Inmunofluorescencia indirecta en secciones congeladas de ratón Glándula Mamaria

Resumen

El protocolo de inmunofluorescencia indirecta descrito en este artículo permite la detección y la localización de las proteínas en la glándula mamaria del ratón. Un método completo se da para preparar muestras de glándula mamaria, para llevar a cabo la inmunohistoquímica, a la imagen las secciones de tejido mediante microscopía de fluorescencia, y para reconstruir imágenes.

Resumen

La inmunofluorescencia indirecta se utiliza para detectar y localizar proteínas de interés en un tejido. El protocolo que se presenta aquí describe un método completo y sencillo para la detección inmunológica de las proteínas, el ratón glándula mamaria lactante ser tomado como un ejemplo. Un protocolo para la preparación de las muestras de tejido, especialmente en relación con la disección de glándula mamaria de ratón, la fijación del tejido y de corte de tejido congelado, son detallada. Un protocolo estándar para realizar inmunofluorescencia indirecta, incluyendo una etapa de recuperación de antígeno opcional, también se presenta. La observación de las secciones de tejido marcados así como la adquisición de imagen y post-tratamientos también se indican. Este procedimiento da una visión completa, de la colección de tejido animal a la localización celular de una proteína. Aunque este método general se puede aplicar a otras muestras de tejido, debe ser adaptado a cada tejido / primaria pareja anticuerpo estudiado.

Introducción

La glándula mamaria es un órgano exocrino mamíferos atípica cuya función principal es producir leche para alimentar a los recién nacidos. El desarrollo del tejido mamario se produce principalmente después del nacimiento y se caracteriza por un proceso único en el que el epitelio invade el estroma circundante. Este tejido sufre muchos cambios (crecimiento, diferenciación y regresión), especialmente durante la vida adulta, de forma concomitante con las variaciones en el estado reproductivo (Figura 1). Además de la morfología general de los tejidos, las proporciones de diferentes tipos de células, así como su disposición dentro de la glándula mamaria cambian dramáticamente durante el desarrollo ^1-5.

Durante la vida embrionaria, el epitelio mamario se deriva de las líneas de leche mamarias, que se define por un ligero engrosamiento y la estratificación del ectodermo, entre las extremidades delanteras y traseras a cada lado de la línea media alrededor de día embrionario 10,5 (E10.5) (Figura 1A ).En E11.5, la línea de leche se rompe en placodas individuales, que están simétricamente colocadas a lo largo de la línea de leche mamaria en lugares reproducibles, y el mesénquima que rodea comienza a condensarse. Los placodas comienzan a hundirse más profundamente en la dermis y el mesénquima mamaria organiza en capas concéntricas alrededor de la yema mamaria (E12.5-E14.5). A partir de E15.5, el epitelio mamario, comienza a proliferar y alargadas para formar el brote primario que empuja a través del mesénquima mamaria hacia la almohadilla de grasa. El brote primario desarrolla un lumen hueco con una abertura en la piel, caracterizada por la formación de la vaina pezón. En E18.5, el conducto alargando ha crecido hasta convertirse en la almohadilla de grasa y se ha ramificado en un pequeño sistema ductal arborized englobado en la almohadilla de grasa. El desarrollo es esencialmente detenido y la glándula mamaria sigue siendo rudimentaria morfogenéticamente reposo hasta la pubertad. En el embrión masculino, la activación de los receptores de andrógenos conduce a la degeneración de los brotes, que desaparecenpor E15.5. A partir de E18, desarrollo mamario cesa hasta la pubertad ^6-9.

Al nacer, la glándula mamaria alberga un sistema ductal rudimentaria que se alarga y las ramas lentamente (crecimiento isométrico). En el inicio de la pubertad, estructuras esféricas situadas en las puntas de los conductos llamados los brotes extremas terminales (TEBs), están formados por una capa exterior de las células gorra y un núcleo interior de varias capas de células (células del cuerpo). Estas estructuras son altamente proliferativa y se infiltran en el tejido estromal que rodea en respuesta a señales hormonales. Proliferación dentro de los resultados TEBs en el alargamiento ductal, junto con la morfogénesis de ramificación. Este proceso conduce a la creación de una red arborized epitelial básica que emana de la boquilla (Figura 1B, la pubertad). En ~ 10-12 semanas después del nacimiento, cuando el epitelio ha invadido toda la almohadilla de grasa, su expansión se detiene y desaparece la TEBs. Desarrollo ductal entonces sufre cambios dinámicos, es decir, successive la proliferación y la regresión de las células epiteliales de acuerdo con los ciclos de estro ¹⁰ (Figura 1B, adulto).

Desde el inicio de la gestación, el tejido mamario se somete a un crecimiento importante y cambios morfológicos para prepararse para la lactancia. El epitelio mamario ampliamente proliferar y diferenciarse, lo que lleva a una red túbulo-alveolar altamente ramificado. Al mismo tiempo, las células epiteliales mamarias (MEC) se polarizan y capaz de sintetizar y secretar productos lácteos. MECs se organizan en numerosas estructuras alveolares (acinos) que están rodeados por las células mioepiteliales contráctiles e incorporados en un estroma compuesto por tejido conectivo y adiposo, vasos sanguíneos y terminaciones nerviosas (Figura 1B, embarazo). Además, el lado basal de MECs está en estrecho contacto con la membrana basal (matriz extracelular), y las interacciones entre estas dos entidades fuertemente regular tanto la morfogénesis y la secretora función de la mamary epitelio ^11-13.

Todos estos procesos se basan en la acción de diversas señales ambientales, de los cuales los más importantes son hormones14, factores paracrinos y la matriz extracelular. Por ejemplo, la progesterona induce extensa ¹⁵ y alveologenesis que, en combinación con la prolactina (PRL) de ramificación lateral ^16,17, promueve y mantiene la diferenciación de los alvéolos. Además de los esteroides y PRL18, citoquinas y vías de señalización asociadas con el desarrollo (Wnt y Notch vías de señalización) también están involucrados en el compromiso de linaje mamaria y el desarrollo ^{19 a 21.} Al final del embarazo, las MECs luminales comienzan a producir una leche rica en proteínas conocida como calostro en el lumen de los alvéolos. Además, la progesterona actúa sobre la permeabilidad epitelial y desde las uniones estrechas están todavía abiertos, el calostro también se encuentra en la corriente de la sangre materna.

Después del parto, la Mammary epitelio ocupa casi todo el volumen de la glándula mamaria y está altamente organizada (Figura 2, el epitelio mamario). Unidades productoras de leche, es decir, los alvéolos (Figura 2, alveolus), están formados por una monocapa de células secretoras mamarias epiteliales polarizadas (mESCs), con su membrana plasmática apical delimita el lumen. Los alvéolos se disponen en lóbulos que se agrupan en lóbulos conectados a conductos que drenan la leche al medio exterior (Figura 2, lóbulo). Lactancia ocurre, es decir., MESCs comienzan a secretar cantidades abundantes de leche, provocadas principalmente por la caída de las hormonas placentarias (principalmente progesterona) (Figura 1B, la lactancia). Genes de la proteína de la leche se activan en un curso de tiempo temporal definido que van desde el embarazo hasta la lactancia ^9,22,23, principalmente en respuesta a PRL pituitaria lanzado en el momento de la succión. Al mismo tiempo, los contactos entre mESCs y la matriz extracelular tanto estimulan la leche proteína syntHESIS a través de señales que están mediadas a través de las interacciones entre las integrinas celulares y laminina ^24,25, y suprimen la apoptosis en mESCs ^26,27. Estas vías de señalización conducen a la activación de la proteína de la leche promotores de genes ²⁸ a través de la activación de la transcripción factores específicos ^29. Contactos célula-célula también son importantes para algunos aspectos de la diferenciación entre ellos el establecimiento de la polaridad apical y la secreción vectorial de los productos lácteos. Las uniones estrechas rápidamente cerca después del comienzo de la lactancia y mESCs finamente orquestan la absorción de moléculas de la sangre, así como la síntesis, transporte y secreción de componentes de la leche, en respuesta a las necesidades nutricionales de los recién nacidos. En el momento de la succión, la contracción de las células mioepiteliales que rodean los alvéolos se produce en respuesta a la oxitocina y conduce a la eyección de la leche a través de los conductos y en el pezón. La leche es un fluido complejo que contiene proteínas (principalmentecaseínas), azúcares (principalmente lactosa), lípidos y minerales, así como moléculas bioactivas, tales como inmunoglobulinas A (IgA), factores de crecimiento y hormonas. Las caseínas son sintetizados, ensamblado en estructuras supramoleculares, es decir, micelas de caseína, que se transportan a lo largo de la ruta secretora, y luego liberados por exocitosis, es decir, la fusión de vesículas secretoras que contienen caseína (SV) con la membrana plasmática apical de MESC (Figura 2).

El tráfico intracelular se basa en el intercambio de material entre compartimentos membranosos e implica soluble N-etilmaleimida-Sensible Fusion (NSF) Fijación de proteínas (SNAP) Receptor (SNARE) ^30,31. La familia de proteínas SNARE se subdivide en trampas vesiculares (v-SNAREs), presentes en la membrana de la vesícula, y trampas objetivo (t-SNAREs), localizadas en las membranas de destino. Por comprimir a través de sus dominios de doble arrollamiento, V y T-SNAREs ensamblan para formar una gran estabilidad complejo haz de cuatro hélices, conocidos como XXcomplejo SNARE e. Este complejo promueve la fusión de dos bicapas lipídicas opuestas llevando gradualmente en estrecha proximidad ^30,32. Después, complejos SNARE se disocian por la adenosintrifosfatasa NSF y sus proteínas adaptador de proteínas SNAP y SNARE se reciclan de nuevo a su compartimento de origen ^33. Curiosamente, cada proteína SNARE reside predominantemente en compartimentos celulares distintos y SNARE emparejamiento puede contribuir a la especificidad de los eventos de fusión intracelulares ^34. Estudios previos sugieren que al menos proteína 23 (SNAP23) y asociada a vesículas de membrana de proteínas 8 (VAMP8) y syntaxins (STX) sinaptosomal asociada -7 y -12 juegan un papel en la caseína exocitosis ^35,36. Estas proteínas también se han encontrado en asociación con la fracción lipídica de la leche, es decir, la grasa de la leche glóbulos (MFG) ^37. El modelo imperante actual postula que las gotas de lípidos citoplasmáticos (CLD) se forman por la acumulación de l neutralipids (principalmente triglicéridos y ésteres de esterol) y el colesterol derivado de la dieta materna entre las dos valvas de la membrana ^{38 a 41} retículo endoplasmático (ER). Grandes CLD se forman, al menos en parte, por la fusión de CLD más pequeños mientras son transportados a la parte apical de mESCs donde son liberados como MFG (1-10 micras de diámetro) por gemación, siendo envuelto por la membrana plasmática apical MESC ^40-42. Lactancia cesa después cachorros son destetados y los mESCs mueren progresivamente por apoptosis, lo que lleva a la regresión del tejido mamario de nuevo a un estado puberal (Figura 1B, la involución).

La inmunofluorescencia (IF) es un método de laboratorio de análisis común que se utiliza en casi todos los aspectos de la biología, tanto en investigación como en el diagnóstico clínico. SI técnicas se pueden realizar en las secciones de tejidos (inmunohistoquímica, IHC) o celulares (inmunocitoquímica, ICC) muestras. Este enfoque poderoso basa en el uso de fluorescent-anticuerpos marcados que se unen específicamente (directa o indirectamente) para el antígeno de interés, permitiendo así la visualización de su distribución tejido a través de microscopía de fluorescencia. Las señales de fluorescencia dependen principalmente de la calidad y la concentración de los anticuerpos y el manejo adecuado de la muestra. Un protocolo simple de inmunofluorescencia indirecta (IFI) se presenta para detectar los productos lácteos (caseínas y MFG) y proteínas implicadas en la secreción de producto lácteo (butyrophilin (btn1), proteínas SNARE) en secciones congeladas de tejido mamario de ratón (Figura 3). Aunque este protocolo proporciona una visión completa de IHC, que van desde la recogida de tejidos a la imagen post-tratamiento, crítica y pasos opcionales, así como algunas recomendaciones técnicas también son presentados y discutidos.

Protocolo

Ratones CD1 fueron criados en el INRA (UE0907 IERP, Jouy-en-Josas, Francia). Todos los aspectos éticos del cuidado de los animales cumplen las directrices pertinentes y los requisitos de licencia establecidos por el Ministerio de Agricultura francés. Los procedimientos utilizados fueron aprobados por el comité de ética local (acuerdo 12/097 de la Comethea Jouy-en-Josas / AgroParisTech).

1. Glándula Mamaria Preparación de la muestra

1. Ratón disección de la glándula mamaria
   1. La eutanasia a los ratones en el día 10 de la lactancia por dislocación cervical y el pin al animal con su abdomen hacia arriba.
   2. Mojar la zona ventral con etanol y secar con una toalla de papel.
   3. Con unas pinzas, tire hacia arriba de la piel del abdomen entre las dos patas traseras y hacer una incisión (sólo a través de la piel) de aproximadamente 1 cm con tijeras afiladas. A partir de esta primera incisión, a continuación, utilizar tijeras para cortar la piel hasta el cuello en el ratón. Tire de la piel de la peritoneo y pin abajo de un lado de la piel a la vez, que se extiende enseñó.
   4. Recoger el abdominal y las glándulas mamarias inguinales empujándolos lejos de la piel con un hisopo y finalmente tirar o de corte lejos del peritoneo.
      Nota: En este paso tinción Carmine se puede realizar con el fin de visualizar el epitelio mamario dentro de toda la glándula ^43. Este enfoque puede ser útil para analizar la morfología global de la glándula mamaria en diversas condiciones fisiológicas (etapas de desarrollo, enfermedades, in vivo tratamientos).
   5. Retire el ganglio linfático se encuentra en el cruce de la abdominal y las glándulas inguinales ^44.
2. La fijación del tejido mamario
   1. Cortar el tejido mamario en 3 mm ³ fragmentos con un bisturí e inmediatamente enjuagar estos fragmentos en una solución salina tamponada con fosfato (PBS), pH 7,4, con el fin de eliminar la mayor cantidad de leche posible.
   2. Secar rápidamente los fragmentos en un papeltoalla y ponerlos en una solución de PBS frío que contenía 4% de paraformaldehído (PFA, HCHO, 32% de solución de formaldehído, PRECAUCIÓN) de 10 a 15 minutos en hielo.
      Nota: Este es el tiempo suficiente para permitir el posterior análisis en cortes de tejido mamario por IIF36 y / o hibridación in situ ^45. Sin embargo, como fijadores aldehído penetran bastante lentamente en trozos de tejido (~ 1-3 mm por hora), esta vez podrá ampliarse para asegurar una fijación óptima de la muestra de tejido. Alternativamente, fijar tejidos in vivo por perfusión un animal anestesiado con una solución de fijación (no se detalla en el presente estudio).
3. Infusión de sacarosa
   1. Rápidamente enjuagar los fragmentos mamarias en PBS frío y sumergirlos en una solución de PBS frío que contiene 40% de sacarosa (D-sacarosa, C12H22O11, Sr. 342.3 g / mol) de 16 a 48 horas a 4 ° C bajo agitación suave.
4. Incrustación de tejidos
   Nota: En este paso, los fragmentos mamarias se puede volver a cortar a fin de que fragmentos más pequeños (2-3 mm ³) O para ajustar su forma.
   1. Adecuadamente etiquetar los moldes de plástico y llenar un tercio del volumen del molde con compuesto OCT, se mantiene a RT. Coloque un fragmento (2-3 mm ³⁾ de tejido mamario por molde y cubrir con compuesto de octubre
   2. Coloque los moldes en la superficie del nitrógeno líquido (en una hoja de aluminio o utilizando un tamiz metálico) y permitir que el producto se congele.
      Nota: Debe convertirse en sólido y blanco antes de sumergir el molde en nitrógeno líquido.
5. Almacenar las muestras congeladas a -80 ° C hasta que se realizan cortes de tejido.

2. Seccionamiento tejido congelado

Nota: un criostato, que es esencialmente un microtomo dentro de un congelador, se requiere para hacer cortes de tejido congelados. Una temperatura más baja se requiere a menudo para los tejidos grasos o ricos en lípidos, como la glándula mamaria virginal.

1. Ajuste la temperatura del criostato a -26 ° C y espere hasta que tenga stabilizado. Mantener el bloque de tejido congelado a -26 ° C durante todo el proceso de corte. Absolutamente evitar la descongelación del tejido en cualquier momento durante el procedimiento.
2. Se enfría la cuchilla de afeitar, el soporte de corte, el dispositivo anti-balanceo y el cepillo a -26 ° C por su inclusión en el criostato durante al menos 10 min. También colocar una caja de portaobjetos en el interior del criostato con el fin de ser capaz de almacenar portaobjetos de vidrio como se hacen las secciones.
3. Adecuadamente etiquetar los portaobjetos de vidrio que se utilizan para recoger las secciones de tejido y mantenerlas a temperatura ambiente; de otro modo las secciones de tejido no se adhieren a ellos. Retire la muestra del molde dentro del criostato.
   Nota: El uso de láminas de vidrio con carga positiva favorecerá enormemente la adherencia de las secciones de frescos de tejido congelado debido a la mayor atracción electrostática.
4. Cubrir la superficie de un disco de tejido de metal con compuesto OCT (mantenida a temperatura ambiente) y empuje la muestra congelada en la misma. Coloque el montaje húmedo dentro del criostato y deje que se cool durante al menos 15 min.
5. Colocar la preparación en fresco en el soporte del disco del criostato. Ajuste del grosor de corte de 5-6 micras y, si es posible, use una nueva hoja afilada o al menos cambiar la zona en la hoja utilizada para cortar cada muestra ya algunos tejidos rápidamente se opaca ella.
6. Ajuste la posición del dispositivo anti-vuelco la hoja de afeitar, mediante cortes del medio de montaje hasta que las rodajas se forman de manera uniforme y correcta. Idealmente, el dispositivo antivuelco intervendrá sobre la hoja de afeitar en alrededor de 1 mm.
7. Una vez que los ajustes son correctos, realice cortes de tejido girando la rueda en un movimiento uniforme continua. A menos que la temperatura es ideal, una sección de tejido será, por naturaleza, tratar de acurrucarse.
   1. Use un cepillo para agarrar y maniobrar la sección por el escenario con el fin de colocarlo como desee en el portaobjetos de vidrio. Utilice el cepillo para limpiar los restos posiblemente presentes en el bloque de tejido congelado y / o la hoja de afeitar.
8. Halarla sección de tejido hacia el usuario y evitar presionarla sobre la etapa de criostato. Evite presionar la sección de tejido en el escenario criostato ya que puede conducir a la adherencia de la lámina de tejido en el escenario y por lo tanto la incapacidad para recuperar con el portaobjetos de vidrio.
9. Recuperar secciones de tejido de uno en uno a recogerlos en la superficie de un portaobjetos de vidrio, sosteniéndolo por encima de la sección y en ángulo hacia abajo para tocar la sección de tejido.
   Nota: Las secciones de tejido se adhieren rápidamente al vidrio caliente debido a la atracción estática. Si varias secciones de tejido se colocan en la misma diapositiva, tenga cuidado de no solape ellos y el espacio lo suficiente como para ser capaz de encerrar de forma individual en un círculo hidrofóbica (ver sección 3.1.1.).

3. Inmunofluorescencia indirecta

1. Localización de las secciones
   1. Use una barrera hidrofóbica lápiz para dibujar un círculo alrededor del tejido hidrófobo diapositivas montadas. Deje que el círculo seco durante aproximadamente 1 min a TA. Trace una línea alrededor de la tsecciones problema con un marcador permanente negro fino, así, pero en el lado de la corredera de vidrio opuesto al uno donde las secciones de tejido son.
      Nota: Este círculo es repelente al agua y acetona y alcohol insoluble. Por lo tanto, proporciona una barrera a soluciones acuosas utilizadas durante el procedimiento de IHC y reduce el volumen de reactivos requeridos.
   2. Rehidrate secciones de tejido cubriéndolos con una gota de ~ 250 l de PBS durante unos pocos minutos a TA. Fijar secciones de tejido cubriéndolos con ~ 250 ml de una solución de PFA 3% recién preparado en PBS durante 10 a 15 min.
      Nota: De forma opcional, en este caso, utilice una solución de enfriamiento aldehído cloruro de amonio 50 mM _((NH 4 Cl, Sr. 53,5 g / mol) en PBS o glicina 0,1 M (C ₂ H _{5 NO} 2, el Sr. 75,07 g / mol) en PBS ) para detener la reacción de fijación. Lavado simple y abundante PBS es generalmente suficiente para eliminar aldehído sin reaccionar.
2. La recuperación de antígenos (opcional)
   Nota: Aunque la mayoría de los antígenos pueden ser detectados y sin recuperación de antígeno (AR), otros serán observados sólo si se lleva a cabo este paso. En algunos casos, AR también permite la mejora de la señal observada.
   1. Coloque la solución AR (mM Tris 100 (C ₄ H ₁₁ NO _3, Mr 121,14) 5% de urea (NH ₂ CONH _2, el Sr. 60,06) pH 9,6) en un vaso de precipitados. El volumen de solución AR debe ser suficiente para cubrir completamente los portaobjetos de vidrio colocadas en un soporte de vidrio.
   2. Precalentar la solución AR a 95 ° C mediante el control de la temperatura con un termómetro y luego colocar los portaobjetos de vidrio en un bastidor adecuado, sumergir el bastidor en el tampón caliente, cubierta para limitar la evaporación e incubar durante 10 min a 95 ° C.
   3. Retire el vaso de precipitados del baño de agua y dejar los portaobjetos de vidrio durante otros 10 minutos en el búfer.
3. Inmunodetección
   1. Enjuague secciones de tejido con PBS (~ 250 l / sección) y saturar con una soluciónde 3% de albúmina de suero bovino (BSA, ~ 250 l / sección) en PBS durante al menos 30 min a TA.
   2. Poner un 30-50 l de anticuerpo primario diluido en PBS que contenía 2% de BSA en cada sección de tejido.
      Nota: Este volumen es suficiente para formar una gota que cubre completamente la sección de tejido.
   3. Coloque el mismo volumen de diluyente (2% de BSA en PBS) por sí sola en una sección de tejido para realizar un control negativo sin anticuerpo primario.
      1. Sistemáticamente incluir este control negativo en cada experimento IHC y llevar a cabo para cada anticuerpo secundario utilizado para estimar el fondo del experimento (etiquetado no específica debido a la secundaria de anticuerpos y / o el tejido auto-fluorescencia). Otros tipos de controles positivos o negativos también se pueden realizar para asegurar la especificidad de la etiqueta (ver discusión).
   4. Coloque los portaobjetos de vidrio en una caja humidificado O / N a 4 ° C.
      Nota: Los anticuerpos primarios utilizados fueron monoclonal de ratón anti-citoqueratina8 (CK8, dilución 1:50), monoclonal de ratón anti-citoqueratina 14 (CK14, dilución 1:50), policlonal de conejo caseína anti-ratón (# 7781, 1:50 dilución, generosamente proporcionada por MC Neville, Universidad de Colorado Health Centro de Ciencias, CO, EE.UU.), policlonal de conejo anti-btn1 (1: 300 dilución, generosamente proporcionado por IH Mather, Departamento de Ciencias Animales y aviar, de la Universidad de Maryland, College Park, MD, EE.UU.), policlonal de conejo anti-Stx6 ( dilución 1:50, generosamente proporcionado por S. Tooze, Cancer Research UK, Instituto de Investigación de Londres, Londres, Reino Unido) y conejo policlonal anti-VAMP4 (dilución 1:50).
   5. Lávese bien las secciones de tejido con PBS al menos cuatro veces durante 10 min a RT.
   6. Diluir el anticuerpo apropiado secundario (conjugado con rodamina de cabra anti-IgG de conejo (H + L), 1: 300 dilución) en PBS que contenía 2% de BSA, colocar el 30-50 l de esta solución en todas las secciones de tejido, y se incuba durante 1,5 hr a TA.
      1. Desde fluorocromos son moléculas sensibles a la luz, no lo hagasexponer las secciones de tejido a la luz hasta su análisis. Para IIF en secciones de tejido, favorecer anticuerpos secundarios acoplados a un fluoróforo rojo desde las membranas celulares tienden a generar una auto-fluorescencia verde que puede interferir con el etiquetado baja. Por otra parte, la elección de un anticuerpo secundario acoplado a fluoróforo rojo permite el etiquetado concomitante de lípidos neutros (véase más adelante).
   7. Lave bien las secciones de tejido con PBS por lo menos cuatro veces durante 10 minutos a temperatura ambiente.
4. Post-fijación (opcional)
   1. Para algunos experimentos, realice post-fijación mediante la incubación de las muestras con 2% PFA diluidas en PBS durante 10 min a RT a fin de estabilizar los andamios de antígeno / anticuerpo. Sin embargo, este paso se puede prescindir en la mayoría de los casos.
5. Lípidos neutros y counterstaining ADN
   1. Para visualizar CLD y MFG, color lípidos neutros mediante la incubación de las secciones de tejido en el 30-50 l de una solución de PBS que contenía 3 mg / ml de bodipy 493/ 503 durante 10 min a RT. Rápidamente enjuague secciones de tejido dos veces con PBS.
   2. Contratinción ADN nuclear con un 30-50 l de una solución de PBS que contenía 3 mM de DAPI (4-6-diamidino-2-fenilindol, 5 mg solución madre / ml) durante 10 min a TA. Lávese las secciones de tejido dos veces con PBS antes de montar las diapositivas para la observación.
6. Sección de montaje
   1. Retire PBS y colocar una gota de medio de montaje en cada sección de tejido.
   2. Coloque un lado de la hoja de la cubierta en un ángulo contra la diapositiva, haciendo contacto con el borde exterior de la gota líquida y luego baje la cubierta lentamente, evitar las burbujas de aire. Deje que el líquido se extendió entre el portaobjetos y el cubreobjetos durante unos minutos y luego retirar el exceso de medio de montaje con una toalla de papel.
   3. Sellar el cubreobjetos al portaobjetos de vidrio con secciones esmalte de uñas y tejido se almacena a 4 ° C para evitar su exposición a la luz hasta la observación.

4. Fluorescencia Observación y adquisición de imágenes

Nota: un microscopio de fluorescencia equipado con una cámara se requiere controlado por el software de adquisición de imágenes para observar los resultados de IHC.

1. Antes de la adquisición de imágenes, comprobar la intensidad del etiquetado y evaluar el fondo del experimento observando los controles negativos. Adquirir imágenes de cada marcador fluorescente (canal de color) de forma individual.
2. Adquirir todas las imágenes, incluidas las de los controles correspondientes, en las mismas condiciones (exposición y los ajustes generales) para cada canal de color.
3. Microscopía convencional
   1. Realizar la microscopía de epifluorescencia con un microscopio equipado con filtros estándar de isotiocianato de fluoresceína (FITC, verde), rodamina (rojo) y DAPI (azul) emisiones, × 20 y × 63 (de inmersión en aceite, NA 1.3) objetivos y una cámara de imagen DP50.
4. Microscopía confocal
5. Realizar microscopía confocal con unos microscope equipado con el software ZEN, utilizando × 20 × 63 a (aceite de inmersión, NA 1.4) los objetivos y las longitudes de onda de excitación 488- y 568 nm del láser.

Tratamiento 5. Imagen

Nota: Todas las imágenes post-tratamientos se realizaron con el software libre ImageJ (http://imagej.nih.gov/ij/).

1. Superponer imagen (fusionar)
   1. Abra las imágenes adquiridas en cada canal que se combinará (Archivo / Abrir). Si se trabaja con 8 bits escala de grises, color artificial atribuir a cada canal utilizando la tabla de búsqueda (Tablas de imagen / de búsqueda).
   2. Generar la imagen compuesta a partir de imágenes en escala de grises o de color mediante el comando "Combinar canales" (Imagen / Color / Combinar Canales) y luego atribuir un color a cada canal.
   3. Realice imagen apila superposición de la misma manera con la apertura de pilas adquiridos en cada canal que se combina (Archivo / Abrir) y usando el comando "Combinar canales y# 8221; (Imagen / Color / Combinar Canales) atribuir un color a cada canal. Guarde la pila compuesta como una secuencia de imágenes o como una película (véase la sección 5.4).
2. Imagen pila Z proyección
   1. Utilice la función Z proyección (Imagen / pila / Zproject, Intensidad máxima) para proporcionar una vista bidimensional de todas las imágenes de una pila de imágenes mediante la proyección a lo largo del eje perpendicular al plano de la imagen (eje z). La opción "Intensidad máxima" crea una imagen en la que cada píxel contiene el valor máximo sobre todas las imágenes de la pila. Esto genera una sola imagen que permite la visualización de toda la tinción observada a través de toda la pila imagen para un canal en particular o después de la superposición de varios canales.
3. Imagen proyección pila 3D
   1. Utilice el comando de proyección en 3D (proyecto de imagen / Stack / 3D, más brillante Point, eje y) para generar una secuencia de proyecciones de un volumen de rotación sobre un plano. La representación visual de susus superficies de las estructuras internas y depende tanto del método de proyección (punto más cercano, punto más brillante (utilizado aquí), o media-valor) y los parámetros de visualización seleccionados. Cada fotograma de la secuencia de animación es el resultado de que se proyecta desde un ángulo de visión diferente.
   2. Rotar la imagen 3D creada alrededor de cada uno de los tres ejes ortogonales (el eje y se ha seleccionado aquí). Guarde la secuencia producida como una sola imagen o una película.
4. Pila de imagen para la conversión de la película
   1. Abra una pila de imágenes (Archivo / Abrir) y guardarlo como una película en formato .AVI con el comando "AVI" (Archivo / Guardar como / AVI).

Resultados

La glándula mamaria es una glándula subcutánea situado a lo largo de la estructura ventral tanto del tórax y el abdomen en los roedores. La ubicación de los cinco pares de glándulas del ratón durante la gestación se muestra en la Figura 4. La morfología de la glándula mamaria cambia dramáticamente durante su desarrollo, lo que refleja modificaciones funcionales necesarias para prepararse para la plena lactancia (Figura 1B). En los animales vírge...

Discusión

IHC es un método experimental relativamente simple y directo para localizar el antígeno en secciones de tejido, que depende principalmente de las interacciones específicas de epítopo de anticuerpos. Aunque un gran número de protocolos se utilizan para localizar una proteína por IIF, el núcleo de estos procedimientos es casi siempre el mismo. Sin embargo, hay algunos aspectos críticos que pueden influir fuertemente el resultado y por lo tanto deben ser optimizados para cada estudio individual IHC. El aspecto más...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dissection
Pins
Ethanol
Scissors
Scalpel and adapted blades
Ice
Towel paper
Tissue sample preparation	Company	Catalog Number	Comments/Description
Phosphate Buffered Saline (pH7.4)	Sigma	P-3813
Paraformaldehyde (PFA, 32% EM grade, 100 ml)	Electron Microscopy Sciences	15714-S	personnal protection equipment required WARNING: this product will expose you to Formaldehyde Gas, a chemical known to cause cancer
OCT compound/Tissue Tek	Sakura	4583
Sucrose (D-saccharose)	VWR	27480.294
Plastic molds	Dominique Dutscher	39910
Liquid nitrogen
Cryostat/sample support	Leica	CM3050S
Razor blades (SEC35)	Thermo Scientific	152200
Slide box
Glass slides Superfrost/Superfrost Ultra Plus	Thermo Scientific	10143560W90/1014356190
Brushes
IHC	Company	Catalog Number	Comments/Description
Super Pap Pen	Sigma	Z377821-1EA
Permanent marker (black)
50 mM NH4Cl in PBS	Sigma	A-0171
0.1 M glycine in PBS	VWR	24403.367
Antigen Retrieval solution: Tris 100 mM 5% urea pH9.6
Heater (up to 100°C)
Bovine Serum Albumin (BSA)	Sigma	A7906-100G
Vectashield (anti-fading mounting medium) without DAPI/with DAPI	Vector Laboratories	H-1000/H-1200
Glass coverslips 22x50mm (microscopy grade)	VWR	CORN2980-225
Nail polish
Primary antibodies	Company	Catalog Number	Comments/Description
Rabbit anti-mouse caseins (#7781; 1:50 dilution)	generously gifted by M.C. Neville (University of Colorado Health Sciences Center, USA)
Mouse anti-cytokeratin 8 (CK8, clone 1E8, 1:50 dilution)	Biolegend (Covance)	MMS-162P
Mouse anti-cytokeratin 14 (CK14, cloneLL002, 1:50 dilution)	Thermo Scientific	MS-115-P0/P1
Rabbit anti-butyrophilin (1:300 dilution)	generously gifted by I.H. Mather (Department of Animal and Avian Sciences University of Maryland College Park, USA)
Rabbit anti-Stx6 (1:50 dilution)	generously gifted S. Tooze (Cancer Research UK, London Research Institute, London, UK)
Rabbit anti-VAMP4 (1:50 dilution)	Abcam	ab3348
Secondary antibodies	Company	Catalog Number	Comments/Description
Rhodamine-conjugated goat anti-rabbit IgG (H + L) (1:300 dilution)	Jackson ImmunoResearch Laboratories	111-025-003
Counterstains	Company	Catalog Number	Comments/Description
Bodipy 493/503	Life Technologies (Molecular Probes)	D-3922
DAPI (4-6-diamidino-2-phenylindole)	Life Technologies (Molecular Probes)	D-1306
Observation/Image capture	Company	Catalog Number	Comments/Description
conventional fluorescence microscope	Leica Leitz DMRB microscope		Standard filters for FITC, Rhodamine and DAPI emissions,                     ×63 oil-immersion objective (NA 1.3), DP50 imaging camera (Olympus), CellˆF software (Olympus)
Laser Scanning Microscope (confocal microscopy)	Zeiss LSM 510 microscope		Plan-Apochromat ×63 oil-immersion objective (NA 1.4),                  CLSM 510 software,               Confocal facilities, MIMA2 Platform, INRA Jouy-en-Josas, France, http://mima2.jouy.inra.fr/mima2)
Image treatment	Company	Catalog Number	Comments/Description
ImageJ 1.49k software			Free software