אפיון של הרתי יישוב אבות בעובר העכבר באמצעות<em&gt; In vivo</em&gt; ו<em&gt; במבחנה</em&gt; מבחני

Summary

This article describes in vivo and in vitro methodology to characterize the thymic settling progenitors by the analysis of the kinetics of generation, phenotype and numbers of their T cell progeny.

Abstract

אפיון אבות הרתי יישוב חשוב להבין השלבים טרום-הרתי של פיתוח תאי T, חיוני לתכנן אסטרטגיות להחלפת תאי T בחולי lymphopenic. למדנו הרתי יישוב אבות מיום עכברי עוברי 13 ו -18 thymi ידי שני משלימים במבחנה ובטכניקות vivo, שני מבוססים על השיטה "טיפה תלויה". שיטה זו אפשרה התיישבות אונות הרתי עובריות מוקרנת עם E13 ו / או E18 אבות הרתי המאופיין בסמני CD45 allotypic וכך הבאים צאצאיהם. התיישבות עם אוכלוסיות מעורבות מאפשרת ניתוח הבדלים אוטונומיים תא בנכסים ביולוגיים של האבות בעוד התישבות גם עם אוכלוסייה מסירה לחצים סלקטיביים תחרותיים אפשריים. יכולות גם להיות מורכבים אונות הרתי יישבו בעכברי immunodeficient זכר נמען מאפשרים הניתוח של צאצאי תא T הבוגרים in vivo, כגון דינמיקת אוכלוסייה של tהוא היקפי מערכת וקולוניזציה של רקמות ואיברים שונים חיסוניות. תרבויות איבר הרתי עוברית גילו כי אבות E13 התפתחו במהירות לכל בוגרים CD3 ⁺ תאים והולידו את קבוצת המשנה של תאי T γδ הקנונים, המכונה תאי T אפיתל הדנדריטים. לשם השוואה, יש לי אבות E18 בידול מושהה ולא הצליחו לייצר תאי T אפיתל הדנדריטים. הניטור של דם ההיקפי של CD3-מורכבים התימוס ^{- / -} עכברים הראה עוד, כי אבות הרתי E18 יישוב ליצור, עם זמן, מספר גדול יותר של תאים הבוגרים T מאשר עמיתיהם E13, תכונה שלא ניתן הייתה להערכה בהרתי העוברי לטווח הקצר תרבויות איברים.

Introduction

לימפוציטים מסוג T, הנושא את αβ או γδ קולט תא T (TCR), להבדיל באיבר מיוחד, התימוס. התימוס מפותח מאורגן בשני אזורים נפרדים: הקליפה, שבו אבות הרתי לפתח ובי thymocytes שפרודוקטיבית לסדר מחדש את β TCR וגני שרשרת α הם הצילו ממוות מתוכנת (תהליך המכונה סלקציה חיובית); והלשד, שבו נבחר thymocytes עם תגובתיות חזקה מדי לligands העצמי נמחקים (סלקציה שלילית) ^1,2. התימוס מקור שכבת endodermal של כיס בלוע השלישי שהוא מוקף מאוחר יותר על ידי תאי mesenchymal ^3. הוא יישב על ידי אבות hematopoietic מתחילים ביום עוברי E12 ו, לאחר מכן, גיוס רציף נדרש לפיתוח תא T הרגיל ^4. עולים הרתי להתפתח דרך שלבי התפתחות רצופים, בניצוחו של תכנית בחוזקה מוסדרת, יזם ומאיntained על ידי ההפעלה של מסלול האיתות של Notch על thymocytes על אינטראקציה עם ליגנד, דלתא כמו 4, הביע בתאי אפיתל הרתי (Tecs) ^5.

פיתוח Thymocyte מתחיל בCD4 שנקרא ^- CD8 ^- שלילי כפול שלבים (DN). thymocytes DN ניתן מחולק חלוקה נוסף על פי הביטוי של CD25 וCD44 לDN1 (CD25 ^- CD44 ^+), DN2 (CD25 ⁺ CD44 ^+), DN3 (CD25 ⁺ CD44 ^-) וDN4 (CD25 ^- CD44 ^-). CD24 (HSA) וCD117 (c-kit) subdivides נוסף תא DN1 ל -5 תת בי DN1a וב מתאים לאבות המוקדמים הרתי (ETP). Thymocytes לסדר מחדש את רשתות δ, β α וTCR בשלב DN ולעבור בחירה מראש TCR (שלבי DN3-DN4). הם עוד מעבר לCD4 ⁺ CD8 ⁺ התא החיובי כפול (DP) שבו שרשרת α TCR מארגנת מחדש לפני Sele גודל חיובי והשליליסיפורת. בשלב זה רוב thymocytes בוטלו ורק אחוז קטן (3-5%) להגיע ⁺ CD4 או CD8 ⁺ T תא בוגר תא.

מסלול בידול הלימפה מתקדם בשלבים של HSCs שיוצרים אבות multipotent (MPP) ואבות-דרוך הלימפה multipotent (LMPP) שאיבדו כדורית אדומה וmegakaryocyte פוטנציאל ^6. LMPP מוגדר phenotypically בהעדר סמנים של תאי דם מובחנים (שושלת שלילית, לין ^-), הביטוי של c-kit (CD117), SCA-1 וFLT3 / Flk2 (CD135) והעדר הרמות לזיהוי של אינטרלוקין ( IL) -7 קולט α שרשרת (IL-7rα או CD127). LMPPs נוסף להבדיל לאבות משותפים הלימפה (CLP) ⁷ כי על ידי השלב שאיבדו את היכולת לייצר תאי מיאלואידית. CLP לשמור הלימפוציטים (B ותאי T), תא NK, DC ותא הלימפה המולדת פוטנציאלי (ILC), ושונה מLMPP על ידי הביטוי של CD127 והעדר הרמות גבוהות של SCA-1.

למרות שהטבע של אבות הרתי יישוב (TSP) כבר התווכח ⁸ בהרחבה, זה הפך לאחרונה ברור ששינוי TSP פנוטיפ, פוטנציאל התמיינות ותפקוד, בכל פיתוח ^9. ביצענו במבחנה ובמבחני vivo לאפיין את כפית, מבודדת על ידי תא FACS מיון משני E13 (הגל הראשון) או E18 (גל שני). תרבויות עוברית הרתי איבר (FTOC) עם אונות הרתי מוקרנת יישבו על ידי מספר שווה של אבות E13 וE18, הנושאים סמני allotypic שונים, אפשרו הבא צאצאיהם בסביבת התפתחותית דומה וגילו מאפיינים פנימיים תא, שונים בין שני הסוגים של אבות. אונות הרתי יישבו גם על ידי E13 או E18 TSP אפשרו פיתוח ללא בחירה בשל תחרות בין שני האבות. השתלת vivo של האונות הרתי מתנחלות, הראתה עוד, כי גם לאיש לו צאצאים בוגרים של E13 וE18 TSP מאפיינים ביולוגיים שונים בגוף חי. TSPs מהגל הראשון במהירות לייצר תאי T אבל להצמיח מספרים נמוכים של αβ וγδ תאי T. בקרב האחרון זיהינו תאים דנדריטים Vγ5Vδ1 אפיתל T (DETC), שיש לי TCR משתנה, להגר לעור שבו הם מפעילים פונקציה בריפוי פצעים ומיוצרים רק במהלך התפתחות עוברית ^10. לעומת זאת, כפית מהגל השני תיקח זמן רב יותר כדי ליצור מספרים גבוהים של תאי TCR ⁺ T ולא מצליחה ליצור DETC.

Protocol

הצהרת אתיקה: כל הניסויים בוצעו על פי המכון פסטר אתיקת האמנה, שאושרה על ידי משרד החקלאות הצרפתי, ולהנחיות של האיחוד האירופי. מניפולטור עם הכשרה בניתוח מכרסם קטן, מאושר על ידי משרד החקלאות הצרפתי, מבצע את כל ההתערבות כירורגית.
הערה: ראה בטבלה נספח 1 המציגה את הליך תכנית 5 שלבים.

1. בחירה של העוברים

1. השתמש 36 נקבות / 6 CD45.2 C57BL, CD45.1 נקבות 12, 12 C57BL / 6 זכרים CD45.1 ו -12 C57BL / 6 זכרים CD45.2. חוצה את הנקבות עם או גנוטיפ הזכר לייצר עוברי CD45.1 / 2 וCD45.1 משמשים כמקור לכפית או CD45.2 משמש כמקור לאונות הרתי נמען. בית כל הגברים בנפרד.
2. כדי להשיג עובר לבידוד E18 TSP, מקום 2 נקבות בכלוב עם CD45.1 אחד גברים בשעה 6, 21 ימים לפני ניסוי ההשתלה. בדוק את הנוכחות של תוסף נרתיק למחרת, לפני הצהריים. SEPAלדרג את הנקבות מחוברות.
3. כדי להשיג עוברי E14 שהתיישב בו כפית, לחזור על התהליך לעיל (1.2), באמצעות CD45.2 גברים, 17 ימים לפני ניסוי ההשתלה.
4. כדי להשיג עוברים לבודד E13 TSP, לחזור על התהליך לעיל (1.2), תוך שימוש בזכרים C57BL / 6 CD45.1, 16 ימים לפני ניסוי ההשתלה.

2. Dissection של העוברים תחת אופקי זרימה למינרית הוד

הערה: יומיים לפני ניסוי ההשתלה.

1. להקריב את הנשים בהריון על ידי נקע בצוואר הרחם או על ידי ממשל מתקדם של גז CO ₂ בלפחות 5 דקות, בתא סגור להרוות. ודא מוות על ידי מעצר מוחלט של תנועות אירובית-נשימתי. להרטיב את הבטן עם אתנול 70%.
2. לעשות חתך אורכי בעור בבטן קו האמצע ולפתוח אותו על ידי משיכת העור לגזרים. פתח את הצפק עם מלקחיים ומספריים בלי לגעת במערכת העיכול. משוך את uter bifidשלנו ולהפריד אותו מהנרתיק עם המספריים.
3. מניחים את הרחם ב90 x 15 מ"מ צלחת פטרי המכילה 40-50 מיליליטר DPBS ולחתוך transversally בין decidua של כל עובר.
4. עם זוג מספריים טיפ נאה ומלקחיים בסדר להסיר את קרום שריר הרחם, להוציא את העוברים על ידי חיתוך בין השליה וצק החלמון, ולהסיר את amnios, ששמירה על העוברים.
5. מניחים את העוברים בצלחת פטרי 90 x 15 מ"מ המכיל HBSS + 1% בסרום עגל עוברי (FCS). לעוברים מבוגרים מE15, להסיר את הראשים עם זוג המספריים לפני כל נתיחה נוספת.

3. בידוד של קורנית

1. תחת זכוכית המגדלת המשקפת, למקם את העובר, שוכב במצב שכיבה (צפה בגחון), על מצע גזה רטוב.
2. הכנס אחד מלקחיים longitudinally לאורך הסחוס של עצם החזה, לצבוט ולפתוח את רשת בית החזה. עם מלקחיים מעוקלים, למשוך את קיר בית החזה בצד כדי להמחיש את tאונות hymic בכל צד של קנה הנשימה.
3. להחזיק בזהירות כל אונה ידי צובט מתחת עם מלקחיים עדינים ומניח אותם בצלחת פטרי המכילה FCS 1 מיליליטר HBSS + 1%. לבודד את האונות ולהסיר רקמת חיבור המקיפה עם שני מזרקים 1 מיליליטר + 26 G ⅜ "מחטים, מבלי לפגוע בכמוסה.
4. שטוף את האונות ב 3 מיליליטר של FCS + 1% HBSS לחסל תאי דם.
   הערה: לפני E15, אונות הרתי נמצאות בכל צד של קנה הנשימה והנתיך מאוחר יותר באמצע להוות איבר דו-אוֹנִי.

4. השעיות תא

1. להפריד אונות תחת זכוכית המגדלת המשקפת, עם שתי 26 מחטי G רכובים על 1 מיליליטר מזרקים, בFCS + 1% HBSS. סנן את ההשעיה התא דרך רשת ניילון.

מכתים 5. עם נוגדנים ניאון ומיון תא

הערה: כל הנוגדנים טיטרציה בעבר להשיג הגדרה אופטימלית של האוכלוסיות (titratיון יכול להשתנות עם אצווה הנוגדן).

1. דגירה thymocytes (E13 או E18) במשך 15-30 דקות ב 4 ° C עם של קוקטייל של נוגדני biotinylated להכתים תאים חיוביים שושלת 100 μl (אנטי-CD19, אנטי-Gr1, אנטי-Ter119, אנטי-NK1.1 , CD11c אנטי, אנטי-CD3, אנטי CD4, CD8 אנטי, אנטי CD25).
2. לשטוף את העודף של נוגדני ספין למטה הצינורות עם FCS 4 מיליליטר HBSS + 1% ב 280 XG במשך 7 דקות, לחסל את supernatant והגלול בFCS + 1% הטריים HBSS מתלים-מחדש. חזור על צנטריפוגה.
3. דגירה תאי שכותרתו ביוטין E18 עם microbeads streptavidin במהלך 15 דקות ב 4 מעלות צלזיוס ולשטוף את התאים פעמיים בFCS 1% HBSS. להשעות מחדש את התאים 2 מיליליטר HBSS + 1% FCS. רוב thymocytes E13 הוא שושלת שלילית ולכן לא צריך העשרת MACS לפני מיון תא.
4. להעביר את התאים בעמודה LS, על פי הוראות היצרן. כאשר כל ההשעיה התא נכנסה לטור להוסיף FCS + 1% 2 מיליליטר HBSS. להתאושש4 מיליליטר של הטור לזרום דרך צנטריפוגות התאים ל7 דקות ב 280 x גרם.
5. מחדש להשעות את גלולה של שני E18 המדולדל או thymocytes E13 כולל בμl 50 של תערובת נוגדני TSP (אנטי-CD117 APC, אנטי-CD135 PE, אנטי-CD127 PECy7, אנטי CD24 FITC, אנטי CD44 APCCy7 ואוקיינוס ​​השקט הכחול streptavidin ) ו דגירה של 20 דקות ב 4 ° C בחושך.
6. לשטוף את התאים עם 4 מיליליטר HBSS + 1 FCS% ומחדש להשעות את התאים 1 מיליליטר HBSS FCS 1% + עם יודיד propidium.
7. מיין לין TSPs ^- CD127 ^הנמוך CD44 ⁺ CD117 ⁺ CD24 ⁺ CD135 ⁺ תאים בFACS (עם 4 לייזרים) על 1.5 מיליליטר צינורות המכילים 200 μl FCS + 20% בינוניים מלא. השער ראשון התאים בהתאם לגודלם והגרעיניות בFSC וערוצי SSC. לחסל את התאים מתים (צביעה עם יודיד propidium), שער החוצה כפילויות ולהבקיע את הקרינה בקשקשי מעריכי. ניתן להשיג בסביבות 100 או 600 TSPs מE13 אחד או אחת התימוס E18, respectivאיליי.

6. הרתי אונות עם אבות ההתיישבות של E14: טכניקת גלילת תליה

1. להקרין (30 אפורים = 30 Gy) אונות הרתי E14 מעוברי CD45.2, 3 שעות לפני התרבות.
   הערה: אונות הרתי E14 או E15 שימשו בהצלחה כנמען של אבות תא T. שימוש באונות הרתי נמען של תוצאות ימי הריון מאוחר יותר בנימק מוקדם בשל הגודל גדול יותר של האיבר תוך אונות הרתי בימי הריון מוקדם יותר לפתח גרועה, ככל הנראה בשל פיתוח שלם של תאי האפיתל.
2. צנטריפוגה מסודרים TSPs מחדש להשעות את התאים במדיום התרבות (בינוני מלא OPTI-ממ עם FCS 10%, פניצילין (50 יחידות / מיליליטר), סטרפטומיצין (50 מיקרוגרם / מיליליטר) ו2β-mercaptoethanol (50 מיקרומטר)) באופן ש-35 μl מכיל 500 TSP.
3. מניחים ירידת 35 μl של השעיה תא כל גם אחרים של צלחת גם Terasaki 60.
   הערה: 35 טיפות μl יכולות לאחות אם הם ממוקמים בבארות רציפות.
4. הנח אונה אחת מוקרנת על פני השטח של כל טיפה. סגור את צלחת Terasaki ולהפוך את הצלחת הפוכה לתת התאים להגיע לקוטב הפסגה של הירידה על ידי כוח הכבידה.
5. הכה בעדינות בצד העליון של הצלחת ההפוכה כדי לאלץ את האונות להחליק לקצה הקודקוד של הירידה. דגירה את צלחת Terasaki ההפוכה בחממה humidified במשך 48 שעות על 37 מעלות צלזיוס + 5% CO _2. לאחר ההתיישבות, או תרבות thymi E14 ב ^-7 FTOC, או שתל תחת הקפסולה הכליות של עכבר בוגר נמען ^8.

7. עוברי הרתי איברים תרבות

1. מניחים 3 מיליליטר של מדיום שלם בצלחת פטרי 35 מ"מ. מניחים מסנן קרום isopore צף על המדיום. מניחים את האונות מחדש על הקצה של הקרום עם מלקחיים (לא יותר מ -8 אונות על קרום אחד).
2. מניחים את צלחות פטרי המכילות את האונות הרתי בתוך צלחת פטרי 90 מ"מ, יחד עם מנה 35 מ"מ, ללא כיסוי, המכיל 2 מיליליטר של water, כדי להבטיח לחות אופטימלית. דגירה 12 ימים ב 37 ° C + 5% CO _2.

8. שתלי תחת הקפסולה הכליות בתנאים סטריליים

הערה: parenchyma הכליות מוקף רקמת חיבור יוצרת כמוסה. האזור תת-קופסית הוא עשיר במיוחד בדם וכלי הלימפה ובכך לספק סביבה מתאימה לפיתוח שתלים (למשל אונות הרתי, איי לבלב או לבבות שזה עתה נולד). שתלי נעשים בדרך כלל על הכליה השמאלית משום שהוא נגיש יותר מהכליה הימנית. CD3 ^{- / -} עכברי זכרים שמשו כמקבלים וכך למנוע שתל לעומת תגובת מארח בשל אנטיגנים histocompatibility קטין הצמודים לכרומוזום Y, כי קביעת מין לפני E15 היא לא לעשות בקלות.

1. לעקר את המכשירים וללבוש כפפות סטריליות לאורך הניתוח. להרדים את העכבר על ידי הזרקה תוך הצפק של פתרון של קטמין 10 מ"ג / מיליליטר + 1 מ"ג Xylazine /מיליליטר מדולל PBS: (50 עד 100 μl לכל 10 גרם משקל גוף), תוך שימוש במזרק 1 מיליליטר. ודא הרדמה על ידי בדיקת חוסר רפלקסים interdigital. מניחים ירידה של ג'ל הידרו-Optimune על כל עין כדי למנוע יובש במהלך הרדמה.
   הערה: הפתרון צריך להיות מוכן מראש, חימם בטמפרטורת חדר לפני ההזרקה. ההרדמה נמשכת לפחות 20 דקות. התואר של הרדמה צריך להיות מבוקר לאורך כל הניתוח. ההרדמה יכולה להיות ממושכת על ידי הזרקה תוך הצפק של מחצית מנה בכל 20 דקות.
2. מניחים את העכבר בצד הימני שלה, תחת זרימת lamina מכסה המנוע אופקי. לעקר את שדה הניתוח עם 70% אתנול ו -10% פתרון dermic יודיד. עם חלק מלקחיים שיער העכבר לאורך אורך 2 סנטימטר מעל המשותף של הרגל האחורית. לגלח את אזור הניתוח.
3. עם אזמל, להפוך סנטימטר אורך חתך 1.5, הרקמה עורית הראשונה, ולאחר מכן עם מספריים לחתוך את רקמת השריר. החל לחץ קל לשני הצדדים של החתך, שיאלץ את הכליות מתוך חלל הבטן.
4. החל מלוח עם כותנה-ניצן לשמור הכליות לחות. אם יש לך קשיים בחשיפת האיבר, להשתמש במלקחיים שטוחים לשלוף את רקמת adipocyte מסביב שלכליות מחוברת. לשמור על הכליות מתוך חלל retroperitoneal ידי ניצן כותנה ממוקם מתחת לאיבר.
5. עם שני מלקחיים עדינים, לעשות חור 2-3 מ"מ בכמוסה (להימנע מלגעת parenchyma כדי למנוע דימום). במהלך ההליך הכירורגי כל לשמור על הקפסולה הכליות החשופה הטבולה ברציפות.
6. הכנס בזהירות את האונות תחת הקפסולה הכליות, על ידי שמירה על הקיר של הקפסולה נפתחה והחלק את השתל מתחת לכמוסה לכיוון קוטב הקצה. הנח עד 6 אונות לכליות.
7. החלף את הכליות בחלל רטרו הצפק. לתפור את aponeuroses השריר, אז עור עם קשרים מנתח בודדים. להרטיב את הפצע עם 10% פתרון povidone יודיד. מניחים את העכבר על הרשות הפלסטינית מחוממתד ב 37 מעלות צלזיוס.
8. סקר העכבר המושתל עד להחלמה מלאה מן ההרדמה על ידי שליטה על תנועות לב, נשימה וזיף, צבעי רירית עד להחלמה מוחלטת נתפסה על ידי עצמי כלולה תנועות.
   הערה: אנו ממליצים הזרקה של פתרון כאבים שרירים פנים (Buprenorphin, 0.1 מ"ג / קילוגרם) רק לאחר הניתוח ולאחר ניתוח 2 ימים כדי למנוע כאב שלאחר הניתוח.
9. שמור את החיה פעלה בבידוד עד התאושש לחלוטין. בדוק בכל יום אחר התפרים של הפצע כדי לוודא ולמנוע זיהום. מעולם לא נצפה זיהום פצע הבא בהליך זה.
   הערה: ניתוח שבועי של תאי דם היקפיים מCD3 ^{- / -} עכברים מורכבים מאפשרים לנו לזהות את הרתי אוכלוסיות נובעות מקור משני אבות E13 או E18 באמצעות סמן CD45 allotypic ושושלת תא T נוגדנים ספציפיים (איור 3).

9. ניתוח של צאצאי TSP על ידי cytometry הזרימה

1. להקניט FTOCs בנפרד כדי להשיג השעיות תא בודדות (ראה סעיף פרוטוקול 4).
2. השעיות תא כתם מאונות בודדות עם תערובת נוגדנים המכילה נוגדני הכרת CD45.1 PECy7, CD45.2 AmCyan, CD4 APCCy7, CD8 APC, CD3 פסיפיק בלו, Vγ5 FITC, Vδ1 PE והדגירה כאמור בסעיף 5.
3. להשעות מחדש את התאים בHBSS יודיד FCS + 1% + propidium ולנתח בcytometer זרימה (ראה תוצאות באיור 2).

תוצאות

כדי לבחור שיטה לרוקן אונות הרתי של thymocytes אנדוגני המאפשר הפיתוח הטוב ביותר של אבות התיישבות, השווינו את הרמות של הכינון מחדש של תאי T באונות הרתי יישבו לאחר הקרנה או deoxy-guanosine 5 ימים טיפול (ד-גואה). התוצאות מראות כי בעוד שאין הבדל ביום 9 של תרבות, אונות מוקרנים הכילו יותר ת?...

Discussion

שני מבחני עיקריים ניתן להשתמש כדי לנתח התמיינות תאי T vivo לשעבר. דיווח לאחרונה היא התרבות המשותפת של אבות hematopoietic עם תאי סטרומה בע"מ, OP9, המבטא את ligands של Noth1, דלתא כמו 1 או 4 ^12. Assay 2-D זה קל לביצוע, יעיל ורגיש מאוד, המאפשר ניתוח ב רמת התא הבודד. עם זאת, זה לא תומך בפ...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
90 x 15 mm and 35 x 15 mm plastic tissue culture petri dishes.	TPP	T93100/T9340	Sampling
26GA 3/8 IN 0.45x10mm syringes with needles Beckton-Dickinson Plastipak.	BD Plastipak	300015	Cell suspension
Nylon mesh bolting cloth sterilized 50/50 mm pieces.	SEFAR NITEX	03-100/32	Filtration of cells
Ethanol 70%.	VWR	83801.36	Sterility Actions
Iodide Povidone 10% (Betadine)	MEDA Pharma	314997.8	Sterility Actions
Ketamine 100mg/ml (stock solution)	MERIAL	-	Anesthesic
Xylazine 100mg/ml in PBS (stock solution)	Sigma	X1251-1G	Anesthesic and muscle relaxant
Buprenorphin 0.3mg/ml stock solution	AXIENCE	-	Morphinic analgesic
Ophtalmic gel (0.2% cyclosporin)	Schering-Plough Animal Health	-	Eyes protection
DPBS (+ CaCl2, MgCl2)	GIBCO Life Technology	14040-174	to isolate embryos
HBSS Hanks' Balanced Salt Solution (+ CaCl2, MgCl2)	GIBCO Life Technology	24020-091	to wash out the blood and dissect the embryos
OPTI-MEM I GlutaMAX I	GIBCO Life Technology	51985-026	Medium for cultures
Fœtal Calf serum	EUROBIO	CVFSVF00-0U	additive for cultures
Penicilin and Streptomycin	GIBCO Life Technology	15640-055	Antibiotics for cultures
2 b mercapto ethanol	GIBCO Life Technology	31350010	additive for cultures
LEICA MZ6 Dissection microscope	LEICA	MZ6 10445111	Occular W-Pl10x/23
Cold lamp source	SCHOTT VWR	KL1500 compact	Two goose neck fibers adapted
Silicone elastomer	World Precision Instruments	SYLG184	Dissecting Pad
Spoon, round and perforated	Fine Science Tools	10370-18	Dissection tools
Fine Iris Scissors	Fine Science Tools	14090-09	Dissection tools
Vannas spring Scissors	Fine Science Tools	15018-10	Dissection tools
Forceps : Dumont #5/45 Inox 11 cm	F.S.T.	11253-25	Dissection tools
Two pairs of fine straight watchmakers’ forceps Dumont #5 11 cm fine tips.	Fine Science Tools	11295-20	Dissection tools
Polyamid thread with needle 6-0   C-3 3/8c	ETHICON	F2403	for sutures
Needle-holder	MORIA/F.S.T.	12060-02	for sutures
Heating pad	VWR	100229-100	To maintain mouse temperature during anesthesy
Membrane Isopore RTTPO2500	DUTSCHER	44210	For FTOC
Terasaki 60 wells plates	FISHER	1x270 10318801	For hanging drop technique
Gauze swabs steriles 7.5cmx7.5cm	Hydrex	11522	To apply disinfecting solution
Fluorescence or biotin labelled antibodies	BD Biosciences, Biolegend or e-Biocsiences	Clone Number see table below	Staining cells
MACS Columns/Streptavidin Microbeads	Miltenyi Biotec	130-042-401/130-048-101	Cell depletion
Mice	Charles Rivers Laboratories (CD45.1) and Janvier Labs  (CD45.2)	C57BL/6 CD45.1 OR CD45.2	Source of cells and thymic lobes
Mice	CDTA Orléans, France	CD 3 epsilon Ko CD45.2	Grafting experiment