Fare Meme Bezinin Dondurulmuş Bölümler Dolaylı İmmünofloresan

Özet

Bu makalede açıklanan dolaylı immünfloresan protokol algılama ve fare meme bezinde proteinlerin yerelleştirme verir. Tam bir yöntem olup, meme bezi örnekleri hazırlamak için floresan mikroskobu ile görüntü, doku kesitlerinde immunhistokimya gerçekleştirmek için ve görüntüleri yeniden verilir.

Özet

Dolaylı immünoflüoresans algılar ve bir dokuda ilgili proteinleri bulmak için kullanılır. Burada sunulan protokol proteinlerinin bağışıklık saptanması için bir tam ve basit bir yöntem olup, meme bezi laktasyondaki fare örnek olarak alınmıştır açıklanmaktadır. Özellikle fare meme bezi, doku fiksasyon ve dondurulmuş doku kesit diseksiyon ilgili doku örneklerinin hazırlanması için bir protokol, ayrıntılı olarak açıklanmıştır. Bir standart bir protokol isteğe bağlı antijen alma aşaması da dahil olmak üzere, dolaylı immünofloresan gerçekleştirmek için de sunulmaktadır. Etiketli doku kesitlerinin gözlem yanı sıra görüntü toplama ve post-tedavileri de belirtilmiştir. Bu prosedür, bir proteinin hücresel lokalizasyonu hayvan dokusunun koleksiyonundan tam bir bakış verir. Bu genel yöntem, diğer doku örnekleri uygulanabilir olsa da, çalışılan her doku / birincil antikor çift göre adapte edilmelidir.

Giriş

Meme bezi asıl işlevi yenidoğanların beslemek için süt üretmek için bir atipik memeli exocrine organıdır. Meme dokusu gelişimi esas olarak doğum sonrası meydana gelir ve epitel çevreleyen dokudan işgal ettiği benzersiz bir süreç ile karakterize edilir. Bu doku eş zamanlı üreme durumu varyasyonların (Şekil 1), özellikle erişkin yaşamı boyunca, pek çok değişiklik (büyüme, farklılaşma ve regresyon) uğrar. Doku genel morfolojisine ek olarak, farklı hücre tiplerinin yanı sıra meme bezi içindeki düzenlemesinin oranlar önemli ölçüde gelişme ^1-5 boyunca değişmez.

Embriyonik yaşamı boyunca meme epitel embriyonik gün 10,5 (E10.5) (Şekil 1A yaklaşık orta hattın her iki tarafında ön ve arka bacak arasında ektoderm hafif bir kalınlaşma ve tabakalaşma tarafından tanımlanan meme süt çizgileri türeyen ).E11.5 üzerinde süt hattı simetrik tekrarlanabilir yerlerde meme süt hattı boyunca konumlandırılmış bireysel placodes, içine kırılır ve çevredeki mezenşimin yoğunlaşmaya başlar. Placodes dermis içine derin batmaya başlar ve meme mezenşimin meme tomurcuğu (E12.5-E14.5) etrafında konsantrik tabakalar halinde düzenler. E15.5 itibarıyla meme epitel, çoğalmaya ve yağ yastığı doğru meme mezenşimin aracılığıyla iter birincil filiz oluşturmak üzere uzatılması başlar. Birincil filiz nipel kılıf oluşumu ile işaretlenmiş cilde bir açıklığı olan bir içi boş lümen geliştirir. E18.5 üzerinde uzama kanal yağ yastığı haline geldi ve yağ yastığı kapsayan küçük bir arborized duktal sistemi içine dallı gelmiştir. Kalkınma esas tutuklandı ve ilkel meme bezi ergenliğe kadar morfogenetik sessiz kalır. Erkek embriyo, androjen reseptörlerinin aktivasyonu yok tomurcukları, dejenerasyonuna yol açarE15.5 tarafından. E18 itibariyle meme gelişimi ergenlik ^6-9 kadar durur.

Doğumda, meme bezi uzatır ve dalları yavaş yavaş (izometrik büyüme) bir ilkel duktal sistemi barındırıyor. Ergenlik başlangıcında, kanalların ucunda yer alan küre biçimli yapılar terminal uç tomurcukları (TEB), kapak hücrelerin bir dış tabaka ve bir hücre tabakalı iç kısım (vücut hücreleri) oluşturulmaktadır adlandırılır. Bu yapılar yüksek proliferatif ve hormonal uyaranlara yanıt olarak çevreleyen stromal doku sızmak. Duktal uzama TEB'in sonuçlar içinde Silahların Yayılmasını Önleme, morfolojilerinden dallanma ile birleştiğinde. Bu süreç meme başı (Şekil 1B, ergenlik) kaynaklanan bir temel epitel arborized ağının kurulmasına yol açar. ~ 10-12 hafta doğumdan sonra, epitel bütün yağ yastığı işgal etmiştir, genişleme durur ve at TEB kaybolur. Duktal geliştirme sonra dinamik değişiklikleri, yani Successi uğraröstrus döngüsü ¹⁰ (Şekil 1B, yetişkin) göre olan epitel hücrelerin proliferasyonunu ve regresyonu ettik.

Gebeliğin başlangıcından itibaren, meme dokusu emzirme hazırlanmak için önemli büyüme ve morfolojik değişikliklere uğrar. Meme epitel yoğun bir çok dallı tübülo-alveol ağa lider, çoğalmaya ve ayırt. Buna paralel, meme epitel hücreleri (MECler) polarize ve sentez ve süt ürünleri salgılar mümkün hale gelir. MECler kasılma myoepitelyal hücreleri ile çevrilidir ve bağ ve yağ dokuları, kan damarları ve sinir terminalleri (Şekil 1B, gebelik) oluşan bir stroma dahil edilmiştir sayıda alveol yapılar (acininin) içine düzenliyoruz. Ayrıca, MECS bazal yan bazal membran (hücre dışı matris) ile yakın temas içinde olduğunu ve bu iki varlık arasındaki etkileşimler sıkıca memenin hem morfogenezine ve salgı fonksiyonunu düzenlerry epitel ^11-13.

Tüm bu işlemler, en önemli hormones14 olan çeşitli çevre hareketlerine, parakrin faktörleri ve hücre dışı matrisin etkisine dayanır. Örneğin, progesteron, geniş yan dallanma prolaktin (PRL) ile kombinasyon halinde, ¹⁵ ve ^16,17 alveologenesis indükler teşvik eder ve alveol farklılaşmasını korur. Steroidler ve PRL18, sitokinler ve gelişimi ile ilişkili sinyal yolları yanı sıra (Wnt sinyal yolları ve Notch) ayrıca meme soy bağlılığı ve geliştirme ^19-21 katılmaktadırlar. Gebeliğin sonunda lümen MECler alveol lümeninde kolostrum olarak bilinen bir protein bakımından zengin süt üretmeye başlarlar. Ayrıca, progesteron epitel geçirgenliğine etki eder ve sıkı bağlantıları hala açık olduğundan, kolostrum maternal kan akışı bulunur.

Doğumdan sonraki, mammary epiteli (Şekil 2, meme epitel) hemen hemen tüm meme bezi hacminin kadar sürer ve son derece organize edilmektedir. Süt üreten üniteler, yani alveollerin (Şekil 2, alveol), apikal plazma zarı lümen sınırlayan ile polarize meme epitelyum salgılama hücrelerinde (MESCs) bir tek tabaka ile oluşturulmuştur. Alveoller dış ortamın (Şekil 2, lob) süt drenaj kanallarına bağlı loblar şeklinde gruplandırılmış lobülleri kendilerini düzenlemek. Emzirme oluşur yani., MESCs öncelikle plasental hormonlar damla (özellikle progesteron) (Şekil 1B, laktasyon) tarafından tetiklenen süt bol miktarda, salgılamaya başlar. Süt protein genleri esas emzirme sırasında serbest bırakılacak hipofiz PRL yanıt olarak, gebelikten laktasyon ^9,22,23 arasında değişen belirli bir zamansal zamanla aktif hale gelir. Buna paralel, MESCs hem ekstraselüler matriks arasındaki temaslar süt protein synt teşvikHücresel integrinler ve laminin ^24,25 arasındaki etkileşimlerin aracılık ettiği ve MESCs ^26,27 apoptoz bastırmak sinyallerin aracılığıyla nüklerde. Bu sinyal yolları belirli bir transkripsiyon aktivasyonu ²⁹ faktörleri ile süt protein geni promoterlerinden ²⁸ aktivasyonu ile sonuçlanır. Hücre-hücre kişileri de apikal kutupluluk kurulması ve süt ürünlerinin vektörel salgılanması da dahil olmak üzere farklılaşma bazı yönleri için önemlidir. Laktasyon ve MESCs başladıktan sonra hızla kapatmak sıkı bağlantılar ince yenidoğanlarda besin ihtiyaçlarına yanıt olarak kanda yanı sıra süt bileşenlerinin sentezi, taşınması ve salgılanması gelen moleküllerin alımını orchestrate. Emzirme sırasında, alveoller çevreleyen myoepitelyal hücrelerinin kasılması oksitosin yanıt olarak ortaya çıkar ve kanallar boyunca ve meme ucu içine süt fırlatma yol açar. Süt proteinleri içeren karmaşık bir sıvı (çoğunluklakazein), şekerler (özellikle laktoz) gibi immünoglobulinler A (IgA), büyüme faktörleri ve hormonlar gibi lipidler ve mineraller gibi biyolojik olarak aktif moleküller. Kazeinler, yani salgı yolu boyunca taşınan miseller, kazein, supramoleküler yapılarda monte sentezlenebilir ve daha sonra exocytosis tarafından yayımlanan, yani Mesc apikal plazma membranı ile kazein içeren salgı kabarcıklarına füzyonu (SVS) (Şekil 2).

Hücre içi trafik membranöz bölmeleri arasındaki maddi borsalarında dayanır ve gerektirir Çözünür N-etilmaleimit Duyarlı Füzyon (NSF) Eklenti Protein (SNAP) Reseptör (SNARE) ^30,31. SNARE proteinleri ailesi, hedef zarlarında lokalize veziküler vesikül membran içinde mevcut tuzak (v tuzak), ve hedef tuzak (t-tuzak) bölünmüştür. Bunların halkalaştırılmış halka etki ile sıkıştırma ile, v-ve t-tuzak oldukça dengeli bir dört sarmal demet kompleksi oluşturmak üzere birleşir, ifade inci gibie SNARE kompleksi. Bu kompleks giderek yakın ^30,32 içine getirerek iki karşıt lipit bilayers füzyon teşvik etmektedir. Daha sonra, Snare kompleksleri NSF adenozin trifosfat tarafından ayrışmış ve onun adaptör protein SNAP ve Snare proteinler kökenli ³³ kendi bölmesine geri geri dönüştürülür. İlginçtir ki, her SNARE protein ağırlıklı hücre içi füzyon olayları ³⁴ özgüllük katkıda bulunabilir farklı hücre bölmeleri ve SNARE eşleştirme bulunur. Daha önceki çalışmalar, en azından Protein 23 (SNAP23) ve veziküllü Associated Membrane Protein 8 (VAMP8) ve syntaxins (STX) sinaptozomal-ilişkili olduğunu göstermektedir -7 ve -12 kasein Ekzositoz ^35,36 bir rol oynayabilir. Bu proteinler aynı zamanda sütün lipid fraksiyon, örneğin, süt yağı globülleri (MFG'ler) ³⁷ ile bağlantılı olarak tespit edilmiştir. Mevcut olan model, sitoplazmik lipid damlacıkları (clds) nötr l birikimi ile oluşturulmaktadır öne sürülenipids (özellikle triaçilgliseroller ve sterol esterleri) ve endoplazmik retikulum (ER) zarında ^38-41 iki broşürler arasında anne diyet türetilen kolesterol. Büyük clds MESC apikal plazma membran ile sarılmış olan, tomurcuklanarak bunlar MFG'lerin olarak yayınlanırlar MESCs apikal tarafında (çapı 1-10 um) nakledilirken küçük CLD füzyonuyla, en azından kısmen oluşturulmaktadır ^40-42. Yavrular sütten ve MESCs giderek geri puberte durumuna (Şekil 1B, involution) için meme dokusunun gerileme neden apoptoz ile ölmek sonra Emzirme sona erer.

İmmünofloresan (IF) araştırma ve klinik teşhis hem de biyoloji neredeyse tüm yönleriyle kullanılan yaygın bir analitik laboratuvar yöntemidir. Teknikler doku kesitlerinde yapılabilir IF (immünohistokimya, İHK) veya hücre (immünsitokimya, ICC) örnekleri. Bu güçlü bir yaklaşım fluorescent- kullanımına dayanmaktadırÖzellikle bu şekilde floresan mikroskobu aracılığıyla doku dağılım gözönünde canlandırılmasına olanak tanıyan ilgilenilen antijene (doğrudan ya da dolaylı olarak) bağlanan etiketli antikorlar. Floresan sinyalleri çoğunlukla numunenin kalitesi ve konsantrasyonu antikorların ve doğru olarak kullanma bağlıdır. Basit bir indirekt immunfloresan (IIF) protokolü süt ürünleri (kazein ve MFG'ler) ve süt ürünleri salgılanması yer alan proteinler tespit etmek için sunulan fare meme dokusu (Şekil 3) donmuş bölümlerinde (butirofilin (BTN1), proteinler trampet). Bu protokol, doku toplama görüntü tedavi sonrası, eleştirel ve isteğe bağlı adımların yanı sıra bazı teknik önerilere kadar, tam bir İHK bakış sağlarken aynı zamanda sunulmuş ve tartışılmıştır.

Protokol

CD1 fareleri INRA (UE0907 IERP, Jouy-en-Josas, Fransa) yetiştirilmiş. Hayvan bakımı tüm etik yönleri Fransa Tarım Bakanlığı tarafından belirlenen ilgili kurallar ve lisans gereklerine uyulması. Kullanılan prosedürler (Comethea Jouy-en-Josas / AgroParisTech gelen anlaşma 12/097) yerel etik kurul tarafından onaylanmıştır.

1. Meme Bezi Numune Hazırlama

1. Fare meme bezi diseksiyon
   1. Servikal dislokasyon ile laktasyonun 10. günde fareler Euthanize ve karın yukarı bakacak şekilde aşağı hayvan pin.
   2. Etanol ile ventral bölgeyi ıslatın ve bir kağıt havlu ile kurulayın.
   3. Forseps kullanarak, iki arka bacaklarının arasına karın cildi yukarı çekin ve keskin bir makas ile yaklaşık 1 cm (sadece deri yoluyla) bir kesi yapmak. Bu ilk kesi başlayarak, daha sonra fare üzerinde boynuna cilt kadar kesmek için makas kullanın. Periton ve pi Cildi uzakta çekinn Bir kerede cilde bir tarafında aşağı o öğretti germe.
   4. Karın ve çubukla deriden uzak iterek ve nihayet çekerek veya uzak periton onları keserek inguinal meme bezlerinin toplayın.
      Not: Bu adımda Carmine boyama tüm bezi ⁴³ olan meme epitel görselleştirmek için gerçekleştirilebilir. Bu yaklaşım, çeşitli koşullarda (fizyolojik gelişim aşamaları, hastalıklar, in vivo tedavi) altında meme bezinin genel morfolojisi analiz etmek faydalı olabilir.
   5. Karın kavşağında ve kasık bezlerinde ⁴⁴ bulunan lenf düğümü çıkarın.
2. Meme dokusu tespit
   1. Mümkün olduğu kadar süt uzaklaştırmak için (PBS) çözeltisi, pH 7.4 bir fosfat tamponlu tuzlu su içinde bu parçaları yıkayın hemen bir neşter ile 3 mm ³ parça halinde meme doku kesip.
   2. Hızlı bir kağıda parçaları kurulayınhavlu ve buz üzerinde 10 ila 15 dakika süreyle% 4 paraformaldehid (PFA, HCHO,% 32 formaldehit çözeltisi, DİKKAT) içeren soğuk PBS çözeltisi koyun.
      Not: Bu IIF36 ve / veya in situ hibridizasyon ⁴⁵ meme dokusu dilimleri üzerinde bir sonraki analiz izin vermek için yeterli zamandır. Aldehid sabitleyiciler doku parçaları oldukça yavaş nüfuz Ancak, (~ saatte 1-3 mm), bu zaman doku numunesinin optimal fiksasyonu sağlamak için uzatılabilir. Alternatif olarak, bir fiksatif solüsyonu (bu çalışmada ayrıntılı olmayan) bir anestezi hayvan perfüze in vivo doku düzeltin.
3. Sukroz infüzyon
   1. Hızlı bir şekilde soğuk PBS meme parçalarını yıkayın ve hafifçe çalkalanarak altında 4 ° C de 16 saat 48 için% 40 sükroz (D-sakaroz, C12H22O11, Bay 342.3 g / mol) ihtiva eden soğuk bir PBS çözeltisi sokmaktan.
4. Doku gömme
   Not: Bu adımda, meme parçaları küçük parçaları (2-3 mm ³ yapmak için yeniden kesilebilir) Ya da şeklini ayarlamak için.
   1. Düzgün plastik kalıp etiket ve oda sıcaklığında muhafaza Ekim bileşiği ile kalıp hacminin 3 doldurun. Kalıp başına meme dokusunun bir parçası (2-3 mm ³⁾ yerleştirin ve OCT bileşiği ile örtün.
   2. (Alüminyum veya metal bir elek kullanılarak bir tabaka üzerine), sıvı azot yüzeyinde kalıpları yerleştirin ve ürün dondurularak izin verir.
      Not: sıvı azot içinde kalıp batırılması önce katı ve beyaz olmak zorundadır.
5. Doku kesitleri yapılana kadar -80 ° C'de donmuş örnekleri saklayın.

2. Donmuş doku Kesit

Not: esas olarak bir dondurucu içinde bir mikrotom olan bir kriyostat, donmuş doku bölümleri yapmak için gereklidir. Daha düşük bir sıcaklıkta, genellikle örneğin saf meme bezi gibi hayvansal yağ veya lipid bakımından zengin dokular için gereklidir.

1. ° C -26 kadar kriyostat sıcaklığını ayarlayın ve stabilitenin sahip kadar bekleyinlized. Tüm kesit işlem boyunca -26 ° C 'de dondurulmuş doku bloğu koruyun. Kesinlikle işlem sırasında herhangi bir zamanda doku çözündükten kaçının.
2. En az 10 dakika süreyle kriyostat yerleştirerek ° C -26 kadar jilet kesme desteği, anti-roll cihaz ve fırça soğutun. Ayrıca bölümler yapılmış gibi cam slaytlar saklamak edebilmek için kriyostat içinde bir slayt kutusu yerleştirin.
3. Düzgün RT'de onları doku bölümleri toplamak ve korumak için kullanılacak cam slaytlar etiket; Aksi takdirde doku bölümleri kendilerine bağlı olmayacaktır. Kriyostat içinde kalıp örneği çıkarın.
   Not: Kullanımı pozitif yüklü cam slaytlar büyük ölçüde nedeniyle yüksek elektrostatik çekim taze donmuş doku bölümleri yapışmasını tercih edecektir.
4. (Oda sıcaklığında tutulan) Ekim bileşiği ile metal doku diskin yüzeyini kaplayan ve bunun üzerine donmuş örneği itin. Islak kriyostat içinde monte yerleştirin ve co izinEn az 15 dakika boyunca ol elde edilir.
5. Kriyostat disk yuvasına ıslak montaj yerleştirin. Mümkünse, yeni keskin bıçak kullanın ya da en azından her bir örnek bu yana bazı dokular olacak hızla sıkıcı onu kesmek için kullanılan bıçak üzerinde alanını değiştirmek, 5-6 um kesim kalınlığı ayarlayın ve.
6. Dilimler eşit ve doğru oluşana kadar montaj orta kesim yaparak jilet üzerinde anti-roll cihazının konumunu ayarlayın. İdeal olarak, anti-roll cihazı yaklaşık 1 mm jilet üzerinde adım olacaktır.
7. Ayarların doğru olduğunu bir kez sürekli bir üniforma hareket tekerleği çevirerek doku bölümleri gerçekleştirin. Sıcaklık ideal sürece, bir doku kesiti, doğası gereği, bükmek için çalışacağız.
   1. Kapmak ve cam slayt istediğiniz gibi yerleştirmek için sahneye genelinde bölümü manevra için bir fırça kullanın. Dondurulmuş doku bloğu ve / veya jilet üzerinde muhtemelen mevcut kalıntıları temizlemek için bir fırça kullanın.
8. Çekkullanıcı doğru doku kesiti ve kriyostat sahneye bastırarak kaçının. O sahnede doku dilim ve böylece cam slayt ile onu kurtarmak için yetersizlik yapışması neden olabilir kriyostat sahneye doku kısmını bastırarak kaçının.
9. Bölümünde yukarıda tutarak ve doku bölüme dokunmak için aşağı olta balıkçılığı yoluyla, bir cam slayt yüzeyinde onları toplayıp doku kesitlerine teker teker alın.
   Not: Doku kesitleri hızla nedeniyle statik cazibe sıcak cama yapışır. Birkaç doku kesitleri aynı slaytta yerleştirilir, bunları üst üste ve uzay onları yeterince ayrı bir hidrofobik daire içine alın edebilmek için dikkatli olmak (bölüm 3.1.1 bakın.).

3. Dolaylı İmmünofloresan

1. Bölümleri yerlerinin
   1. Slayt monte doku etrafında bir hidrofobik daire çizmek için hidrofobik bir bariyer kalem kullanın. RT'de yaklaşık 1 dakika boyunca daire kurumasını bekleyin. T etrafında bir çizgi çizinSorun ince siyah kalıcı bir kalem ile bölümleri yanı sıra, fakat üzerinde doku kesitleri olan birine zıt cam slayt tarafı.
      Not: Bu çevre su itici ve aseton ve alkol çözünmeyen. Bu nedenle, IHC prosedüründe kullanılan sulu çözeltiler karşı bir bariyer sağlar ve gereken reaktifler hacmini azaltmaktadır.
   2. Oda sıcaklığında bir kaç dakika için ~ bir damla PBS 250 ul kaplayarak doku bölümleri rehidrate. ~ 10 ila 15 dakika süreyle PBS içinde yeni hazırlanmış bir% 3 PFA çözeltisi 250 ul kaplayarak doku bölümleri sabitleyin.
      Not: İsteğe bağlı olarak, bu durumda, bir aldehid söndürme çözeltisi kullanmak (50 mM amonyum klorid _(NH4CI, Bay PBS içinde 53,5 g / mol) ve 0.1 M glisin _(C2, H _5, NO 2, Bay 75,07 g / mol), PBS içinde ) sabitleme reaksiyonu durdurmak için. Basit ve bol miktarda PBS Yıkama reaksiyona girmemiş olan aldehit çıkanlması ve genel olarak yeterlidir.
2. Antijen alma (isteğe bağlı)
   Not: En antijenler, antijen alımı (AR) olmadan tespit edilebilir iken bu adımı yapılırsa, diğerleri sadece görülecektir. Bazı durumlarda, aynı zamanda, AR gözlenen sinyal değeri kılınmaktadır.
   1. Beher AR çözeltisi (100 mM Tris (Cı _{4H 11} NO _3, Bay 121.14),% 5 üre _{(NH2 CONH2,} Mr 60,06) pH 9.6) yerleştirin. AR çözeltisinin hacmi tamamen cam tutucu yerleştirilmiş cam slaytlar karşılamak için yeterli olmalıdır.
   2. Bir termometre ile takip edilerek 95 ° C'ye kadar AR çözeltisi önceden ısıtmak ve daha sonra uygun bir raf üzerinde cam slaytlar yer sıcak tamponu içinde raf immerge kapak buharlaşma sınırlayacak ve 95 ° C de 10 dakika inkübe etmek.
   3. Su banyosu beher çıkarın ve tampon maddesi içinde 10 dakika daha cam slaytlar bırakın.
3. Immunodeteksiyon
   1. PBS (~ 250 ul / bölüm) ile doku bölümleri durulayın ve bir çözüm ile onları doyurmak% 3 sığır serum albümini (BSA, ~ 250 ul / bölümü) oda sıcaklığında en az 30 dakika boyunca PBS içinde.
   2. PBS her doku bölümündeki% 2 BSA içeren seyreltilmiş primer antikor 30-50 ul koyun.
      Not: Bu birim tamamen doku bölümü kapsayan bir damla oluşturmak için yeterlidir.
   3. Birincil antikor olmayan bir negatif kontrol gerçekleştirmek için, bir doku bölümü üzerinde tek başına seyreltici, (PBS içinde% 2 BSA) ile aynı hacmi yerleştirin.
      1. Sistematik olarak, her IHC deneyde, bu negatif kontrol içerir ve (sekonder antikor ve / veya doku bir oto-floresan için spesifik-olmayan etiketleme) deneyi arka tahmin etmek için kullanılan her bir ikincil antikor için gerçekleştirin. Pozitif veya negatif kontrollerin diğer tipleri de (tartışmaya bakınız) etiketleme özgünlüğünü sağlamak için gerçekleştirilebilir.
   4. 4 ° C'de / nemlendirilmiş bir kutu O'da N cam slaytlar yerleştirin.
      Not: Kullanılan Birincil antikorlar fare monoklonal anti-sitokeratin vardı8 (CK8, 1:50 seyreltme), fare monoklonal 14 (CK14, 1:50 seyreltme), anti-sitokeratin, tavşan poliklonal anti-fare kasein (# 7781, 1:50 seyrelti, cömertçe MC Neville, Colorado Sağlık Üniversitesi tarafından sağlanan Bilimleri Merkezi, CO, USA), tavşan poliklonal anti-BTN1 (1: cömertçe IH Mather, Hayvan ve Kuş Bilimleri Bölümü, University of Maryland, College Park, MD, ABD), tavşan poliklonal anti-Stx6 (tarafından sağlanan 300 seyreltme, cömertçe S. Tooze, Cancer Research, İngiltere, Londra Araştırma Enstitüsü, Londra, UK) ve tavşan poliklonal anti-VAMP4 (1:50 seyreltme) tarafından sağlanan 1:50 seyrelti,.
   5. İyice oda sıcaklığında 10 dakika boyunca PBS ile en az dört kez doku bölümleri yıkayın.
   6. PBS,% 2 BSA içeren tüm doku kesitlerinde Bu çözeltinin 30-50 ul koyun ve 1.5 saat boyunca inkübe: Uygun ikincil antikoru (300 seyreltme rodamin-konjuge keçi anti-tavşan IgG (H + L), 1) seyreltin oda sıcaklığında karıştırıldı.
      1. Fluorochromes ışığa duyarlı moleküller olduğundan, yokOnların analize kadar ışığa doku bölümleri maruz bırakmaktadır. Hücre zarları, düşük etiketleme engelleyebilir yeşil bir otomatik floresan üretmek eğilimindedir beri doku kesitlerinde IIF, kırmızı flüorofora bağlı ikincil antikorlar lehine. Ayrıca, kırmızı bir florofor-bağlı ikincil antikor seçiminde nötral lipidlerin (aşağıya bakınız) eşlik eden etiketleme sağlar.
   7. İyice oda sıcaklığında 10 dakika boyunca PBS ile en az dört kez doku bölümleri yıkayın.
4. Post-fiksasyon (isteğe bağlı)
   1. Bazı deneyler için, antijen / antikor iskeleleri stabilize etmek için oda sıcaklığında 10 dakika süreyle PBS içinde seyreltilmiş 2% PFA için örneklerin inkübe edilmesi ile sonradan tespit gerçekleştirin. Bununla birlikte, bu adım birçok durumda gerek kalmaz.
5. Nötr lipidler ve DNA counterstaining
   1. BODIPY 493 3 ug / ml ihtiva eden bir PBS çözeltisinden 30-50 ul doku bölümleri inkübe edilerek clds ve MFG'ler, renk nötr lipidler görselleştirmek içinOda sıcaklığında 10 dakika süreyle / 503. Hızla PBS ile iki kez doku bölümleri yıkayın.
   2. Oda sıcaklığında 10 dakika boyunca DAPI (4-6-diamidino-2-fenilindol, 5 mg / ml stok çözeltisi) 3 uM ihtiva eden bir PBS çözeltisinden 30-50 ul nükleer DNA Counterstain. Gözlem için slaytlar monte etmeden önce PBS ile iki kez doku bölümleri yıkayın.
6. Bölüm montaj
   1. PBS çıkarın ve her doku bölümünde montaj orta bir damla yerleştirin.
   2. Hava kabarcıklarını önlemek, slayt karşı bir açıyla kapak kayma bir tarafını yerleştirin sıvı damla dış kenarı ile temas ve sonra yavaşça kapağı indirin. Sıvı bir kaç dakika için cam slayt ve kapak slip arasında yayılır ve daha sonra bir kağıt havlu ile orta montaj fazlasının ayrılması için izin verir.
   3. Gözlem kadar ışığa maruz kaldıkları önlemek için 4 ° C'de oje ve mağaza doku bölümleri ile cam slayt kapak kayma mühür.

4. Floresan Gözlem ve Image Acquisition

Not: görüntü alma yazılımı tarafından kontrol edilen bir kamera İHK sonuçlarını gözlemlemek için gerekli donatılmış bir floresan mikroskop.

1. Görüntüleri elde etmeden önce, etiketleme yoğunluğunu kontrol etmek ve negatif kontroller bakarak deneyin arka değerlendirir. Tek tek her floresan etiket (renk kanalı) fotoğraflarını edinin.
2. Her renk kanalı için aynı koşullar (pozlama ve genel ayarlar) karşılık gelen kontrol de dahil olmak üzere, tüm resimleri edinin.
3. Geleneksel mikroskopi
   1. 63 (yağ daldırma, NA 1.3) hedefleri ve DP50 görüntüleme kamerasını × 20 × standart floresein izotiyosiyanat için filtreler (FITC, yeşil), rodamin (kırmızı) ve DAPI (mavi) emisyonları ile donatılmış bir mikroskop ile Epifloresans mikroskopi gerçekleştirin.
4. Mikroskopisi
5. Bir MICROS ile konfokal mikroskopi gerçekleştirin63 (yağ daldırma, NA 1.4) hedefleri ve lazer 488- ve 568 nm dalga boylarında uyarım × × 20 kullanılarak, ZEN yazılımı ile donatılmış başa çıkabilmek.

5. Görüntü Tedavisi

Not: Tüm görüntü sonrası tedaviler ImageJ özgür yazılım (http://imagej.nih.gov/ij/) kullanılarak yapılmaktadır.

1. Görüntüyü üst üste (birleştirme)
   1. (Dosya / Aç) kombine olacak her kanalda edinilen görüntüleri açın. 8-bit gri tonlamalı görüntüleri ile çalışan varsa, arama tablosunu (Resim / Arama Tabloları) kullanarak her kanala yapay renk bağlıyor.
   2. Her kanala bir renk atfetmek ardından (Görüntü / Renkli / Kanallar Birleştirme) "Kanal Birleştirme" komutunu kullanarak ve gri tonlama veya renkli görüntülerden kompozit resmi oluşturun.
   3. (Dosya / Aç) kombine olacak her kanalda edinilen yığınları açılması ve & kanallarını Birleştirme "komutunu kullanarak görüntü aynı şekilde superimposition yığınlarının gerçekleştirin# 8221; Her kanala bir renk atfetmek (Görüntü / Renkli / Kanalları Birleştirme). Bir görüntü dizisi gibi kompozit yığını Kaydet veya bir film olarak (bölüm 5.4).
2. Görüntü yığını Z projeksiyon
   1. Görüntü düzlemi (z ekseni) dik eksen boyunca onları yansıtarak bir görüntü yığınının tüm resimlerin iki boyutlu bir görünüm sağlamak için Z projeksiyon işlevini (Resim / Stack / Zproject Max Yoğunluğu) kullanın. "Maksimum Yoğunluk" seçeneği her piksel yığınının tüm görüntüleri üzerinde maksimum değeri içeren bir görüntü oluşturur. Bu, belirli bir kanala veya birkaç kanal üst üste sonra tüm görüntü yığınını gözlenen tüm lekelenme görselleştirme sağlayan tek bir görüntü oluşturur.
3. Görüntü yığını 3D projeksiyon
   1. Bir düzlem üzerine dönen hacim projeksiyonları bir dizi oluşturmak için 3D projeksiyon komutunu (Resim / Stack / 3D projesi, parlak Noktası, y-ekseni) kullanın. Su görsel renderediniz varsa ve iç yapıları hem projeksiyon yöntemi (en yakın nokta, burada kullanılan parlak nokta () veya ortalama değeri) bağlıdır ve görselleştirme parametreleri seçildi. Animasyonlu dizinin Her kare, farklı bir görüş açısı çıkıntı sonucudur.
   2. Üç ortogonal eksen (y-ekseni burada seçildi) her etrafında oluşturulan 3D görüntüyü döndürmek. Tek bir resim veya bir film olarak üretilen dizisi kaydedin.
4. Film dönüşüm Görüntü yığını
   1. Görüntü yığını (Dosya / Aç) açın ve şu komutu "AVI" (Dosya / Kaydet / AVI) kullanarak AVI formatında bir film olarak kaydedebilirsiniz.

Sonuçlar

Meme bezi toraks ve kemirgenler karın hem ventral yapısı boyunca yer alan deri altı bezdir. Gebelik sırasında fare bezleri beş çift konumu Şekil 4'te gösterilmiştir. Meme bezi morfolojisi önemli ölçüde tam bir emzirme (Şekil 1B) hazırlamak için gerekli olan fonksiyonel değişiklikler yansıtan gelişimi sırasında değişir. Saf ya da doğum yapmamış hayvanlarda, meme bezi görülmesi zor olabilir ince bir yağ stroma içinde göm?...

Tartışmalar

IHC esas olarak belirli bir epitop antikor etkileşimlerine bağlıdır doku bölgeleri, antijeni lokalize için nispeten basit ve kolay bir deney yöntemidir. Protokolleri sayıda IIF bir proteinin lokalize etmek için kullanılsa da, bu işlemler çekirdek hemen hemen her zaman aynıdır. Ancak, güçlü bir sonucu etkileyebilir ve bu nedenle her İHK çalışma için optimize edilmesi gereken bazı kritik yönleri vardır. Bu yaklaşımın en zor yanı, yani en iyi deneysel koşullarını belirlemektir., Ilg...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dissection
Pins
Ethanol
Scissors
Scalpel and adapted blades
Ice
Towel paper
Tissue sample preparation	Company	Catalog Number	Comments/Description
Phosphate Buffered Saline (pH7.4)	Sigma	P-3813
Paraformaldehyde (PFA, 32% EM grade, 100 ml)	Electron Microscopy Sciences	15714-S	personnal protection equipment required WARNING: this product will expose you to Formaldehyde Gas, a chemical known to cause cancer
OCT compound/Tissue Tek	Sakura	4583
Sucrose (D-saccharose)	VWR	27480.294
Plastic molds	Dominique Dutscher	39910
Liquid nitrogen
Cryostat/sample support	Leica	CM3050S
Razor blades (SEC35)	Thermo Scientific	152200
Slide box
Glass slides Superfrost/Superfrost Ultra Plus	Thermo Scientific	10143560W90/1014356190
Brushes
IHC	Company	Catalog Number	Comments/Description
Super Pap Pen	Sigma	Z377821-1EA
Permanent marker (black)
50 mM NH4Cl in PBS	Sigma	A-0171
0.1 M glycine in PBS	VWR	24403.367
Antigen Retrieval solution: Tris 100 mM 5% urea pH9.6
Heater (up to 100°C)
Bovine Serum Albumin (BSA)	Sigma	A7906-100G
Vectashield (anti-fading mounting medium) without DAPI/with DAPI	Vector Laboratories	H-1000/H-1200
Glass coverslips 22x50mm (microscopy grade)	VWR	CORN2980-225
Nail polish
Primary antibodies	Company	Catalog Number	Comments/Description
Rabbit anti-mouse caseins (#7781; 1:50 dilution)	generously gifted by M.C. Neville (University of Colorado Health Sciences Center, USA)
Mouse anti-cytokeratin 8 (CK8, clone 1E8, 1:50 dilution)	Biolegend (Covance)	MMS-162P
Mouse anti-cytokeratin 14 (CK14, cloneLL002, 1:50 dilution)	Thermo Scientific	MS-115-P0/P1
Rabbit anti-butyrophilin (1:300 dilution)	generously gifted by I.H. Mather (Department of Animal and Avian Sciences University of Maryland College Park, USA)
Rabbit anti-Stx6 (1:50 dilution)	generously gifted S. Tooze (Cancer Research UK, London Research Institute, London, UK)
Rabbit anti-VAMP4 (1:50 dilution)	Abcam	ab3348
Secondary antibodies	Company	Catalog Number	Comments/Description
Rhodamine-conjugated goat anti-rabbit IgG (H + L) (1:300 dilution)	Jackson ImmunoResearch Laboratories	111-025-003
Counterstains	Company	Catalog Number	Comments/Description
Bodipy 493/503	Life Technologies (Molecular Probes)	D-3922
DAPI (4-6-diamidino-2-phenylindole)	Life Technologies (Molecular Probes)	D-1306
Observation/Image capture	Company	Catalog Number	Comments/Description
conventional fluorescence microscope	Leica Leitz DMRB microscope		Standard filters for FITC, Rhodamine and DAPI emissions,                     ×63 oil-immersion objective (NA 1.3), DP50 imaging camera (Olympus), CellˆF software (Olympus)
Laser Scanning Microscope (confocal microscopy)	Zeiss LSM 510 microscope		Plan-Apochromat ×63 oil-immersion objective (NA 1.4),                  CLSM 510 software,               Confocal facilities, MIMA2 Platform, INRA Jouy-en-Josas, France, http://mima2.jouy.inra.fr/mima2)
Image treatment	Company	Catalog Number	Comments/Description
ImageJ 1.49k software			Free software