Charakterisierung von Thymic Einschwingzeit Vorläufern in der Mouse Embryo Verwendung<em&gt; In Vivo</em&gt; Und<em&gt; In-vitro-</em&gt; Assays

Zusammenfassung

This article describes in vivo and in vitro methodology to characterize the thymic settling progenitors by the analysis of the kinetics of generation, phenotype and numbers of their T cell progeny.

Zusammenfassung

Charakterisieren Thymus Absetzen Vorläufern ist wichtig, die pre-Thymus Stufen T-Zell-Entwicklung zu verstehen, wesentlich, Strategien für T-Zell-Ersatz in lymphopenischen Patienten zu erstellen. Wir untersuchten Thymus Beilegung Vorläuferzellen aus murinen embryonalen Tag 13 und 18 Thymi durch zwei komplementäre in vitro und in vivo-Techniken, die beide auf der Grundlage des "hängenden Tropfen" Methode. Diese Methode erlaubt besiedeln bestrahlten fetalen Thymus Keulen mit E13 und / oder E18 Thymus-Vorläuferzellen durch CD45 allotypische Marker und damit im Anschluss an ihre Nachkommen aus. Colonization mit gemischter Bevölkerung ermöglicht die Analyse Zell autonomen Unterschiede in biologischen Eigenschaften der Vorläuferzellen während Besiedlung mit entweder Bevölkerung beseitigt mögliche Wettbewerbsselektionsdruck. Die Kolonisierten Thymus Lappen kann auch in immundefizienten männlichen Empfängermäuse ermöglicht die Analyse der reifen T-Zellen-Nachkommen in vivo, wie Populationsdynamik von t aufgepfropft werdener peripheren Immunsystem und Besiedlung von verschiedenen Geweben und Organen. Fötalem Thymus-Organkulturen zeigte, dass E13 Vorläufern entwickelt sich rasch in alle reifen CD3 ⁺ Zellen und führten zu der kanonischen γδ T-Zell-Untergruppe, wie dendritische epithelialen T-Zellen bekannt. Im Vergleich dazu haben E18 Vorläuferzellen eine verzögerte Differenzierung und konnten dendritische epithelialen T-Zellen zu erzeugen. Die Überwachung der peripheren Blut von Thymus-gepfropft CD3 ^{- / -} Mäuse zeigten weiter, dass E18 Thymus Beilegung Vorläuferzellen zu erzeugen, mit der Zeit, eine größere Anzahl von reifen T-Zellen als ihre Gegenstücke E13, eine Funktion, die nicht in der kurzen Frist fetalen Thymus geschätzt werden konnte Organkulturen.

Einleitung

T-Lymphozyten, wobei das αβ oder γδ T-Zell-Rezeptor (TCR), differenzieren in einem speziellen Organ, der Thymus. Die ausgereifte Thymus ist in zwei unterschiedliche Bereiche unterteilt: die Rinde, in der Thymus-Vorläuferzellen entwickeln und wo Thymozyten, die produktiv TCR β und α-Kette-Gene neu anordnen aus programmierten Tod (ein Verfahren, wie die positive Selektion bekannt) gerettet; und der Medulla, wo ausgewählt Thymozyten mit zu starke Reaktivität Selbstliganden werden gelöscht (negative Selektion) ^1,2. Der Thymus stammt aus dem endodermalen Schicht der dritten Schlundtasche, die später von mesenchymalen Zellen ³ umgeben ist. Es wird von hämatopoetischen Vorläuferzellen ab Embryonaltag E12, und danach wird eine kontinuierliche Einstellung für den normalen T-Zell-Entwicklung ⁴ erforderliche besiedelt. Thymus Einwanderer entwickeln durch aufeinanderfolgende Entwicklungsstadien, von einem streng regulierten Programm, initiiert und inszeniert maidurch die Aktivierung des Notch-Signalwegs auf Thymocyten bei Wechselwirkung mit seinem Liganden, wie 4 delta ntained, ausgedrückt Thymusepithelzellen (TECs) ^5.

Thymozyten-Entwicklung beginnt bei der so genannten CD4 ^- CD8 ^- doppelt negativ (DN) Stufen. , DN2 (CD25 ⁺ CD44 ^+), DN3 (CD25 ⁺ CD44 ^-) und DN4 (CD25 ^- CD44 ^{-) -} DN Thymozyten kann weiter gemäß der Expression von CD25 und CD44 in DN1 (CD44 ⁺ CD25) unterteilt werden. CD24 (HSA) und CD117 (c-Kit) weiter unterteilt die DN1 Fach in 5 Untergruppen, wo DN1A und b entsprechen frühen Vorläuferzellen des Thymus (ETP). Thymozyten neu anordnen TCR δ, β und α-Ketten an der DN Bühne und pre-TcR Auswahl (DN3-DN4 Stufen) zu unterziehen. Sie Transit auf die CD4 ⁺ CD8 ⁺ doppelt positiven (DP) Fach, in dem der TCR α-Kette lagert sich vor der positiven und negativen selection. In dieser Phase am meisten Thymozyten eliminiert werden und nur ein kleiner Anteil (3-5%) zu erreichen, die den CD4 ⁺ oder CD8 ⁺ T-Zellen zu reifen Fach.

Die lymphatischen Differenzierungsweg schreitet durch die Stadien der HSCs, die multipotenten Vorläuferzellen (MPP) und lymphatischen grundiert multipotenten Vorläuferzellen (LMPP), die die Erythrozyten und Megakaryozyten Potential ⁶ verloren zu generieren. LMPP phänotypisch durch das Fehlen von differenzierten Blutzellmarker definiert (Linie negativ, Lin ^-), die Expression von c-Kit (CD117), Sca-1 und Flt3 / Flk2 (CD135) und das Fehlen von nachweisbaren Konzentrationen an Interleukin ( IL) -7-Rezeptor-α-Kette (IL-7rα oder CD127). LMPPs weiter zu differenzieren, die in Stamm lymphatischen Vorläuferzellen (CLP) ^7, dass von diesem Zeitpunkt haben die Fähigkeit, myeloischen Zellen erzeugen verloren. CLP behalten Lymphozyten (B- und T-Zelle), NK-Zelle DC und angeborenen lymphoiden Zelle (ILC) Potential, und unterscheiden sich von LMPP durch die Expression von CD127 und das Fehlen von hohen Sca-1.

Obwohl die Art der Thymus Beilegung Vorläuferzellen (TSP) wurde ausgiebig diskutiert ^8, vor kurzem wurde klar, dass TSP Änderung Phänotyp, Differenzierungspotenzial und Funktion, während der gesamten Entwicklung ^9. Wir führten in vitro und in vivo-Tests, um die TSP, durch FACS-Zellsortierung entweder von E13 (erste Welle) oder E18 (zweite Welle) isoliert kennzeichnen. Fetalen Thymus Organkulturen (FTOC) mit bestrahlten Thymus Lappen kolonisiert durch die gleiche Anzahl von E13 und E18 Vorläuferzellen, die verschiedene allotypische Marker, im Anschluss an ihre Nachkommen in einer ähnlichen Entwicklungsumgebung erlaubt und offenbarte Zelle innewohnenden Eigenschaften, unterschiedlich zwischen beiden Arten von Vorläuferzellen. Thymus Lappen entweder E13 oder E18 TSP kolonisiert erlaubt Entwicklung ohne Selektion aufgrund der Konkurrenz zwischen den beiden Vorläufern. In vivo Transplantation der kolonisierten Thymus Lappen weiter gezeigt, dass auch ter reifen Nachkommen von E13 und E18 TSP haben unterschiedliche biologische Eigenschaften in vivo. FDA von der ersten Welle schnell generieren T-Zellen, sondern führen zu geringen Anzahl von αβ und γδ T-Zellen. Unter den letzteren entdeckten wir Vγ5Vδ1 dendritischen epithelialen T-Zellen (DETC), die eine Invariante TcR, wandern in die Epidermis, wo sie eine Funktion, bei der Wundheilung ausüben und werden nur während der Embryonalentwicklung ¹⁰ hergestellt haben. Im Gegensatz dazu TSP aus der zweiten Welle zu nehmen längere Zeit, um eine hohe Zahl von TcR ⁺ T-Zellen zu erzeugen und sind unfähig, DETC generieren.

Protokoll

Ethics Hinweise: Alle Experimente wurden nach dem Pasteur-Institut Ethik-Charta, von der Französisch Landwirtschaftsministerium genehmigt durchgeführt und an die EU-Richtlinien. Ein Manipulator mit Training am Kleintier-Chirurgie, von der Französisch Ministerium für Landwirtschaft zertifiziert, führt alle chirurgischen Eingriffen.
HINWEIS: Siehe Anhang in Tabelle 1, die das 5-Stufen-Plan Verfahren.

1. Auswahl der Embryonen

1. Verwenden Sie 36 C57BL / 6 CD45.2 Frauen, 12 Frauen CD45.1, 12 C57BL / 6 CD45.1 Männer und 12 C57BL / 6 CD45.2 Männer. Überschreiten der Weibchen mit entweder männlich Genotyp erzeugen Embryonen CD45.1 / 2 und CD45.1 als Quelle von TSP oder CD45.2 als Quelle des Empfängers Thymus Keulen verwendet. Haus alle Männer einzeln.
2. Embryonen für E18 TSP Isolation zu erhalten, setzen Sie 2 Hündinnen in einem Käfig mit einem Männchen CD45.1 um 6 Uhr, 21 Tage vor dem Pfropfen Experiment. Prüfen Sie das Vorhandensein einer vaginalen Stecker am nächsten Tag, vor Mittag. Sepabewerten die eingesteckt Weibchen.
3. Um E14 Embryonen zu erhalten, die von TSP besiedelt werden, wiederholen Sie den Vorgang oben (1.2), mit Männern CD45.2, 17 Tage vor dem Pfropfen Experiment.
4. Embryonen zu E13 TSP isolieren zu erhalten, wiederholen Sie den Vorgang oben (1.2), mit Männern C57BL / 6 CD45.1, 16 Tage vor dem Pfropfen Experiment.

2. Dissection des Embryos unter einem Horizontal Laminar Flow Hood

Anmerkung: Zwei Tage vor der Transplantation Experiments.

1. Opfern, die schwangeren Frauen durch Genickbruch oder durch fortschreitende Verwaltung von CO _{2 -Gas} während mindestens 5 min, in einem geschlossenen Raum zu sättigen. Achten Sie darauf, den Tod durch endgültige Festnahme von Herz-Kreislauf-Atembewegungen. Befeuchten Sie den Bauch mit 70% Ethanol.
2. Einen Längsschnitt in der Haut an der Mittellinie Bauch und öffnen Sie sie durch Ziehen der Haut auseinander. Öffnen Sie das Bauchfell mit einer Pinzette und Schere, ohne den Verdauungstrakt. Ziehen Sie das gespaltene uteruns und trennen es von der Vagina mit der Schere.
3. Legen Sie die Gebärmutter in einem 90 x 15 mm Petrischale mit 40-50 ml DPBS und schneiden quer zwischen jedem Embryo decidua.
4. Mit dem Paar von feinen Spitze Schere und einer feinen Pinzette entfernen Sie die Muskelmembran der Gebärmutter, nehmen Sie die Embryonen durch Schneiden zwischen der Plazenta und der Dottersack, und entfernen Sie die amnios, die Beibehaltung ist die Embryonen.
5. Zeigen die Embryonen in einer Petrischale 90 x 15 mm enthält HBSS + 1% fötales Kälberserum (FCS). Für Embryonen älter als E15, entfernen Sie die Köpfe mit einer Schere vor jeder weiteren Präparation.

3. Isolierung des Thymus

1. Unter der binokularen Vergrößerungslinse, setzen Sie den Embryo, liegend in Rückenlage (ventral), auf einem nassen Gaze Betten.
2. Legen Sie eine Pinzette in Längsrichtung entlang der Knorpel des Brustbeins, kneifen und öffnen Sie die Brust-Netz. Mit einer gebogenen Pinzette, ziehen Sie den Brustwand zur Seite, um die t visualisierenhymic Nocken an jeder Seite der Luftröhre.
3. Sorgfältig halten jeder Lappen von unterhalb Kneifen mit einer feinen Pinzette und legen Sie sie in eine Petrischale mit 1 ml HBSS + 1% FCS. Isolieren Sie die Lappen und entfernen umgebende Bindegewebe mit zwei 1 ml-Spritzen + 26 G ⅜ "Nadeln, ohne Beschädigung der Kapsel.
4. Waschen der Lappen in 3 ml HBSS + 1% FCS, um Blutzellen zu eliminieren.
   Hinweis: Vor dem E15 sind Thymus Nocken an jeder Seite der Luftröhre und später Sicherung in der Mitte angeordnet, um eine bi-lobar Organ bilden.

4. Zellsuspensionen

1. Necken neben die Lappen unter der binokularen Vergrößerungslinse, mit zwei 26 G Nadeln auf 1 ml Spritzen montiert, in HBSS + 1% FCS. Filtern der Zellsuspension durch ein Nylonnetz.

5. Färbung mit fluoreszierenden Antikörpern und Zellsortierung

HINWEIS: Alle Antikörper werden zuvor titriert, um eine optimale Definition der Bevölkerung (die titrat erhaltenIon kann mit dem Antikörper Charge variieren).

1. Thymozyten (E13 oder E18) für 15-30 min Inkubation bei 4 ° C mit 100 & mgr; l eines Cocktails von biotinyliertem Antikörper an Linie positive Zellen zu färben (anti-CD19, anti-Gr1, anti-Ter119, anti-NK1.1 , anti- CD11c, anti-CD3, anti-CD4, anti-CD8, anti-CD25).
2. Abzuwaschen Überschuss an Antikörpern Spin-Down der Röhrchen mit 4 ml HBSS + 1% FCS bei 280 g für 7 min, Beseitigung des Überstandes und Resuspendieren des Pellets in frischem HBSS + 1% FCS. Wiederholen Sie die Zentrifugation.
3. E18 Biotin-markierten Zellen mit Streptavidin-Microbeads inkubiere 15 Minuten bei 4 ° C und wäscht die Zellen zweimal in HBSS 1% FCS. Wieder die Zellen in 2 ml HBSS + 1% FCS. Esten E13 Thymozyten Linie negativ und daher nicht MACS Anreicherung vor der Zellsortierung benötigen.
4. Leiten die Zellen auf dem LS-Säule gemäß den Anweisungen des Herstellers. Wenn alle die Zellsuspension eingegeben die Säule 2 ml HBSS + 1% FCS. Wiederherstellen der4 ml der Säule durchfließen und Zentrifuge die Zellen für 7 min bei 280 x g.
5. Re-suspendieren des Pellets entweder abgereichertes E18 oder E13 gesamten Thymozyten in 50 ul TSP Antikörper mix (anti-CD117 APC, Anti-CD135 PE, anti-CD127 PECy7, anti-CD24-FITC, anti-CD44 APCCy7 und Streptavidin Pacific Blue ) und Inkubation für 20 min bei 4 ° C im Dunkeln.
6. Die Zellen werden mit 4 ml HBSS + 1% FCS und Wieder die Zellen in 1 ml HBSS + 1% FCS mit Propidiumiodid.
7. Sortieren Sie die TSPs Lin ^- CD44 ⁺ CD117 ⁺ CD24 ⁺ CD135 CD127 ^{niedrigen +} Zellen in einem FACS (mit 4-Laser) auf eine 1,5-ml-Röhrchen mit 200 ul Vollmedium + 20% FCS. Tor zunächst die Zellen entsprechend ihrer Größe und Granularität auf der FSC und SSC-Kanäle. Eliminieren abgestorbene Zellen (Färbung mit Propidiumjodid), Gate-out Dubletten und Ergebnis der Fluoreszenz in exponentiellen Skalen. Rund 100 oder 600 FDA kann von einem E13 oder E18 ein Thymus, JEWEILIGEN erhältlichEly.

6. Colonization von E14 Thymic Lobes mit Vorläufern: Hanging-Drop-Technik

1. Bestrahlen (30 Grays = 30 Gy) E14 Thymus Lappen aus CD45.2 Embryonen, 3 Stunden, bevor Kultur.
   HINWEIS: E14 oder E15 Thymus Lappen wurden erfolgreich als Empfänger der T-Zell-Vorläuferzellen verwendet. Verwendung Empfänger Thymus Lappen später Schwangerschaftstagen führt zu vorzeitigem Nekrose aufgrund der größeren Größe der Orgel während Thymus-Lappen in früheren Schwangerschafts Tagen entwickeln schlecht, wahrscheinlich aufgrund der unvollständigen Entwicklung der Epithelzellen.
2. Zentrifuge nach FDA und wieder die Zellen in Kulturmedium (OPTI-MEM komplettes Medium mit 10% FCS, Penicillin (50 Einheiten / ml), Streptomycin (50 ug / ml) und 2β-Mercaptoethanol (50 uM)), so daß 35 ul enthalten 500 TSP.
3. Legen Sie eine 35 ul Tropfen Zellsuspension jedes zweite Well einer 60 gut Terasaki Platte.
   HINWEIS: 35 ul Tropfen können fusionieren, wenn sie in zusammenhängende Vertiefungen gegeben werden.
4. Legen Sie einen Lappen auf der bestrahlten Oberfläche jeder Tropfen. Schließen Sie das Terasaki Platte und drehen Sie die Platte auf den Kopf die Zellen des apikalen Pol der Tropfen durch die Schwerkraft erreichen zu lassen.
5. Schlagen Sie vorsichtig die Oberseite der umgedrehten Platte die Lappen zu zwingen, sich an der apikalen Rand des Drop verschieben. Inkubieren des invertierten Terasaki Platte in einem befeuchteten Inkubator für 48 h bei 37 ° C + 5% CO _2. Nach der Kolonisierung entweder Kultur E14 Thymi in FTOC ⁷ oder Transplantat unter die Nierenkapsel eines Empfänger erwachsenen Maus ^8.

7. Fetal Thymic Organ Culture

1. Zeigen 3 ml Vollmedium auf einer 35 mm Petrischale. Ein isoporösen Membranfilter schwimmend auf dem Medium. Platzieren Sie die rekonstituierte Lappen am Rand der Membran mit einer Pinzette (nicht mehr als 8 Keulen auf einer Membran).
2. Legen Sie die Petrischalen mit den Thymus-Lappen in einem 90 mm-Petrischale, zusammen mit einem 35-mm-Schale, ohne Deckel, mit 2 ml water, um eine optimale Luftfeuchtigkeit zu gewährleisten. Inkubiere 12 Tage bei 37 ° C + 5% CO _2.

8. Grafts unter die Nierenkapsel unter sterilen Bedingungen

HINWEIS: Die Nierenparenchyms durch Ausbilden einer Kapsel Bindegewebe umgeben. Der Teilkapsel Region ist besonders reich an Blut- und Lymphgefäße, wodurch ein geeignetes Umfeld für die Entwicklung von Transplantaten (zB Thymus Lappen, Langerhans-Inseln oder Neugeborenen Herzen). Transplantate werden normalerweise auf der linken Niere gemacht, weil sie leichter zugänglich als die rechte Niere ist. CD3 ^{- / -} männliche Mäuse wurden als Empfänger wodurch Transplantat-Wirt-Reaktion aufgrund Nebenhistokompatibilitätsantigene auf dem Y-Chromosom verbunden, weil die Geschlechtsbestimmung vor E15 ist nicht leicht getan verwendet.

1. Sterilisieren der Instrumente und tragen sterile Handschuhe an der Operation. Betäuben der Maus durch intraperitoneale Injektion einer Lösung von Ketamin 10 mg / ml + Xylazin 1 mg /ml in PBS verdünnt (50 bis 100 & mgr; l pro 10 g Körpergewicht), unter Verwendung einer 1 ml-Spritze. Stellen Sie sicher, Anästhesie, indem fehlende Inter Reflexe. Geben Sie einen Tropfen Hydro Optimune Gel auf jedes Auge bis zur Trockenheit während der Narkose zu verhindern.
   HINWEIS: Die Lösung sollte aus dem Stegreif vorbereitet und erwärmt bei Raumtemperatur vor der Injektion werden. Die Betäubung Dauer von mindestens 20 min. Der Grad der Anästhesie sollte entlang der Operation kontrolliert werden. Die Anästhesie kann durch intraperitoneale Injektion von halbe Dosis alle 20 Minuten verlängert werden.
2. Platzieren Sie die Maus auf der rechten Seite, unter einer horizontalen Lamina-Flow-Haube. Sterilisation des Operationsfeldes mit 70% Ethanol und 10% Iodid dermic Lösung. Mit einem Zangenteil die Maus Haare entlang eines 2 cm Länge direkt über dem Gelenk der Hinterhand. Rasieren Sie die OP-Bereich.
3. Mit einem Skalpell, einen Einschnitt 1,5 cm Länge der ersten, der Hautgewebe, dann mit einer Schere das Muskelgewebe. Anwenden eines leichten Druck auf beiden Seiten des Einschnitts, Die die Niere aus der Bauchhöhle zwingen wird.
4. Bewerben Kochsalzlösung mit einem Baumwollknospe, die Nieren feucht zu halten. Wenn Sie Schwierigkeiten bei der Freilegung der Orgel haben, verwenden Sie eine Flachzange, um die umliegende Gewebe Adipozyten, auf die die Niere angeschlossen ziehen. Pflegen Sie die Nieren aus dem retroperitonealen Hohlraum von einem Wattestäbchen unter der Orgel platziert.
5. Mit zwei feinen Pinzette, machen Sie eine 2-3 mm Loch in der Kapsel (berühren Sie nicht die Parenchym um Blutungen zu verhindern). Während des gesamten chirurgischen Eingriffs halten die freiliegenden Nierenkapsel kontinuierlich befeuchtet.
6. Setzen Sie sorgfältig die Lappen unter die Nierenkapsel, durch die Aufrechterhaltung der Wand der Kapsel geöffnet und schieben Sie das Transplantat unter der Kapsel zum Rand Pol. Platzieren Sie bis zu 6 Keulen pro Niere.
7. Ersetzen Sie die Niere in der retro-Bauchhöhle. Naht der Muskel Aponeurosen, dann die Haut mit einzelnen Chirurgen Knoten. Befeuchten Sie die Wunde mit 10% Iodid Povidonlösung. Platzieren Sie die Maus auf einer beheizten pad bei 37 ° C.
8. Umfrage der transplantierten Maus bis zur vollständigen Erholung von der Anästhesie durch Kontrolle der Herz-, Atemwegs- und Whisker-Bewegungen, Schleimhaut-Farben bis zur vollständigen Rückgewinnung von Selbst gesehen enthaltenen Bewegungen.
   HINWEIS: Wir empfehlen Injektion von schmerzstillende Lösung (Buprenorphin, 0,1 mg / kg) intra Muskel direkt nach der Operation und die 2 Tage nach der Operation, um postoperative Schmerzen zu verhindern.
9. Halten Sie das betrieben Tier isoliert, bis vollständig erholt. Untersuchen Sie jeden zweiten Tag die Stiche der Wunde zu überprüfen und zu verhindern Infektion. Nie beobachtet Wundinfektion nach diesem Verfahren.
   HINWEIS: wöchentliche Analyse von peripheren Blutzellen aus dem CD3 ^{- / -} Mäuse aufgepfropft uns erlauben, die Thymus-abgeleiteten Populationen entweder E13 oder E18-Vorläufern unter Verwendung der CD45 allotypische Marker und T-Zelllinie spezifische Antikörper (Abbildung 3) entstand detektieren.

9. Analyse des TSP Nachkommen mittels Durchflusszytometrie

1. Tease die FTOCs individuell auf Einzelzellsuspensionen (siehe Protokoll Abschnitt 4) zu erhalten.
2. Stain Zellsuspensionen aus einzelnen Lappen mit einem Antikörper Mischung, die Antikörper, die CD45.1 PECy7, CD45.2 AmCyan, CD4 APCCy7, CD8 APC, CD3 Pacific Blue, Vγ5 FITC, PE Vδ1 und inkubieren, wie in Abschnitt 5 beschrieben.
3. Wieder die Zellen in HBSS + 1% FCS + Propidiumiodid und in einem Strömungs analysieren Zytometer (siehe Ergebnisse in Figur 2).

Ergebnisse

Um ein Verfahren zum Thymus Keulen endogener Thymozyten ermöglicht die beste Entwicklung der Kolonisierung Vorläufern führen zu wählen, verglichen wir das Niveau von T-Zell-Rekonstitution in Thymus Keulen nach Bestrahlung kolonisiert oder eine 5-Tage-desoxy-guanosin (d-Gua) Behandlung. Die Ergebnisse zeigen, dass, obwohl es keinen Unterschied am Tag 9 der Kultur enthaltenen bestrahlt Lappen mehr T-Zellen als jene mit d-Gua behandelt, am Tag 12. Somit ist die Bestrahlung geeigneter als d-Gua-Behandlung an T-Zell-Entw...

Diskussion

Zwei Assays können verwendet werden, um T-Zell-Differenzierung ex vivo zu analysieren. Die zuletzt gemeldet ist die Co-Kultur von hämatopoetischen Vorläuferzellen mit BM-Stromazellen, OP9, Expression der Liganden der Noth1, delta wie 1 oder 4 ^12. Das 2-D-Assay ist leicht durchzuführen, sehr leistungsfähig und empfindlich, so dass bei Analyse Einzelzellebene. Es wird jedoch weder unterstützt T-Zell-Entwicklung über die Stufe der DP noch die Erzeugung von γδ DETC ^13, die beide eine ...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
90 x 15 mm and 35 x 15 mm plastic tissue culture petri dishes.	TPP	T93100/T9340	Sampling
26GA 3/8 IN 0.45x10mm syringes with needles Beckton-Dickinson Plastipak.	BD Plastipak	300015	Cell suspension
Nylon mesh bolting cloth sterilized 50/50 mm pieces.	SEFAR NITEX	03-100/32	Filtration of cells
Ethanol 70%.	VWR	83801.36	Sterility Actions
Iodide Povidone 10% (Betadine)	MEDA Pharma	314997.8	Sterility Actions
Ketamine 100mg/ml (stock solution)	MERIAL	-	Anesthesic
Xylazine 100mg/ml in PBS (stock solution)	Sigma	X1251-1G	Anesthesic and muscle relaxant
Buprenorphin 0.3mg/ml stock solution	AXIENCE	-	Morphinic analgesic
Ophtalmic gel (0.2% cyclosporin)	Schering-Plough Animal Health	-	Eyes protection
DPBS (+ CaCl2, MgCl2)	GIBCO Life Technology	14040-174	to isolate embryos
HBSS Hanks' Balanced Salt Solution (+ CaCl2, MgCl2)	GIBCO Life Technology	24020-091	to wash out the blood and dissect the embryos
OPTI-MEM I GlutaMAX I	GIBCO Life Technology	51985-026	Medium for cultures
Fœtal Calf serum	EUROBIO	CVFSVF00-0U	additive for cultures
Penicilin and Streptomycin	GIBCO Life Technology	15640-055	Antibiotics for cultures
2 b mercapto ethanol	GIBCO Life Technology	31350010	additive for cultures
LEICA MZ6 Dissection microscope	LEICA	MZ6 10445111	Occular W-Pl10x/23
Cold lamp source	SCHOTT VWR	KL1500 compact	Two goose neck fibers adapted
Silicone elastomer	World Precision Instruments	SYLG184	Dissecting Pad
Spoon, round and perforated	Fine Science Tools	10370-18	Dissection tools
Fine Iris Scissors	Fine Science Tools	14090-09	Dissection tools
Vannas spring Scissors	Fine Science Tools	15018-10	Dissection tools
Forceps : Dumont #5/45 Inox 11 cm	F.S.T.	11253-25	Dissection tools
Two pairs of fine straight watchmakers’ forceps Dumont #5 11 cm fine tips.	Fine Science Tools	11295-20	Dissection tools
Polyamid thread with needle 6-0   C-3 3/8c	ETHICON	F2403	for sutures
Needle-holder	MORIA/F.S.T.	12060-02	for sutures
Heating pad	VWR	100229-100	To maintain mouse temperature during anesthesy
Membrane Isopore RTTPO2500	DUTSCHER	44210	For FTOC
Terasaki 60 wells plates	FISHER	1x270 10318801	For hanging drop technique
Gauze swabs steriles 7.5cmx7.5cm	Hydrex	11522	To apply disinfecting solution
Fluorescence or biotin labelled antibodies	BD Biosciences, Biolegend or e-Biocsiences	Clone Number see table below	Staining cells
MACS Columns/Streptavidin Microbeads	Miltenyi Biotec	130-042-401/130-048-101	Cell depletion
Mice	Charles Rivers Laboratories (CD45.1) and Janvier Labs  (CD45.2)	C57BL/6 CD45.1 OR CD45.2	Source of cells and thymic lobes
Mice	CDTA Orléans, France	CD 3 epsilon Ko CD45.2	Grafting experiment