを挿入し、エッジの極に向かって被膜下移植片をスライドさせます。腎臓あたり6ローブまで置きます。
7. レトロ腹腔内に腎臓を交換してください。筋腱膜、個々の外科医の結び目と、その後皮膚を縫合。 10％ヨウ化ポビドン溶液で傷を濡らします。加熱されたPAの上にマウスを置きます37℃でD。
8. 心臓、呼吸器およびウィスカの動きの制御により、麻酔から完全に回復するまで、移植マウスを調査、自己から見た完全に回復するまでの粘膜の色が動きを含んでいました。
   注：私達はちょうど手術後の痛みを防止するために、手術後の手術と2日後に鎮痛剤溶液（Buprenorphin、0.1ミリグラム/ kg）を筋肉内注射することをお勧めします。
9. 完全に回復するまで、単独で動作する動物を保管してください。確認し、感染を防止するために、一日おきに、創傷のステッチを点検します。この手順に従って、創傷感染を観察することはありません。
   注：CD3から末梢血細胞の週刊分析^{- / -}グラフトされたマウスは、私たちが由来集団はCD45アロタイプマーカーおよびT細胞系列特異的抗体（ 図3）を使用して、E13やE18前駆細胞のいずれか由来の胸腺を検出することを可能にします。

フローサイトメトリーによるTSPの子孫の9分析

1. （プロトコルセクション4を参照）単一細胞懸濁液を得るために、個別にFTOCsをいじめます。
2. CD45.1 PECy7、CD45.2 AmCyan、CD4 APCCy7、CD8 APC、CD3パシフィックブルー、Vγ5FITC、Vδ1PEとセクション5で説明したようにインキュベートを認識する抗体を含む抗体混合物と個々のローブからステイン細胞懸濁液。
3. 再懸 ​​濁（ 図2の結果を参照してください）HBSS + 1％FCS +ヨウ化プロピジウムで細胞を、フローサイトメーターで分析します。

結果

コロニー形成前駆細胞の最良の開発を可能にする内因性胸腺細胞の胸腺葉を枯渇させる方法を選択するために、我々は、照射後にコロニー形成胸腺葉におけるT細胞再構成のレベルまたは5日間のデオキシグアノシン（D-Guaの）治療を比較しました。結果は、照射後のT細胞の発生を得るために、D-Guaの治療よりも適切であり、培養の9日目に差がないが、照射されたローブがこのように12日目に、...

ディスカッション

二つの主なアッセイは、ex vivoでのT細胞分化を分析するために使用することができます。最も最近報告Noth1、1または^4〜12のようなデルタのリガンドを発現し、OP9 BMストローマ細胞と造血前駆細胞の共培養である。この2-Dアッセイは、実施が容易で、非常に効率的で敏感であり、可能分析で単一細胞レベル。しかし、いずれも、胸腺上皮との直接的な相互作用を必要とし、どちら...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
90 x 15 mm and 35 x 15 mm plastic tissue culture Petri dishes.	TPP	T93100/T9340	Sampling
26 G ⅜" 0.45 x 10 mm syringes with needles	BD Plastipak	300015	Cell suspension
Nylon mesh bolting cloth sterilized 50/50 mm pieces.	SEFAR NITEX	03-100/32	Filtration of cells
Ethanol 70%.	VWR	83801.36	Sterility actions
Iodide Povidone 10% (Betadine)	MEDA Pharma	314997.8	Sterility actions
Ketamine 100 mg/ml (stock solution)	MERIAL		Anesthesic
Xylazine 100 mg/ml in PBS (stock solution)	Sigma	X1251-1G	Anesthesic and muscle relaxant
Buprenorphin 0.3 mg/ml stock solution	AXIENCE		Morphinic analgesic
Ophtalmic gel (0.2% cyclosporin)	Schering-Plough Animal Health		Eye protection
DPBS (+ CaCl2, MgCl2)	GIBCO Life Technology	14040-174	to isolate embryos
HBSS Hanks' Balanced Salt Solution (+ CaCl2, MgCl2)	GIBCO Life Technology	24020-091	to wash out the blood and dissect the embryos
OPTI-MEM I GlutaMAX I	GIBCO Life Technology	51985-026	Medium for cultures
Fetal calf serum	EUROBIO	CVFSVF00-0U	additive for cultures
Penicilin and streptomycin	GIBCO Life Technology	15640-055	Antibiotics for cultures
2-Mercaptoethanol	GIBCO Life Technology	31350010	additive for cultures
LEICA MZ6 Dissection microscope	LEICA	MZ6 10445111	Occular W-Pl10x/23
Cold lamp source	SCHOTT VWR	KL1500 compact	Two goose neck fibers adapted
Silicone elastomer	World Precision Instruments	SYLG184	Dissecting Pad
Spoon, round and perforated	Fine Science Tools	10370-18	Dissection tools
Fine iris scissors	Fine Science Tools	14090-09	Dissection tools
Vannas spring scissors	Fine Science Tools	15018-10	Dissection tools
Forceps: Dumont #5/45 Inox 11 cm	F.S.T.	11253-25	Dissection tools
2 pairs of fine straight watchmakers’ forceps Dumont #5 11 cm fine tips.	Fine Science Tools	11295-20	Dissection tools
Polyamid thread with needle 6-0 C-3 3/8c	ETHICON	F2403	for sutures
Needle-holder	MORIA/F.S.T.	12060-02	for sutures
Heating pad	VWR	100229-100	To maintain mouse temperature during anesthesy
Membrane Isopore RTTPO2500	DUTSCHER	44210	For FTOC
Terasaki 60 wells plates	FISHER	1x270 10318801	For hanging drop technique
Gauze swabs steriles 7.5 x 7.5 cm	Hydrex	11522	To apply disinfecting solution
Fluorescence or biotin labelled antibodies	BD Biosciences, Biolegend or e-Biocsiences	Clone Number see table below	Staining cells
MACS Columns/Streptavidin Microbeads	Miltenyi Biotec	130-042-401/130-048-101	Cell depletion
Mice	Charles Rivers Laboratories (CD45.1) and Janvier Labs  (CD45.2)	C57BL/6 CD45.1 OR CD45.2	Source of cells and thymic lobes
Mice	CDTA Orléans, France	CD 3 epsilon Ko CD45.2	Grafting experiment