Характеристика тимуса Поселившись предшественников у эмбрионов мышей, используя<em&gt; В Vivo</em&gt; И<em&gt; In Vitro</em&gt; Анализы

Резюме

This article describes in vivo and in vitro methodology to characterize the thymic settling progenitors by the analysis of the kinetics of generation, phenotype and numbers of their T cell progeny.

Аннотация

Характеризуя тимуса урегулирования предшественники важно понять заранее тимуса этапы развития Т-клеток, важно разработать стратегии для замены Т-клеток в lymphopenic пациентов. Мы изучили тимуса осаждения предшественников из мышиных эмбриональных день 13 и 18 thymi двумя дополнительными в пробирке и в естественных методов, как на основе метода "висячей капли". Этот метод позволил колонизации облученных плода тимуса долей с E13 и E18 / или тимуса предшественников отличаются CD45 allotypic маркеров и таким образом их потомства следующие. Колонизация смешанным населением позволяет анализировать клетки автономные различия в биологических свойств клеток-предшественников, а колонизация или населения удаляет возможные конкурентные давление отбора. Колонизированных тимуса долей также могут быть привиты в иммунодефицитных мышей-самцов-реципиентов, позволяющих анализа зрелого Т-клеток потомства в естественных условиях, например, динамики популяций Тон периферической иммунной системы и колонизации различных органов и тканей. Эмбриональные тимуса культуры органов показало, что E13 предшественники быстро превратился всех зрелых CD3 ⁺ клеток и привело к канонической подмножества γδ Т-клеток, известный как дендритные эпителиальные Т-клеток. Для сравнения, E18 предшественники имеют отсроченный дифференциации и были не в состоянии генерировать дендритные эпителиальные Т-клетки. Контроль периферической крови тимуса привитым CD3 ^{- / -} мышей показали также, что Е18 тимуса отстойные предшественники генерации, со временем, большее число зрелых Т-клеток, чем их коллеги E13, особенность, которая не может быть оценена в краткосрочной перспективе тимуса плода органов культуры.

Введение

Т-лимфоциты, несущие на αβ или γδ T-клеточный рецептор (TCR), дифференцироваться в специальный орган, тимус. Полностью разработан тимус состоит из двух отдельных регионов: коры, где тимуса предшественники развивать и где тимоциты, что продуктивно переставить TCR β и α генов цепи спасенных от запрограммированной смерти (процесс, известный как позитивной селекции); и мозговое вещество, где выбрана тимоцитов слишком сильной реактивности самоуправлениям лигандов удаляются (негативный отбор) ^1,2. Тимуса происходит из эндодермы слоем третьего глотки мешок, который позже в окружении мезенхимальных клеток ^3. Это колонизирована гемопоэтических клеток-предшественников, начиная с эмбриональный день E12 и, после этого, непрерывный набор необходимого для развития Т-клеток нормального ^4. Тимуса иммигранты развиваться через последовательные стадии развития, организованы жестко регулируется программе, инициированной и почтаntained по активации сигнального пути Notch на тимоцитов при взаимодействии с его лигандом, дельта, как 4, экспрессируется на эпителиальных клетках тимуса (ТИК) ^5.

Развитие тимоцитов начинается в так называемой CD4 ^- CD8 ^- дважды отрицательный (DN) этапов. DN тимоцитов может быть далее подразделены в соответствии с выражением CD25 и CD44 в DN1 (CD25 ^- CD44 ^+), DN2 (CD25 ⁺ CD44 ^+), DN3 (CD25 ⁺ CD44 ^-) и DN4 (CD25 ^- CD44 ^-). CD24 (HSA) и CD117 (с-Kit), дополнительно подразделяет отсек dN1 в 5 подмножеств, где DN1a и б соответствуют ранних предшественников тимуса (ETP). Тимоциты переставить TCR δ, β и α цепей на стадии DN и пройти предварительную TCR выбор (DN3-DN4 стадии). Они также транзит в CD4 ⁺ CD8 ⁺ двойной положительный (ДП) отсеке TcR α цепь переставляет до положительного и отрицательного Селеие. На этом этапе большинство тимоцитов устранены, и лишь небольшой процент (3-5%) достигают CD4 ⁺ или CD8 ⁺ Т-клеток зрелых отсек.

Лимфоидной дифференциация путь проходит через этапы, которые генерируют ГСК мультипотентные предшественники (MPP) и лимфоидных грунтовка мультипотентные предшественники (LMPP), которые потеряли эритроцитов и мегакариоцитов потенциальную ^6. LMPP фенотипически определяется отсутствием дифференцированных клеток крови маркеров (род отрицательным, Лин ^-), выражение с-Kit (CD117), SCA-1 и Flt3 / Flk2 (CD135) и отсутствие заметных уровней интерлейкина ( Иллинойс) -7-рецептор α цепи (ИЛ-7rα или CD127). LMPPs дальнейшей дифференциации в общих лимфоидных клеток-предшественников (CLP) ^7, которые на этом этапе потеряли способность генерировать миелоидных клеток. CLP сохранить лимфоцитов (B и Т-клетки), NK клетки, DC и врожденная лимфоидной клетки (ILC) потенциал, и отличаются от LMPP по выражению CD127 и отсутствие высоких уровней SCA-1.

Хотя природа тимуса урегулирования предшественников (TSP) был широко обсуждается ^8, стало ясно, что в последнее время ТСП изменение фенотипа, дифференциация потенциал и функция, на протяжении развития ^9. Мы выступали в пробирке и в естественных условиях анализов для характеристики ПБО, изолированных на FACS сортировки клеток или от E13 (первая волна) или E18 (вторая волна). Эмбриональные тимуса культуры органов (FTOC) с долей тимуса облученных колонизированных равных чисел E13 E18 и предшественников, несущих различные маркеры allotypic, разрешенных после их потомства в аналогичной среде развития и выявленных внутренние свойства клеток, различные между двумя типами клеток-предшественников. Тимуса долей, колонизированных или E13 или E18 TSP позволило развитие без выбора из-за конкуренции между двумя предшественников. В естественных условиях трансплантация колонизированных тимуса долях показали также, что также тон зрелый потомство E13 E18 и ТСП имеют различные биологические свойства в естественных условиях. TSPS от первой волны быстро генерировать Т-клетки, но приводят к низкой численности αβ и γδ Т-клеток. Среди последних мы обнаружили Vγ5Vδ1 дендритные эпителиальные клетки Т (DETC), которые имеют инвариант TcR, мигрируют в эпидермис, где они оказывают функцию в заживлении ран и производятся только во время эмбрионального развития ^10. В отличие от этого, ТСП ​​от второй волны занять больше времени, чтобы произвести большое число TcR ⁺ Т-клеток и не в состоянии генерировать DETC.

протокол

Заявление по этике: все эксперименты проводились в соответствии с Институтом Пастера этики Устава, утвержденного Министерством сельского хозяйства Франции, и с директивами ЕС. Манипулятор с обучением на небольшой операции грызунов, заверенная французского министерства сельского хозяйства, выполняет все хирургические вмешательства.
ПРИМЕЧАНИЕ: См в приложении таблице 1 показаны процедуры 5-ступенчатую плана.

1. Выбор эмбрионов

1. Используйте 36 C57BL / 6 CD45.2 женщин, 12 женщины CD45.1, 12 C57BL / 6 CD45.1 мужчин и 12 C57BL / 6 CD45.2 мужчин. Пересечение самок либо с мужской генотип будет производить эмбрионы CD45.1 / 2 и CD45.1 используется в качестве источника TSP или CD45.2 используемого в качестве источника получателей тимуса долей. Дом все мужчины отдельности.
2. Для получения эмбрионов для изоляции E18 TSP, 2 место самок в клетке с одной мужской CD45.1 в 6 часов вечера, 21 дней до эксперимента прививки. Проверьте наличие вагинальной пробки следующий день, до полудня. SepaОцените подключенный самок.
3. Для получения эмбрионов E14 быть колонизирована TSP, повторите процедуру, описанную выше (1,2), используя самцов CD45.2, за 17 дней до эксперимента прививки.
4. Для получения эмбрионов, чтобы изолировать E13 TSP, повторите процедуру, описанную выше (1,2), используя самцов C57BL / 6 CD45.1, 16 дней до эксперимента прививки.

2. Рассечение эмбрионов Под горизонтальной ламинарного потока Hood

ПРИМЕЧАНИЕ: За два дня до эксперимента прививки.

1. Жертвоприношение беременных путем смещения шейных позвонков или прогрессивной администрации СО ₂ в течение по меньшей мере 5 мин, в закрытой камере насыщения. Убедитесь, смерть окончательного ареста сердечно-дыхательных движений. Намочите живота с 70% этанола.
2. Сделайте продольный разрез в коже в средней линии живота и откройте его, потянув кожу друг от друга. Откройте брюшины щипцами и ножницами, не касаясь пищеварительный тракт. Вытяните бифидобактерий Uterнам и отделить его от влагалища с ножницами.
3. Поместите матку в 90 х 15 мм чашки Петри, содержащей 40-50 мл DPBS и сократить трансверсально между децидуальной каждого эмбриона.
4. С парой тонких ножниц наконечником и тонких щипцов удалить мышечную оболочку матки, вынуть эмбрионов путем разрезания между плацентой и желточного мешка, и снимите amnios, который подпорных эмбрионов.
5. Поместите эмбрионов в чашке Петри 90 х 15 мм, содержащие HBSS + 1% фетальной телячьей сыворотки (FCS). Для эмбрионы старше E15, удалить головы с ножницами перед дальнейшей диссекции.

3. Выделение тимуса

1. Под увеличительным стеклом бинокулярного, поместите эмбриона, лежа в положении лежа на спине (вид снизу), на мокрой марли постельные принадлежности.
2. Вставьте один пинцет в продольном направлении вдоль хряща грудины, зажать и открыть грудной сетку. С изогнутыми щипцами, тянуть грудной стенки в сторону, чтобы визуализировать тhymic выступов на каждой стороне трахеи.
3. Тщательно провести каждый лепесток, зажимая под с тонким пинцетом и поместить их в чашку Петри, содержащую 1 мл HBSS + 1% FCS. Изолировать мочки и удалить соединительную ткань, окружающую с двумя 1 мл шприцев + 26 г ⅜ "иглы, не повреждая капсулу.
4. Промыть долей в 3 мл HBSS + 1% FCS, чтобы устранить клетки крови.
   Примечание: Перед E15, тимуса лопасти расположены на каждой стороне трахеи и последующего предохранителей в середине, чтобы составить би-долевой орган.

4. Клеточные суспензии

1. Дразнить кроме мочки под бинокулярной лупой, с двумя иглами 26 G, установленных на 1 мл шприцы, в HBSS + 1% FCS. Фильтр клеточной суспензии через нейлоновое сито.

5. Окрашивание флуоресцентными антителами и сортировки клеток

ПРИМЕЧАНИЕ: Все антитела ранее титруют для получения оптимального определение популяции (titratион может меняться в зависимости от партии антител).

1. Инкубируйте тимоцитов (E13 или E18) в течение 15-30 мин при 4 ° С с 100 мкл коктейля биотинилированных антител для окрашивания клональные положительных клеток (анти-CD19, анти-Gr1, анти-Ter119, анти-NK1.1 , анти-CD11c, анти-CD3, анти-CD4, анти-CD8, анти-CD25).
2. Смыть избытка антител спин вниз трубы с 4 мл HBSS + 1% FCS в 280 мкг в течение 7 минут, устранить супернатант и ресуспендирования осадка в пресной HBSS + 1% FCS. Повторите центрифугирования.
3. Инкубируйте биотин-меченых клеток E18 стрептавидином микросфер в течение 15 мин при 4 ° С и промыть клетки дважды HBSS в 1% FCS. Повторное приостановить клеток в 2 мл HBSS + 1% FCS. Большинство тимоциты E13 являются Lineage отрицательным и, следовательно, не нужно MACS обогащение до сортировки клеток.
4. Pass клеток на колонке LS, в соответствии с инструкциями изготовителя. Когда все клеточной суспензии введен в столбце добавить 2 мл HBSS + 1% FCS. Восстановление4 мл колонке течь через центрифугу и клетки в течение 7 минут при 280 х г.
5. Повторное приостановить гранул либо обедненным E18 или E13 общего тимоцитов в 50 мкл смеси антител TSP (анти-CD117 APC, анти-CD135 ПЭ, анти-CD127 PECy7, анти-CD24 FITC, анти-CD44 APCCy7 и стрептавидином Pacific Blue ) и инкубируют в течение 20 мин при 4 ° С в темноте.
6. Вымойте клеток с 4 мл HBSS + 1% FCS и вновь приостановить клеток в 1 мл HBSS + 1% FCS с пропидийиодидом.
7. Сортировать TSPS Лин ^- CD44 ⁺ CD117 ⁺ CD24 ⁺ CD127 ^низкий CD135 ⁺ клеток в FACS (с 4 лазеров) на 1,5 мл пробирки, содержащие 200 мкл полной среды + 20% FCS. Ворота первые клетки в зависимости от их размера и степени детализации на FSC и SSC каналов. Устранить мертвые клетки (окрашивание пропидийиодидом), ворота из дублеты и забить флуоресценцию в показательных масштабах. Около 100 или 600 TSPS могут быть получены из одного E13 или E18 одной тимуса, respectivЭли.

6. Колонизация E14 тимуса Лопасти с прародителей: капля крови Техника

1. Облучают (30 Грейс = 30 Гр) E14 тимуса долей от эмбрионов CD45.2, 3 ч до культуры.
   ПРИМЕЧАНИЕ: E14 E15 или тимуса доли были успешно использованы в качестве получателя Т-клеток-предшественников. Использование получателей тимуса долей поздних гестационный дней приводит преждевременной некроза в связи с большим размером органа, а тимуса долей на более ранних сроках беременности дней развиваются слабо, вероятно, из-за неполного развития эпителиальных клеток.
2. Центрифуга сортируются ОТУ и повторно приостанавливать клеток в культуральной среде (OPTI-MEM полной среде с 10% FCS, пенициллина (50 единиц / мл), стрептомицин (50 мкг / мл) и 2β-меркаптоэтанола (50 мкм)), таких, что 35 мкл содержит 500 ПБО.
3. Поместите каплю 35 мкл клеточной суспензии и каждый из 60 также Тарасаки пластины.
   Примечание: 35 мкл капли могут сливаться, если они размещены в смежных скважин.
4. Поместите один лепесток облученного на поверхности каждой капли. Закройте TERASAKI пластину и поверните пластину вниз, чтобы клетки достигают апикальной полюс капли под действием силы тяжести.
5. Хит осторожно верхняя сторона перевернутой пластиной, чтобы заставить лопасти, чтобы скользить к апикальной краю капли. Инкубируйте перевернутой Тарасаки пластины в увлажненном инкубаторе в течение 48 ч при 37 ° C ± 5% CO _2. После колонизации, либо культуры E14 thymi в FTOC ⁷ или трансплантата под почечную капсулу реципиентной взрослой мыши ^8.

7. эмбрионального тимуса Орган Культура

1. Поместите 3 мл полной среды на 35 мм чашки Петри. Разместить isopore мембранный фильтр с плавающей на носителе. Поместите восстановленные долей на краю мембраны с пинцетом (не более 8 выступов на одной мембраны).
2. Поместите чашки Петри, содержащие тимуса долей в чашку Петри 90 мм, вместе с 35-мм блюдо, без крышки, содержащую 2 мл водоснаг, чтобы обеспечить оптимальную влажность. Выдержите 12 дней при 37 ° C ± 5% CO _2.

8. Прививки Под почечную капсулу в стерильных условиях

Примечание: паренхима почек окружена соединительной ткани, образующего капсулу. Суб-капсульного область особенно богата кровеносными и лимфатическими сосудами, таким образом, обеспечивая благоприятную среду для развития трансплантатов (например тимуса долей, панкреатических островков или новорожденных сердца). Трансплантаты обычно делается на левой почки, потому что это более доступным, чем правой почки. CD3 ^{- / -} мышей-самцов были использованы в качестве получателей, таким образом, избежать РТПХ из-за незначительных антигенов гистосовместимости, связанных с Y-хромосоме, потому что определение пола, прежде чем E15 не легко сделать.

1. Стерилизовать инструменты и носить стерильные перчатки вдоль хирургии. Обезболить мышь, внутрибрюшинной инъекции раствора кетамина 10 мг / мл + Ксилазин 1 мг /мл разведенного в PBS: (от 50 до 100 мкл на 10 г веса тела), используя 1 мл шприц. Проверьте анестезии, проверяя отсутствие межпальцевых рефлексов. Поместите каплю гидро-Optimune геля на каждый глаз, чтобы предотвратить сухость во время анестезии.
   ПРИМЕЧАНИЕ: решение должно быть подготовлено для немедленного и нагревают при комнатной температуре перед инъекцией. Анестезия длится по меньшей мере 20 мин. Степень анестезии следует контролировать по всей операции. Анестезия может быть продлен внутрибрюшинной инъекции дозы половине каждого 20 мин.
2. Наведите на правой стороне, под горизонтальной капотом пластинка потока. Стерилизовать хирургическое поле с 70% этанола и 10% йодида дермы решения. С щипцов части волос мыши по длине 2 см чуть выше сустава задней ноги. Бритье хирургическую область.
3. С помощью скальпеля, сделать надрез на 1,5 см длины первого, кожной ткани, а затем с ножницами вырезать мышечную ткань. Нанесите небольшое давление к обеим сторонам разреза, Который заставит почку из брюшной полости.
4. Применить раствор ватным почкой, чтобы сохранить почку влажной. Если у вас есть трудности в разоблачении орган, использовать плоские щипцы, чтобы вытащить окружающей адипоцитов ткани, к которой прикреплен почек. Поддержание почку из забрюшинного полости с помощью ватного тампона помещен под орган.
5. С двумя тонких щипцов, сделать 2-3 мм отверстие в капсуле (не касаясь паренхимы, чтобы предотвратить кровотечение). В течение всего хирургического вмешательства держать открытую капсулу почки постоянно увлажняется.
6. Вставка тщательно лепестки под почечную капсулу, при поддержании стенки капсулы открыт, и скользить трансплантата под капсулой к краю полюса. Поместите до 6 лепестков на почки.
7. Замените почку в ретро-перитонеального полости. Шовный мышечные апоневрозов, то кожу с отдельными хирург узлов. Намочите рану 10% йодида раствор повидон. Наведите на нагретой годовыхд при 37 ° С.
8. Рассмотрите не пересаженных мышь до полного выхода из наркоза по контролю сердечных, респираторных и усов движений, слизистой цветов до полного восстановления видел себя не содержащихся движения.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Мы рекомендуем инъекцию обезболивающего раствора (Buprenorphin, 0,1 мг / кг) внутри мышц сразу после операции и 2 дня после операции, чтобы предотвратить послеоперационной боли.
9. Держите управляется животное в изоляции до полного восстановления. Осмотрите каждый день стежки раны, чтобы проверить и предотвратить инфекцию. Никогда не наблюдается раневой инфекции после использования этой процедуры.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Еженедельный анализ клеток периферической крови от CD3 ^{- / -} мышей, привитые позволит нам обнаружить тимуса, полученные популяции возник либо из E13 или E18 предшественников, используя CD45 allotypic маркер и Т-клеток происхождение специфических антител (рисунок 3).

9. Анализ потомства TSP с помощью проточной цитометрии

дразнить FTOCs индивидуально для получения суспензии отдельных клеток (см раздел протокола 4).
1. Пятно клеточные суспензии из отдельных лепестков с смесь антител, содержащие антитела, распознающие CD45.1 PECy7, CD45.2 AmCyan, CD4, CD8 APCCy7 APC, CD3 Pacific Blue, Vγ5 FITC, PE Vδ1 и инкубировать, как описано в разделе 5.
2. Повторное приостановить клеток в HBSS + 1% FCS + пропидий йодида и анализировать в проточном цитометре (см результаты на фиг.2).

Результаты

Для того чтобы выбрать способ истощить тимуса долей эндогенных тимоцитов, позволяющих лучшее развитие колонизации предшественников, мы сравнили уровни Т-клеток восстановления в тимуса долях колонизированных после облучения или 5-дневный дезокси-гуанозин (D-Гуа) лечения. Результаты по...

Обсуждение

Две основные анализы могут быть использованы для анализа Т-клеток дифференциации экс виво. Недавно сообщил в совместное культивирование гемопоэтических клеток-предшественников с стромальных клеток, OP9, выражая лиганды Noth1, дельта, как 1 или 4 ^12. Этот 2-D анализа легко выполнить...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
90 x 15 mm and 35 x 15 mm plastic tissue culture petri dishes.	TPP	T93100/T9340	Sampling
26GA 3/8 IN 0.45x10mm syringes with needles Beckton-Dickinson Plastipak.	BD Plastipak	300015	Cell suspension
Nylon mesh bolting cloth sterilized 50/50 mm pieces.	SEFAR NITEX	03-100/32	Filtration of cells
Ethanol 70%.	VWR	83801.36	Sterility Actions
Iodide Povidone 10% (Betadine)	MEDA Pharma	314997.8	Sterility Actions
Ketamine 100mg/ml (stock solution)	MERIAL	-	Anesthesic
Xylazine 100mg/ml in PBS (stock solution)	Sigma	X1251-1G	Anesthesic and muscle relaxant
Buprenorphin 0.3mg/ml stock solution	AXIENCE	-	Morphinic analgesic
Ophtalmic gel (0.2% cyclosporin)	Schering-Plough Animal Health	-	Eyes protection
DPBS (+ CaCl2, MgCl2)	GIBCO Life Technology	14040-174	to isolate embryos
HBSS Hanks' Balanced Salt Solution (+ CaCl2, MgCl2)	GIBCO Life Technology	24020-091	to wash out the blood and dissect the embryos
OPTI-MEM I GlutaMAX I	GIBCO Life Technology	51985-026	Medium for cultures
Fœtal Calf serum	EUROBIO	CVFSVF00-0U	additive for cultures
Penicilin and Streptomycin	GIBCO Life Technology	15640-055	Antibiotics for cultures
2 b mercapto ethanol	GIBCO Life Technology	31350010	additive for cultures
LEICA MZ6 Dissection microscope	LEICA	MZ6 10445111	Occular W-Pl10x/23
Cold lamp source	SCHOTT VWR	KL1500 compact	Two goose neck fibers adapted
Silicone elastomer	World Precision Instruments	SYLG184	Dissecting Pad
Spoon, round and perforated	Fine Science Tools	10370-18	Dissection tools
Fine Iris Scissors	Fine Science Tools	14090-09	Dissection tools
Vannas spring Scissors	Fine Science Tools	15018-10	Dissection tools
Forceps : Dumont #5/45 Inox 11 cm	F.S.T.	11253-25	Dissection tools
Two pairs of fine straight watchmakers’ forceps Dumont #5 11 cm fine tips.	Fine Science Tools	11295-20	Dissection tools
Polyamid thread with needle 6-0   C-3 3/8c	ETHICON	F2403	for sutures
Needle-holder	MORIA/F.S.T.	12060-02	for sutures
Heating pad	VWR	100229-100	To maintain mouse temperature during anesthesy
Membrane Isopore RTTPO2500	DUTSCHER	44210	For FTOC
Terasaki 60 wells plates	FISHER	1x270 10318801	For hanging drop technique
Gauze swabs steriles 7.5cmx7.5cm	Hydrex	11522	To apply disinfecting solution
Fluorescence or biotin labelled antibodies	BD Biosciences, Biolegend or e-Biocsiences	Clone Number see table below	Staining cells
MACS Columns/Streptavidin Microbeads	Miltenyi Biotec	130-042-401/130-048-101	Cell depletion
Mice	Charles Rivers Laboratories (CD45.1) and Janvier Labs  (CD45.2)	C57BL/6 CD45.1 OR CD45.2	Source of cells and thymic lobes
Mice	CDTA Orléans, France	CD 3 epsilon Ko CD45.2	Grafting experiment