Die indirekte Immunfluoreszenz auf Gefrierschnitte von Mäusemilchdrüse

Zusammenfassung

Die in diesem Artikel beschriebene indirekte Immunofluoreszenz-Protokoll ermöglicht den Nachweis und die Lokalisierung von Proteinen in der Milchdrüse der Maus. Eine vollständige Verfahren wird gegeben, um Brustdrüsenproben herzustellen, um die Immunhistochemie die Gewebeschnitte durch Fluoreszenzmikroskopie durchführen, um Bild und um Bilder zu rekonstruieren.

Zusammenfassung

Indirekte Immunfluoreszenz dient zum Erfassen und Lokalisieren von interessierenden Proteinen in einem Gewebe. Das hier vorgestellte Protokoll beschreibt ein vollständiges und einfaches Verfahren für die Immunerkennung von Proteinen, wobei die Maus laktierenden Milchdrüse als ein Beispiel genommen. Ein Protokoll für die Herstellung von Gewebeproben, insbesondere in Bezug auf die Präparation von Maus-Brustdrüsen, Gewebefixierung und gefrorenem Gewebe Schnitte, sind detailliert. Ein Standardprotokoll, um die indirekte Immunfluoreszenz durchführen, einschließlich eines optionalen Antigen-Retrieval-Schritt wird ebenfalls vorgestellt. Die Beobachtung der markierten Gewebeschnitte als auch die Bildaufnahme und Nachbehandlungen sind ebenfalls angegeben. Dieses Verfahren ergibt eine vollständige Übersicht, aus der Sammlung von Tiergewebe auf die zelluläre Lokalisation eines Proteins. Obwohl diese allgemeine Methode kann auf andere Gewebeproben angewendet werden, sollte es zu jedem Gewebe / primären Antikörper paar studierte angepasst werden.

Einleitung

Die Brustdrüse ist ein atypisches Säugetier exokrinen Organ, dessen Hauptfunktion ist die Milch für Neugeborene zu ernähren. Die Entwicklung der Brustgewebe tritt vor allem nach der Geburt und wird durch ein einzigartiges Verfahren, in dem das Epithel dringt in die umgebenden Stroma ist. Dieses Gewebe viele Veränderungen (Wachstum, Differenzierung und Regression), insbesondere während des Erwachsenenlebens gleichzeitig mit Variationen in der Fortpflanzungszustand (Figur 1). Zusätzlich zu der Gesamtmorphologie des Gewebes, wobei die Anteile der verschiedenen Zelltypen sowie deren Anordnung innerhalb des Brustdrüsen dramatisch während der Entwicklung ^1-5 ändern.

Während des embryonalen Lebens leitet das Brustepithel von Brustmilchleitungen, die durch eine geringfügige Verdickung und Schichtung des Ektoderms definiert ist, zwischen den Vorder- und Hinterbeinen an jeder Seite der Mittellinie herum Embryonaltag 10,5 (E10,5) (1A ).Auf E11.5 bricht der Milchleitung in einzelne Plakoden, die symmetrisch entlang der Brustmilchleitung an reproduzierbaren Stellen positioniert werden, und die umgebende Mesenchym beginnt zu kondensieren. Die Plakoden beginnen, tiefer in die Dermis Waschbecken und die Brust Mesenchym organisiert in konzentrischen Schichten rund um die Brustknospe (E12.5-E14.5). Ab E15.5 die Brustepithel, beginnt sich zu vermehren und zu verlängern, um die primäre sprießen, die durch den Brust Mesenchym gegen die Fettpolster drückt bilden. Der primäre Spross entwickelt ein hohles Lumen mit einer Öffnung an der Haut, durch die Ausbildung des Nippels Hülle gekennzeichnet. Auf E18.5 hat die Verlängerung Kanal in die Fettpolster gewachsen und hat sich zu einem kleinen arborized Gangsystem in das Fettpolster umgeben verzweigt. Im Wesentlichen wird festgenommen und die rudimentäre Brustdrüsen bleibt morphogenetisch Ruhe bis zur Pubertät. Beim männlichen Embryo, die Aktivierung des Androgen-Rezeptoren führt zur Degeneration der Knospen, die verschwindenvon E15.5. Ab E18, hört bis zur Pubertät ^6-9 Brustentwicklung.

Bei der Geburt birgt die Brustdrüse ein rudimentäres Gangsystem, der und verlängert Niederlassungen langsam (isometrische Wachstum). Am Beginn der Pubertät, kugelförmige Gebilde an den Spitzen der Leitungen namens die terminalen Ende Knospen (TEBs), sind aus einer äußeren Schicht der Kappe Zellen und einer mehrschichtigen inneren Kern von Zellen (Körperzellen) gebildet. Diese Strukturen sind hoch proliferative und infiltrieren das umliegende Stroma-Gewebe als Reaktion auf hormonelle Signale. Proliferation innerhalb der TEBS Ergebnisse in duktalen Dehnung, mit Verzweigung Morphogenese gekoppelt. Dieser Prozess führt zur Einrichtung eines Grund epithelialen arborized Netzwerk von dem Nippel (1B Pubertät) ausgeht. Bei ~ 10-12 Wochen nach der Geburt, wenn das Epithel hat die ganze Fettpolster eingefallen, Haltestellen und die Expansion der TEBS verschwinden. Duktale Entwicklung durchläuft dann dynamischen Veränderungen, dh successive Proliferation und Regression von Epithelzellen nach Ovarialzyklen ¹⁰ (1B, Erwachsenen).

Vom Beginn der Schwangerschaft durchläuft das Brustgewebe wichtigen Wachstums und morphologische Änderungen für die Stillzeit vorzubereiten. Das Brustepithel ausgiebig proliferieren und differenzieren, was zu einem hochverzweigten tubulo-alveolären Netzwerk. Begleitend Brustepithelzellen (MEC) polarisiert und in der Lage, synthetisieren und sezernieren Milchprodukte. MEC organisieren in zahlreiche alveolären Strukturen (Acini), die von kontraktilen Myoepithelzellen umgeben sind und in einem Stroma der Binde- und Fettgewebe, Blutgefäße und Nervenenden (1B, Schwangerschaft) zusammengesetzt eingebaut. Weiterhin wird die basale Seite des MEC in engem Kontakt mit der Basalmembran (extrazelluläre Matrix) und Wechselwirkungen zwischen diesen beiden Einheiten eng regulieren sowohl die Morphogenese und sekretorische Funktion der Mammary Epithel ^11-13.

Alle diese Verfahren beruhen auf der Wirkung verschiedener Umweltsignale, von denen die wichtigsten sind hormones14, parakrine Faktoren und der extrazellulären Matrix. Zum Beispiel, Progesteron induziert umfangreiche Seitenverzweigung ^{15 und} alveologenesis, dass in Kombination mit Prolaktin (PRL) ^16,17 fördert und pflegt die Differenzierung der Lungenbläschen. Zusätzlich zu Steroiden und PRL18, Zytokine und Signalwege mit Entwicklung verbunden (Wnt und Notch Signalwege) sind ebenfalls in Brustlinie Engagement und Entwicklung ^19-21 beteiligt. Am Ende der Schwangerschaft, beginnen die luminale MEC um eine proteinreiche Milch Kolostrum im Lumen der Alveolen bekannt herzustellen. Außerdem fungiert Progesteron auf den epithelialen Permeabilität und da die Tight Junctions sind noch offen ist Kolostrum auch in den mütterlichen Blutstrom gefunden.

Nach der Geburt, die Mammary Epithel nimmt fast die gesamte Brustdrüsenvolumens und ist hoch organisierten (Abbildung 2, Brustepithel). Milch erzeugenden Einheiten, nämlich Alveolen (Abbildung 2, Alveole) werden von einer Monoschicht von polarisiertem Brustepithelzellen sekretorischen Zellen (MESCs) gebildet ist, mit ihren apikalen Plasmamembran, die das Lumen begrenzende. Alveolen ordnen sich in die Läppchen, die in Lappen, um Kanäle, die Milch an die Außenmilieu (Abbildung 2, Lappen) Drain gruppiert sind. Laktation auftritt, dh., MESCs beginnen reichliche Mengen von Milch, vor allem durch den Rückgang der Plazentahormone (hauptsächlich Progesteron) (1B, Laktation) ausgelöst absondern. Milchprotein-Gene sind in einer definierten zeitlichen zeitlichen Verlauf von Schwangerschaft Laktation ^9,22,23 hauptsächlich in Reaktion auf Hypophysen PRL bei der Säugezeit Freigabe aktiviert. Begleitend Kontakte zwischen MESCs und der extrazellulären Matrix sowohl stimulieren Milchprotein synthesis durch Signale, die über die Wechselwirkungen zwischen zellulären Integrinen und Laminin ^24,25 vermittelt werden, und die Apoptose in MESCs ^26,27 zu unterdrücken. Diese Signalwege führen zu der Aktivierung von Milchprotein-Genpromotoren ^{28 durch die} Aktivierung spezifischer Transkriptionsfaktoren ^29. Zell-Zell-Kontakte sind ebenfalls wichtig für einige Aspekte der Differenzierung einschließlich der Einrichtung apikalen Polarität und vektoriellen Sekretion von Milchprodukten. Tight Junctions stark nahe nach dem Beginn der Laktation und MESCs fein orchestriert die Aufnahme von Molekülen aus dem Blut sowie die Synthese, den Transport und die Sekretion von Milchbestandteilen, in Reaktion auf die Ernährungsbedürfnisse von Neugeborenen. Zum Zeitpunkt der Säugezeit erfolgt die Kontraktion der Myoepithelzellen umgibt die Alveolen als Reaktion auf Oxytocin und führt zu Milchejektion durch die Kanäle und in die Nippel. Milch ist ein komplexes Fluid, das Proteine ​​enthält (hauptsächlichCaseine), Zucker (hauptsächlich Lactose), Lipiden und Mineralien sowie bioaktiven Molekülen, wie Immunglobulinen A (IgA), Wachstumsfaktoren und Hormone. Caseine synthetisiert, in supramolekularen Strukturen zusammengesetzt, nämlich Caseinmicellen entlang des sekretorischen Wegs transportiert werden und dann durch Exozytose frei, also die Verschmelzung von caseinhaltigen sekretorischen Vesikel (SV) mit der apikalen Plasmamembran der MESC (Abbildung 2).

Intrazelluläre Verkehr stützt sich auf Material des Austauschs zwischen membranFächern und beinhaltet Lösliche N-Ethylmaleimid-Sensitive Fusion (NSF) Befestigung Protein (SNAP) Rezeptor (SNARE) ^30,31. Die SNARE-Proteine ​​der Familie ist in vesikulären SNAREs (v-SNAREs), in der Vesikelmembran Gegenwart und Ziel SNAREs (t-SNAREs), auf die Zielmembranen lokalisiert unterteilt. Durch Komprimieren durch ihre Coiled-Coil-Domänen, V- und T-SNARE versammeln, um eine hochstabile Vierhelixbündel-Komplex zu bilden, bezeichnet als the SNARE-Komplex. Dieser Komplex fördert die Fusion von zwei gegenüberliegenden Lipiddoppelschichten durch die schrittweise bringen sie in die Nähe ^30,32. Danach werden SNARE-Komplexen durch die NSF Adenosintriphosphatase dissoziiert und seine Adapter Protein SNAP und SNARE-Proteine ​​sind zurück in ihre Herkunftsfach ³³ zurückgeführt. Interessanterweise liegt überwiegend jeweils SNARE-Protein in verschiedenen zellulären Kompartimenten und SNARE Paarung kann die Spezifität der intrazellulären Fusionsereignisse ³⁴ beizutragen. Frühere Studien deuten darauf hin, dass zumindest Synaptosomale-Associated Protein 23 (SNAP23) und Vesikel-assoziiertes Membranprotein 8 (VAMP8) und Syntaxinen (STX) -7 und -12 eine Rolle bei Casein Exozytose ^35,36. Diese Proteine ​​wurden ebenfalls in Verbindung mit der Lipidfraktion von Milch, das heißt Milchfettkügelchen (MFG) ³⁷ gefunden. Die aktuelle vorherrschende Modell postuliert, dass zytoplasmatischen Lipidtröpfchen (CLDs) sind durch die Akkumulation von neutralen l gebildetipids (hauptsächlich Triglyceride und Sterolester) und Cholesterin aus der Ernährung der Mutter zwischen den beiden Blättchen des endoplasmatischen Retikulums (ER) -Membran ^38-41 abgeleitet ist. Große CLDs ausgebildet sind, zumindest teilweise durch die Fusion von kleineren CLDs während es an die apikalen Seite MESCs wo sie als MFG freigegeben werden (1-10 & mgr; m im Durchmesser) durch Knospung transportiert, wobei durch den MESC apikalen Plasmamembran umhüllt ^40-42. Stillzeit aufhört, nachdem Welpen entwöhnt und die MESCs schrittweise sterben durch Apoptose, was zur Rückbildung des Brustgewebe wieder zu einem pubertären Zustand (1B, Rückbildung).

Immunfluoreszenz (IF) ist ein in fast allen Bereichen der Biologie verwendet gemeinsamen analytischen Labormethode, sowohl in der Forschung und in der klinischen Diagnostik. IF-Techniken können auf Gewebeschnitten durchgeführt werden (Immunhistochemie, IHC) oder Zelle (Immunzytochemie, ICC) Proben. Diese leistungsstarke Ansatz beruht auf der Verwendung von Leuchtstoff-markierte Antikörper, die spezifisch an die (direkt oder indirekt) mit dem Antigen von Interesse, wodurch die Visualisierung der Verteilung im Gewebe durch Fluoreszenzmikroskopie. Fluoreszenzsignale meist hängen von der Qualität und der Konzentration der Antikörper und sachgemäße Handhabung der Probe. Eine einfache indirekte Immunfluoreszenz (IIF) -Protokoll wird präsentiert, um Milcherzeugnisse (Kaseine und MFG) und Proteinen in Milchprodukt Sekretion beteiligt erkennen (butyrophilin (btn1), SNARE-Proteine) an Gefrierschnitten von Mausbrustgewebe (Abbildung 3). Während dieses Protokoll bietet eine komplette Übersicht IHC reichen von Gewebesammlung für Bild Nachbehandlung, kritische und optionale Schritte sowie einige technische Empfehlungen werden ebenfalls vorgestellt und diskutiert.

Protokoll

CD1-Mäusen wurden bei INRA (UE0907 IERP, Jouy-en-Josas, Frankreich) gezüchtet. Alle ethischen Aspekte der Tierpflege mit den einschlägigen Richtlinien und Zulassungsanforderungen, die von der Französisch Ministerium für Landwirtschaft gelegt eingehalten werden. Die verwendeten Verfahren wurden von der Ethikkommission (Vereinbarung 12/097 vom Comethea Jouy-en-Josas / Agroparistech) zugelassen.

1. Milchdrüse Probenvorbereitung

1. Maus-Brustdrüse Dissektion
   1. Euthanize Mäusen am Tag 10 der Laktation durch Genickbruch und stecken Sie das Tier zu mit seinen Unterleib nach oben zeigt.
   2. Befeuchten Sie die Bauchbereich mit Ethanol und trocknen Sie es mit einem Papiertuch.
   3. Mit einer Pinzette, ziehen Sie die Bauchhaut zwischen den beiden Hinterbeinen und einen Einschnitt (nur durch die Haut) von etwa 1 cm mit einer scharfen Schere. Ausgehend von diesem ersten Schnitt, dann mit einer Schere, um die Haut bis zum Hals auf der Maus zu schneiden. Ziehen Sie die Haut von dem Bauchfell und pin auf der einen Seite der Haut zu einer Zeit, Stretching gelehrt.
   4. Sammeln Sie die Bauch- und Leistenbrustdrüsen, indem Sie sie von der Haut mit einem Tupfer und schließlich Ziehen oder Schneiden sie weg von dem Bauchfell.
      Anmerkung: In diesem Schritt Carmine Färbung kann, um das Brustepithel innerhalb der gesamten Drüse ⁴³ visualisieren geführt werden. Dieser Ansatz kann nützlich sein, um die globale Morphologie der Brustdrüse unter verschiedenen Bedingungen (physiologische Entwicklungsstadien, Krankheiten in vivo Behandlungen) analysieren.
   5. Entfernen der Lymphknoten an der Verbindungsstelle der Bauch- und Inguinaldrüsen ^{44 angeordnet.}
2. Brustgewebefixierung
   1. Schneiden das Brustgewebe in ³ mm 3 Fragmente mit einem Skalpell und unmittelbar spülen diese Fragmente in einer phosphatgepufferten Salzlösung (PBS), pH 7,4, um so viel Milch wie möglich zu entfernen.
   2. Schnell trocknen die Fragmente auf einem PapierHandtuch und legte sie in einem kalten PBS-Lösung, die 4% Paraformaldehyd (PFA, HCHO, 32% Formaldehydlösung, VORSICHT) für 10 bis 15 Minuten auf Eis.
      Hinweis: Dies ist genug Zeit, um die nachfolgende Analyse auf Brustgewebeschnitt durch IIF36 und / oder in situ Hybridisierung ⁴⁵ zu ermöglichen. Jedoch, wie Aldehyd-Fixierungsmittel eindringen eher langsam in Gewebestücke (~ 1-3 mm pro Stunde), kann diese Zeit verlängert werden, um eine optimale Fixierung der Gewebeprobe zu gewährleisten. Alternativ zu beheben Geweben in vivo durch Perfusion eines betäubten Tier mit einem Fixierungslösung (nicht in der vorliegenden Studie beschrieben).
3. Saccharose Infusions
   1. Schnell Spülen der Milch Fragmente in kaltem PBS und tauche sie in kalte PBS-Lösung, enthaltend 40% Sucrose (D-Saccharose, C12H22O11, Mr 342,3 g / mol) für 16 bis 48 h bei 4 ° C unter leichtem Schütteln.
4. Gewebeeinbettung
   Hinweis: Bei diesem Schritt Brust Fragmente können, um kleinere Fragmente (2-3 ^mm 3 zu machen erneut geschnitten werden) Oder ihre Form ändern.
   1. Richtig beschriften Sie die Kunststoffformen und füllen ein Drittel des Volumens der Form mit OCT-Verbindung, bei RT gehalten. Legen Sie ein Fragment (2-3 mm ³⁾ von Brustgewebe pro Form und decken Sie es mit OCT-Verbindung.
   2. Platzieren der Formen an der Oberfläche des flüssigen Stickstoffs (auf einer Platte aus Aluminium oder mit einem metallischen Sieb) und damit das Produkt einfriert.
      Hinweis: Es muss fest und weiß vor dem Eintauchen der Form in flüssigem Stickstoff zu werden.
5. Bewahren Sie die gefrorenen Proben bei -80 ° C, bis Gewebeschnitten durchgeführt.

2. Gefrorene Gewebe Sectioning

Anmerkung: einen Kryostaten, der im wesentlichen ein Mikrotom in einer Kühltruhe, ist erforderlich, um gefrorene Gewebesektionen vorzunehmen. Eine niedrigere Temperatur wird oft für Fett oder lipidreiche Gewebe wie natives Brustdrüse erforderlich.

1. Stellen Sie die Temperatur des Kryostaten auf -26 ° C und warten, bis es hat Stabisiert. Pflegen Sie die gefrorenen Gewebeblock bei -26 ° C über den gesamten Schneideverfahren. Absolut zu vermeiden Auftauen des Gewebes zu jedem Zeitpunkt während des Verfahrens.
2. Kühlen Sie die Rasierklinge, die Schneidunterlage, die Wankstützeinrichtung und die Bürste bis -26 ° C, indem sie in den Kryostaten für mindestens 10 min. Außerdem legen Sie eine Dia-Box im Inneren des Kryostaten, um in der Lage, Glasobjektträger zu speichern, wie die Schnitte gemacht werden können.
3. Richtig beschriften Sie die Glasobjektträger, die verwendet werden, um die Gewebeschnitte bei RT sammeln und diese beibehalten werden; sonst Gewebeschnitte werden nicht an sie halten. Entfernen Sie die Probe aus der Form im Inneren des Kryostaten.
   Hinweis: Die Verwendung positiv geladenen Objektträgern wird die Haftung der frische Gefrierschnitte stark begünstigt durch höhere elektrostatische Anziehung.
4. Decken Sie die Oberfläche eines Metallgewebescheibe mit OCT-Verbindung (bei RT gehalten) und drücken Sie die gefrorene Probe darauf. Platzieren Sie das nasse Halterung im Inneren des Kryostaten und lassen Sie es cool mindestens 15 min.
5. Setzen Sie den nassen Halterung in den Plattenhalter des Kryostaten. Stellen Sie die Schnittdicke von 5-6 & mgr; m und, wenn möglich, verwenden Sie eine neue scharfe Klinge oder zumindest ändern Sie den Bereich auf der Klinge verwendet, um jede Probe, da einige Gewebe werden schnell langweilig schneiden.
6. Einstellen der Position der Wankstützeinrichtung über den Rasierklingen indem Schnitte der Befestigungsmedium, bis die Scheiben gleichmßig und korrekt gebildet wird. Idealerweise wird die Wankstützeinrichtung über der Rasierklinge um etwa 1 mm treten.
7. Wenn die Einstellungen korrekt sind, führen Gewebeschnitte durch Drehen des Rades in einem kontinuierlichen gleichförmigen Bewegung. Es sei denn, die Temperatur ist ideal, ein Gewebeschnitt wird, von der Natur, versuchen Sie, machen Sie es sich.
   1. Verwenden Sie eine Bürste, um zu packen und zu manövrieren im Abschnitt über die Bühne, um sie zu legen, wie auf dem Objektträger gewünscht. Verwenden Sie den Pinsel zu bereinigen die Reste gegebenenfalls auf der gefrorenen Gewebeblock und / oder der Rasierklinge vorhanden.
8. ziehender Gewebeschnitt in Richtung des Benutzers und zur Vermeidung von Eindrücken auf den Kryostaten Bühne. Nicht auf die Gewebeabschnitt auf den Kryostaten Stadium, da es zu der Adhäsion der Gewebescheibe auf der Bühne und damit die Unfähigkeit, mit dem Glasträger wiederherzustellen führen.
9. Abrufen Gewebeschnitte einzeln durch abholen an der Oberfläche eines Glasobjektträger, indem Sie sie über dem Bereich und Angel es nach unten, um den Gewebeschnitt zu berühren.
   Hinweis: Die Gewebeschnitte schnell auf die warme Glas haften durch statische Anziehungskraft. Wenn mehrere Gewebeschnitte werden auf demselben Objektträger gelegt, darauf achten, sie nicht zu überlappen und um Platz zu ihnen genug, um einzeln schließen Sie sie in einem hydrophoben Kreis sein (siehe Abschnitt 3.1.1.).

3. Die indirekte Immunfluoreszenz

1. Lokalisierung Abschnitten
   1. Verwenden Sie eine hydrophobe Sperrstift, um eine hydrophobe Kreis um Objektträger angebrachten Gewebe ziehen. Lassen Sie den Kreis trocken für ca. 1 min bei RT. Zeichnen Sie eine Linie um die tThema Abschnitte mit einem feinen schwarzen Filzstift als gut, aber auf der Seite der Glasobjektträger gegenüber der einen, wo die Gewebeschnitte sind.
      Hinweis: Dieser Kreis ist wasserabweisend und Aceton und Alkohol unlöslich. Es ist daher ein Hindernis für die während der IHC Verfahren verwendeten wässrigen Lösungen und verringert das Volumen der erforderlichen Reagenzien.
   2. Rehydrieren Gewebeschnitte von ihnen bedeckt mit einem Tropfen von ~ 250 & mgr; l PBS für ein paar Minuten bei RT. Fix Gewebeschnitte von ihnen Abdecken mit ~ 250 & mgr; l einer frisch hergestellten 3% PFA-Lösung in PBS für 10 bis 15 min.
      Hinweis: Wahlweise in diesem Fall verwenden Sie einen Aldehyd Abschrecken Lösung (50 mM Ammoniumchlorid _(NH 4 Cl, Herr 53,5 g / mol) in PBS oder 0,1 M Glycin _(C 2 H 5 _NO 2, Mr 75,07 g / mol) in PBS ), um die Fixierungsreaktion zu stoppen. Einfache und reichlich PBS waschen ist in der Regel ausreichend, um nicht umgesetzte Aldehyd zu entfernen.
2. Antigen-Retrieval (optional)
   Anmerkung: Während die meisten Antigene können ohne Antigen Retrieval (AR) nachgewiesen werden, andere werden nur dann beobachtet, wenn dieser Schritt durchgeführt werden. In einigen Fällen ermöglicht AR auch die Verbesserung des beobachteten Signals.
   1. Legen Sie das AR-Lösung (100 mM Tris _(C 4 H _{11 NO} 3, Herr 121,14) 5% Harnstoff _(NH 2 _CONH 2, Mr 60,06) pH 9,6) in einem Becherglas. Das Volumen der AR-Lösung muss ausreichen, um die Glasobjektträger in einem Glashalter platziert vollständig zu decken.
   2. Heizen Sie den AR-Lösung auf 95 ° C durch die Überwachung der Temperatur mit einem Thermometer und dann die Glasobjektträger auf einem geeigneten Gestell, tauchen Sie das Rack in der heißen Puffer, Abdeckung, um Verdunstung zu begrenzen und Inkubation für 10 min bei 95 ° C.
   3. Das Becherglas aus dem Wasserbad und lassen Sie die Glasobjektträger weitere 10 Minuten im Puffer.
3. Immundetektion
   1. Spülen Gewebeschnitte mit PBS (~ 250 & mgr; l / Schnitt) und sättigen sie mit einer Lösungvon 3% Rinderserumalbumin (BSA, ~ 250 & mgr; l / Schnitt) in PBS für mindestens 30 min bei RT.
   2. Gesetzt 30-50 ul des primären Antikörpers in PBS mit 2% BSA für jedes Gewebeschnitt verdünnt.
      Anmerkung: Dieser Band ist genug, um einen Tropfen, der den Gewebeschnitt vollständig bedeckt.
   3. Stellen das gleiche Volumen des Verdünnungsmittels (2% BSA in PBS) alleine auf einem Gewebeschnitt, eine negative Kontrolle ohne primären Antikörper durchzuführen.
      1. Systematisch, um diesen Negativkontrolle in jedem IHC Experiment und führen für jeden sekundären Antikörper verwendet, um den Hintergrund des Experiments abzuschätzen (nicht-spezifische Markierung aufgrund des sekundären Antikörpers und / oder der Gewebeautofluoreszenz). Andere Arten von positiven oder negativen Kontrollen kann auch durchgeführt werden, um die Spezifität der Markierung zu gewährleisten (siehe Diskussion).
   4. Legen Sie die Glasobjektträger in einer feuchten Box O / N bei 4 ° C.
      Hinweis: Primäre Antikörper waren monoklonale Maus-Anti-Cytokeratin8 (CK8, Verdünnung 1:50), monoklonalen Maus-anti-Cytokeratin 14 (CK14, Verdünnung 1:50), polyklonalen Kaninchen-Anti-Maus-Casein (# 7781, Verdünnung 1:50, großzügig von MC Neville, University of Colorado Health bereitgestellt Sciences Center, CO, USA), polyklonalen Kaninchen-anti-btn1 (1: 300 Verdünnung, großzügig von IH Mather, Abteilung Tier und Avian Sciences, University of Maryland, College Park, MD, USA), polyklonalen Kaninchen-anti-Stx6 (bereitgestellt Verdünnung 1:50, großzügig von S. Tooze, Cancer Research UK, London Research Institute, London, Großbritannien) und polyklonalen Kaninchen-anti-VAMP4 (1:50 Verdünnung) zur Verfügung gestellt.
   5. Gründlich Gewebeschnitte mit PBS mindestens viermal für 10 min bei RT.
   6. Verdünne den geeigneten sekundären Antikörper (Rhodamin-konjugiertes Ziegen-Anti-Kaninchen-IgG (H + L), 1: 300 Verdünnung) in PBS, enthaltend 2% BSA, legen 30-50 ul dieser Lösung auf allen Gewebeschnitten, und Inkubation für 1,5 h bei RT.
      1. Seit Fluorochrome sind lichtempfindliche Moleküle, nichtaussetzen Gewebeschnitte, um Licht bis zu ihrer Analyse. Für IIF an Gewebeschnitten, begünstigen Sekundärantikörper auf einem roten Fluorophor gekoppelt seit Zellmembranen sind in der Regel eine grüne Autofluoreszenz, die mit geringer Kennzeichnungs stören können generieren. Außerdem die Wahl eines roten Fluoreszenzfarbstoff-gekoppelte sekundäre Antikörper ermöglicht die gleichzeitige Markierung von neutralen Lipiden (siehe unten).
   7. Gründlich die Gewebeschnitte mit PBS mindestens viermal waschen für 10 min bei RT.
4. Postfixierung (optional)
   1. Für einige Experimente durchzuführen Postfixierung durch Inkubation der Proben mit 2% PFA in PBS für 10 min bei RT, verdünnt, um die Antigen / Antikörper-Gerüste zu stabilisieren. Allerdings kann dieser Schritt in den meisten Fällen verzichtet werden.
5. Neutralen Lipiden und DNA-Gegenfärbung
   1. Um CLDs und MFG, Farbe neutralen Lipiden durch Inkubation von Gewebeschnitten in 30-50 ul einer PBS-Lösung, enthaltend 3 ug / ml des Bodipy 493 visualisieren/ 503 10 min bei RT. Schnell Gewebeschnitte zweimal mit PBS spülen.
   2. Gegenfärbemittel nuklearen DNA mit 30-50 ul einer PBS-Lösung, die 3 uM DAPI (4-6-Diamidino-2-phenylindol, 5 mg / ml Stammlösung) 10 min bei RT. Die Gewebeschnitte vor der Montage der Folien für die Beobachtung zweimal mit PBS waschen.
6. Abschnitt Montage
   1. Entfernen PBS und setzen Sie einen Tropfen Eindeckmedium auf jedem Gewebeschnitt.
   2. Legen Sie eine Seite des Deckglases in einem Winkel gegen den Schieber, den Kontakt mit der Außenkante der Flüssigkeitstropfen und senken Sie dann langsam den Deckel, Luftblasen zu vermeiden. Lassen Sie die Flüssigkeit zwischen dem Objektträger und Deckglas für ein paar Minuten zu verbreiten und dann entfernen Sie das überschüssige Eindeckmedium mit einem Papiertuch.
   3. Dichten Sie das Deckglas auf den Objektträger mit Nagellack und speichern Gewebeschnitte bei 4 ° C auf ihre Belichtung bis Beobachtungs verhindern.

4. Fluoreszenzbeobachtung und Image Acquisition

Hinweis: Ein Fluoreszenzmikroskop mit einer Kamera durch eine Bildaufnahme-Software gesteuert wird, erforderlich, um die Ergebnisse zu beobachten IHC ausgestattet.

1. Vor der Erfassung von Bildern, überprüfen Sie die Intensität der Kennzeichnung und Bewertung der Hintergrund des Experiments, indem man die negativen Kontrollen. Erwerben Sie Bilder von jedem Fluoreszenzmarkierung (Farbkanal) einzeln.
2. Erwerben Sie alle Bilder, auch die der entsprechenden Kontrollen bei den gleichen Bedingungen (Belichtung und allgemeine Einstellungen) für jeden Farbkanal.
3. Konventionelle Mikroskopie
   1. Führen Epifluoreszenzmikroskopie mit einem Mikroskop mit Standard-Filter für Fluoresceinisothiocyanat (FITC, grün), Rhodamin (rot) und DAPI (blau) Emissionen ausgestattet, × 20-63 (Öl-Immersion, NA 1.3) Ziele und eine DP50 Bildkamera ×.
4. Konfokale Mikroskopie
5. Führen konfokale Mikroskopie mit microsBewältigung der ZEN-Software ausgestattet, mit × 20-63 (Öl-Immersion, NA 1.4) Ziele und die 488- und 568-nm-Anregungswellenlängen des Laser ×.

5. Bild Behandlung

Hinweis: Alle Bild Nachbehandlungen werden mit dem ImageJ freie Software (http://imagej.nih.gov/ij/) durchgeführt.

1. Bild überlagern (Merge)
   1. Öffnen Sie die in jedem Kanal, die kombiniert werden (Datei / Öffnen) erfassten Bilder. Wenn die Arbeit mit 8-Bit-Graustufenbilder, Attribut künstliche Farbe, die jedem Kanal unter Verwendung der Nachschlagtabelle (Bild / Lookup Tables).
   2. Generieren Sie das zusammengesetzte Bild von Graustufen- oder Farbbilder mit dem Befehl "Zusammenführen Kanäle" (Bild / Farbe / Merge-Kanäle) und dann Zuordnung einer Farbe zu jedem Kanal.
   3. Führen Sie Bildstapeln Überlagerung auf die gleiche Weise durch Öffnen Stapel in jedem Kanal, die kombiniert werden sollen (Datei / Öffnen) erworben und mit dem Befehl "Zusammenführen Kanäle &# 8221; (Foto / Farbe / Merge-Kanäle), um eine Farbe für jeden Kanal zuzuordnen. Speichern Sie die Verbundstapel als Bildsequenz oder als Film (siehe Abschnitt 5.4).
2. Bildstapel Z Projektions
   1. Verwenden Sie die Z-Projektionsfunktion (Bild / Stapeln / Zproject, Max Intensity), um eine zweidimensionale Darstellung aller Bilder eines Bildstapels durch Projektion entlang der Achse senkrecht zur Bildebene (z-Achse) zu liefern. Die Option "Maximum Intensity" erstellt ein Bild, in dem jedes Pixel den Maximalwert über alle Bilder im Stapel enthält. Dies erzeugt ein Einzelbild ermöglicht die Visualisierung des gesamten durch den ganzen Stapel für einen bestimmten Kanal oder nach der Überlagerung von mehreren Kanälen beobachtet Färbung.
3. Bildstapel 3D-Projektion
   1. Verwenden Sie die 3D-Projektion-Befehl (Bild / Stapeln / 3D-Projekt, hellste Punkt, y-Achse), eine Folge von Projektionen eines rotierenden Volumen auf eine Ebene zu erzeugen. Die visuelle Darstellung der surfaces und internen Strukturen hängt sowohl von der Projektionsverfahren (nächste Punkt, hellste Punkt (verwendet) oder Mittelwert) und die Visualisierungsparameter ausgewählt. Jeder Rahmen des Animationssequenz ist das Ergebnis von einem anderen Betrachtungswinkel vorsteht.
   2. Drehen Sie das erstellte 3D-Bild um jede der drei orthogonalen Achsen (hier wurde die y-Achse gewählt). Speichern Sie das als ein einzelnes Bild oder eine Filmsequenz hergestellt.
4. Bildstapel, um Film Umwandlung
   1. Öffnen Sie ein Bild Stapel (Datei / Öffnen) und speichern Sie es als Film im AVI-Format mit dem Befehl "AVI" (Datei / Speichern unter / AVI).

Ergebnisse

Die Brustdrüse ist eine subkutane Drüse entlang der ventralen Struktur sowohl des Thorax und des Abdomens bei Nagern entfernt. Die Lage der fünf Paare von Drüsen der Maus während der Schwangerschaft ist in Abbildung 4 dargestellt. Die Morphologie der Brustdrüse drastisch ändert sich während seiner Entwicklung, was auf funktionelle Änderungen erforderlich, um für die vollständige Stillzeit (Abbildung 1B) vorzubereiten. In Jungfrau oder nulliparous Tieren, die Brus...

Diskussion

IHC ist eine relativ einfache und direkte experimentelle Methode an Antigen in Gewebeschnitten, die in erster Linie auf spezifische Epitop-Antikörper-Wechselwirkungen abhängt lokalisieren. Obwohl eine große Anzahl von Protokollen verwendet werden, um ein Protein von IIF zu lokalisieren, ist der Kern dieser Verfahren fast immer gleich. Es gibt jedoch einige wichtige Aspekte, die einen starken Einfluss auf das Ergebnis und müssen daher für jede einzelne IHC Studie optimiert werden. Der schwierigste Aspekt dieses Ansa...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dissection	Company	Catalog Number	Comments/Description
Pins
Ethanol
Scissors
Scalpel and adapted blades
Ice
Towel paper
Tissue sample preparation	Company	Catalog Number	Comments/Description
Phosphate Buffered Saline (pH7.4)	Sigma	P-3813
Paraformaldehyde (PFA, 32% EM grade, 100 ml)	Electron Microscopy Sciences	15714-S	personnal protection equipment required WARNING: this product will expose you to Formaldehyde Gas, a chemical known to cause cancer
OCT compound/Tissue Tek	Sakura	4583
Sucrose (D-saccharose)	VWR	27480.294
Plastic molds	Dominique Dutscher	39910
Liquid nitrogen
Cryostat/sample support	Leica	CM3050S
Razor blades (SEC35)	Thermo Scientific	152200
Slide box
Glass slides Superfrost/Superfrost Ultra Plus	Thermo Scientific	10143560W90/1014356190
Brushes
IHC	Company	Catalog Number	Comments/Description
Super Pap Pen	Sigma	Z377821-1EA
Permanent marker (black)
50 mM NH4Cl in PBS	Sigma	A-0171
0.1 M glycine in PBS	VWR	24403.367
Antigen Retrieval solution: Tris 100 mM 5% urea pH9.6
Heater (up to 100°C)
Bovine Serum Albumin (BSA)	Sigma	A7906-100G
Vectashield (anti-fading mounting medium) without DAPI/with DAPI	Vector Laboratories	H-1000/H-1200
Glass coverslips 22x50mm (microscopy grade)	VWR	CORN2980-225
Nail polish
Primary antibodies	Company	Catalog Number	Comments/Description
Rabbit anti-mouse caseins (#7781; 1:50 dilution)	generously gifted by M.C. Neville (University of Colorado Health Sciences Center, USA)
Mouse anti-cytokeratin 8 (CK8, clone 1E8, 1:50 dilution)	Biolegend (Covance)	MMS-162P
Mouse anti-cytokeratin 14 (CK14, cloneLL002, 1:50 dilution)	Thermo Scientific	MS-115-P0/P1
Rabbit anti-butyrophilin (1:300 dilution)	generously gifted by I.H. Mather (Department of Animal and Avian Sciences University of Maryland College Park, USA)
Rabbit anti-Stx6 (1:50 dilution)	generously gifted S. Tooze (Cancer Research UK, London Research Institute, London, UK)
Rabbit anti-VAMP4 (1:50 dilution)	Abcam	ab3348
Secondary antibodies	Company	Catalog Number	Comments/Description
Rhodamine-conjugated goat anti-rabbit IgG (H + L) (1:300 dilution)	Jackson ImmunoResearch Laboratories	111-025-003
Counterstains	Company	Catalog Number	Comments/Description
Bodipy 493/503	Life Technologies (Molecular Probes)	D-3922
DAPI (4-6-diamidino-2-phenylindole)	Life Technologies (Molecular Probes)	D-1306
Observation/Image capture	Company	Catalog Number	Comments/Description
conventional fluorescence microscope	Leica Leitz DMRB microscope		Standard filters for FITC, Rhodamine and DAPI emissions,                     ×63 oil-immersion objective (NA 1.3), DP50 imaging camera (Olympus), CellˆF software (Olympus)
Laser Scanning Microscope (confocal microscopy)	Zeiss LSM 510 microscope		Plan-Apochromat ×63 oil-immersion objective (NA 1.4),                  CLSM 510 software,               Confocal facilities, MIMA2 Platform, INRA Jouy-en-Josas, France, http://mima2.jouy.inra.fr/mima2)
Image treatment	Company	Catalog Number	Comments/Description
ImageJ 1.49k software			Free software