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Method Article
This article describes in vivo and in vitro methodology to characterize the thymic settling progenitors by the analysis of the kinetics of generation, phenotype and numbers of their T cell progeny.
Caractériser thymiques régler progéniteurs est important de comprendre les étapes de pré-thymiques du développement des cellules T, essentiels pour élaborer des stratégies pour le remplacement des cellules T chez les patients lymphopéniques. Nous avons étudié thymique régler progéniteurs de murin jour embryonnaire 13 et 18 thymus par deux complémentaires in vitro et in vivo techniques, tous deux basés sur la méthode "goutte suspendue". Cette méthode a permis de coloniser irradiés lobes thymiques foetaux avec E13 et / ou E18 progéniteurs CD45 thymiques distingués par marqueurs allotypiques et suivants de leur progéniture ainsi. La colonisation par des populations mixtes permet d'analyser les différences cellulaires autonomes dans les propriétés biologiques des progéniteurs tandis colonisation soit avec la population supprime possibles pressions sélectives compétitifs. Les lobes thymiques colonisés peuvent également être greffés chez des souris immunodéficientes bénéficiaires masculins permettant l'analyse de la descendance maturité des cellules T in vivo, tels que la dynamique des populations de til périphérique système immunitaire et la colonisation de différents tissus et organes. Des cultures d'organes thymiques foetaux révélé que progéniteurs E13 développées rapidement dans tous maturité cellules CD3 + et ont donné lieu à la sous-ensemble de cellules T γδ canonique, connu sous le nom de cellules T épithéliales dendritiques. En comparaison, les progéniteurs E18 ont un retard de différenciation et ont été incapables de générer des cellules dendritiques T épithéliale. La surveillance de sang périphérique de CD3 thymus greffé - / - souris en outre montré que les progéniteurs E18 thymique décantation génèrent, avec le temps, un plus grand nombre de cellules T matures que leurs homologues E13, une caractéristique qui n'a pas pu être apprécié dans le thymus du fœtus à court terme des cultures d'organes.
Lymphocytes T, portant le αβ ou le récepteur de lymphocytes T γδ de (TcR), se différencient dans un organe spécialisé, le thymus. Le thymus entièrement développé est divisé en deux régions distinctes: le cortex, où progéniteurs thymiques se développent et où thymocytes qui réarrangent productive les β TCR et gènes de la chaîne α sont sauvés de la mort programmée (un processus connu sous le nom sélection positive); et la moelle, où sélectionné thymocytes trop forte réactivité aux auto-ligands sont supprimés (sélection négative) 1,2. Le thymus est originaire de la couche endodermique de la troisième poche pharyngienne qui est ensuite entouré par trois cellules mésenchymateuses. Il est colonisée par les progéniteurs hématopoïétiques à partir de jour embryonnaire E12 et, par la suite, le recrutement continue T est requis pour le développement des cellules normales 4. Immigrés thymiques évoluent par étapes de développement successives, orchestrée par un programme strictement réglementé, initié et maintained par l'activation de la voie de signalisation Notch dans les thymocytes lors de l'interaction avec son ligand, comme delta 4, exprimé sur les cellules épithéliales thymiques (CET) 5.
le développement de Thymocyte commence au CD4 dite - CD8 - Double Negative (DN) étapes. Thymocytes DN peuvent être subdivisés selon l'expression de CD25 et CD44 dans DN1 (CD25 - CD44 +), DN2 (CD25 + CD44 +), DN3 (CD25 + CD44 -) et DN4 (CD25 - CD44 -). CD24 (HSA) et CD117 (c-kit) subdivise le compartiment DN1 en 5 sous-ensembles où DN1A et b correspondent aux progéniteurs thymiques précoces (ETP). Thymocytes réorganiser les δ, β et α chaînes de TCR au stade DN et subissent pré-TcR sélection (stades DN3-DN4). Ils ont en outre en commun pour le CD4 + CD8 + double positif (DP) compartiment où la chaîne α TcR réorganise avant sele positif et négatifction. A ce stade, la plupart des thymocytes sont éliminés et seulement un faible pourcentage (3-5%) atteignent la CD4 + ou CD8 + T matures compartiment cellulaire.
La voie de différenciation lymphoïde progresse à travers les étapes de la CSH qui génèrent des progéniteurs multipotentes (MPP) et les progéniteurs lymphoïdes multipotentes amorcée (PPSP) qui ont perdu des érythrocytes et le potentiel 6 mégacaryocytes. PPSP sont phénotypiquement définie par l'absence de marqueurs de cellules sanguines différenciées (lignée négative, Lin -), l'expression de c-Kit (CD117), Sca-1 et Flt3 / flk2 (CD135) et l'absence de taux détectables de l'interleukine ( IL) -7 récepteur α chaîne (IL-7rα ou CD127). LMPPs différencient en précurseurs communs lymphoïdes (CLP) 7 qui à ce stade ont perdu la capacité de générer des cellules myéloïdes. CLP conserver lymphocytes (cellules B et T), cellules NK, DC et la cellule lymphoïde innée (CIT) de potentiel, et diffèrent de PPSP par l'expression de CD127 et l'absence de niveaux élevés de Sca-1.
Bien que la nature des thymiques régler progéniteurs (TSP) a été largement débattue 8, il est récemment devenu clair que TSP changement phénotype, le potentiel et la fonction de différenciation, tout au long du développement 9. Nous avons effectué in vitro et in vivo pour caractériser la TSP, isolé par la cellule de tri FACS soit E13 (première vague) ou E18 (deuxième vague). Cultures thymiques foetaux d'organes (FTOC) avec lobes thymiques irradiés colonisés par un nombre égal de E13 et E18 progéniteurs, portant différents marqueurs de allotypiques, admis suivant leur progéniture dans un environnement de développement similaire et révélées propriétés intrinsèques cellulaires, différents entre les deux types de progéniteurs. Lobes thymiques colonisés par E13 ou E18 soit TSP permis le développement sans sélection en raison de la concurrence entre les deux progéniteurs. In vivo transplantation des lobes thymiques colonisés en outre montré que aussi til descendance mature de E13 et E18 TSP ont différentes propriétés biologiques in vivo. FST de la première vague de générer rapidement des cellules T, mais donnent lieu à un faible nombre de cellules T αβ et γδ. Parmi ces derniers, nous avons détecté des cellules dendritiques Vγ5Vδ1 épithéliales T (DETC), qui ont un TcR invariant, migrent vers l'épiderme où ils exercent une fonction dans la cicatrisation des plaies et ne sont produites pendant le développement embryonnaire 10. En revanche, TSP de la deuxième vague de prendre plus de temps pour générer des nombres élevés de cellules TcR + T et sont incapables de générer DETC.
Déclaration éthique: toutes les expériences ont été réalisées conformément à la Charte Ethique Institut Pasteur, approuvé par le ministère français de l'Agriculture, et les lignes directrices de l'UE. Un manipulateur avec une formation sur la chirurgie petit rongeur, certifié par le ministère français de l'Agriculture, effectue toutes les interventions chirurgicales.
NOTE: Voir en annexe le tableau 1 montrant la procédure du plan en 5 étapes.
1. La sélection des embryons
2. Dissection du embryons Sous une Horizontal Hotte à flux laminaire
REMARQUE: Deux jours avant l'expérience de greffage.
3. Isolement du Thymus
4. suspensions cellulaires
5. coloration avec des anticorps et des cellules fluorescentes tri
NOTE: Tous les anticorps sont préalablement titrés pour obtenir la définition optimale des populations (le titration peut varier avec le lot d'anticorps).
6. La colonisation de E14 thymique lobes avec progéniteurs: Hanging Technique Goutte
7. fœtale thymique Organ Culture
8. Les greffes sous la capsule du rein dans des conditions stériles
NOTE: Le parenchyme rénal est entouré par du tissu conjonctif formant une capsule. La région sous-capsulaire est particulièrement riche en vaisseaux sanguins et lymphatiques, fournissant ainsi un environnement approprié pour le développement des greffes (par exemple, les lobes thymiques, des îlots pancréatiques ou des cœurs nouveau-nés). Les greffes sont habituellement effectuées sur le rein gauche, car il est plus accessible que le rein droit. CD3 - / - souris mâles ont été utilisés en tant que bénéficiaires évitant ainsi la réaction du greffon contre l'hôte due à des antigènes mineurs d'histocompatibilité liés au chromosome Y parce que la détermination du sexe avant E15 est pas fait facilement.
9. Analyse de la descendance TSP par cytométrie en flux
Afin de choisir une méthode d'épuiser lobes thymiques de thymocytes endogènes permettant le meilleur développement des progéniteurs colonisateurs, nous avons comparé les niveaux de T reconstitution cellulaire dans lobes thymiques colonisés après irradiation ou un désoxy-guanosine 5 jours (d-Gua) traitement. Les résultats montrent que bien qu'il n'y ait pas de différence au jour 9 de la culture, lobes irradiés contiennent plus de cellules T que ceux traités avec d-Gua, au jour 12. Ainsi, l'ir...
Deux principaux essais peuvent être utilisés pour analyser la différenciation des cellules T ex vivo. Le plus récemment rapporté est la co-culture de progéniteurs hématopoïétiques avec des cellules stromales BM, OP9, exprimant les ligands de Noth1, delta comme 1 ou 4 12. Cette analyse 2-D est facile à réaliser, très efficace et sensible, permettant une analyse à le niveau de la cellule unique. Toutefois, il ne soutient le développement des cellules T au-delà de la phase de DP ni la gé...
Les auteurs déclarent qu'ils ont aucun intérêt financier concurrentes.
Soutenu par l'Institut Pasteur, l'Inserm, l'Agence Nationale de Recherche (ANR Grant 'Lymphopoïèse'), le Programme d'investissement REVIVE avenir et «La Ligue contre le cancer".
Name | Company | Catalog Number | Comments |
90 x 15 mm and 35 x 15 mm plastic tissue culture Petri dishes. | TPP | T93100/T9340 | Sampling |
26 G ⅜" 0.45 x 10 mm syringes with needles | BD Plastipak | 300015 | Cell suspension |
Nylon mesh bolting cloth sterilized 50/50 mm pieces. | SEFAR NITEX | 03-100/32 | Filtration of cells |
Ethanol 70%. | VWR | 83801.36 | Sterility actions |
Iodide Povidone 10% (Betadine) | MEDA Pharma | 314997.8 | Sterility actions |
Ketamine 100 mg/ml (stock solution) | MERIAL | Anesthesic | |
Xylazine 100 mg/ml in PBS (stock solution) | Sigma | X1251-1G | Anesthesic and muscle relaxant |
Buprenorphin 0.3 mg/ml stock solution | AXIENCE | Morphinic analgesic | |
Ophtalmic gel (0.2% cyclosporin) | Schering-Plough Animal Health | Eye protection | |
DPBS (+ CaCl2, MgCl2) | GIBCO Life Technology | 14040-174 | to isolate embryos |
HBSS Hanks' Balanced Salt Solution (+ CaCl2, MgCl2) | GIBCO Life Technology | 24020-091 | to wash out the blood and dissect the embryos |
OPTI-MEM I GlutaMAX I | GIBCO Life Technology | 51985-026 | Medium for cultures |
Fetal calf serum | EUROBIO | CVFSVF00-0U | additive for cultures |
Penicilin and streptomycin | GIBCO Life Technology | 15640-055 | Antibiotics for cultures |
2-Mercaptoethanol | GIBCO Life Technology | 31350010 | additive for cultures |
LEICA MZ6 Dissection microscope | LEICA | MZ6 10445111 | Occular W-Pl10x/23 |
Cold lamp source | SCHOTT VWR | KL1500 compact | Two goose neck fibers adapted |
Silicone elastomer | World Precision Instruments | SYLG184 | Dissecting Pad |
Spoon, round and perforated | Fine Science Tools | 10370-18 | Dissection tools |
Fine iris scissors | Fine Science Tools | 14090-09 | Dissection tools |
Vannas spring scissors | Fine Science Tools | 15018-10 | Dissection tools |
Forceps: Dumont #5/45 Inox 11 cm | F.S.T. | 11253-25 | Dissection tools |
2 pairs of fine straight watchmakers’ forceps Dumont #5 11 cm fine tips. | Fine Science Tools | 11295-20 | Dissection tools |
Polyamid thread with needle 6-0 C-3 3/8c | ETHICON | F2403 | for sutures |
Needle-holder | MORIA/F.S.T. | 12060-02 | for sutures |
Heating pad | VWR | 100229-100 | To maintain mouse temperature during anesthesy |
Membrane Isopore RTTPO2500 | DUTSCHER | 44210 | For FTOC |
Terasaki 60 wells plates | FISHER | 1x270 10318801 | For hanging drop technique |
Gauze swabs steriles 7.5 x 7.5 cm | Hydrex | 11522 | To apply disinfecting solution |
Fluorescence or biotin labelled antibodies | BD Biosciences, Biolegend or e-Biocsiences | Clone Number see table below | Staining cells |
MACS Columns/Streptavidin Microbeads | Miltenyi Biotec | 130-042-401/130-048-101 | Cell depletion |
Mice | Charles Rivers Laboratories (CD45.1) and Janvier Labs (CD45.2) | C57BL/6 CD45.1 OR CD45.2 | Source of cells and thymic lobes |
Mice | CDTA Orléans, France | CD 3 epsilon Ko CD45.2 | Grafting experiment |
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