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要約

この資料に記載されている間接免疫プロトコルは、検出およびマウス乳腺中のタンパク質の局在を可能にします。完全な方法は、乳腺のサンプルを調製するために蛍光顕微鏡により画像を、組織切片の免疫組織化学を実行し、画像を再構成するために与えられています。

要約

間接免疫蛍光を検出し、組織中の目的のタンパク質を特定するために使用されます。ここに提示されたプロトコルは、タンパク質の免疫検出のために完全かつ簡単な方法は、乳腺泌乳マウスを例に説明しています。特にマウス乳腺腺、組織固定および凍結組織切片の解剖に関する組織サンプルの調製のためのプロトコールは、詳述されています。標準プロトコルは、任意の抗原回復工程を含む、間接免疫蛍光法を実行することも示されています。ラベルされた組織切片の観察と同様に、画像取得および後処理も記載されています。この手順は、動物組織のコレクションからのタンパク質の細胞内局在に、完全な概要を説明します。この一般的な方法は、他の組織サンプルに適用することができるが、それは、試験した各組織/一次抗体に結合するように適合されるべきです。

概要

乳腺は、その主な機能新生児を養うためにミルクを生産することである非定型哺乳類の外分泌器官です。乳房組織の開発は主に出生後に発生し、上皮が周囲の間質に侵入するユニークなプロセスによって特徴付けられます。この組織は、同時に生殖状態の変化（ 図1）で、特に大人の寿命の間に、多くの変更（増殖、分化および回帰）を受けます。組織の全体的な形態に加えて、異なる細胞型の割合だけでなく、乳腺内での配置が劇的に発展1-5中に変化します。

胚生活の間に、乳腺上皮は、胎生10.5（E10.5）（ 図1Aの周りの正中線の両側に前後と後肢の間、外胚葉のわずかな肥厚と層化によって定義されている乳房ミルクラインから派生）。E11.5で、ミルクラインが対称的に再現可能な場所で乳腺のミルクラインに沿って位置し、周囲の間充織が凝縮し始めている個々のプラコード、に分割します。プラコードは、真皮に深く沈み始め、乳腺間葉は乳腺芽（E12.5-E14.5）の周りに同心円状の層に編成されます。 E15.5の時点では、乳腺上皮は、増殖し、脂肪パッドに向けて乳腺間葉を通して押し出す主な芽を形成するために細長くを開始します。主な芽は乳首シースの形成によってマークされ、皮膚への開口部を有する中空内腔を、開発しています。 E18.5では、伸長ダクトは脂肪パッドに成長していると小さな樹状の管系に分岐した脂肪パッドに含まれます。開発は、基本的に逮捕され、基本的な乳腺は思春期までmorphogenetically静止のまま。男性の胚では、アンドロゲン受容体の活性化は消え芽の変性につながりますE15.5によって。 E18のように、乳房の発達は、思春期6-9まで停止します。

出生時に、乳腺はゆっくり伸びや枝初歩的な管系（アイソメトリック成長）を保有します。思春期の開始時に、ダクトの先端に位置する球状構造が末端芽（TEBS）が、キャップ細胞の外層と細胞の多層内部コア（体細胞）から形成されていると呼ばれます。これらの構造は非常に増殖性であり、ホルモンの合図に応答して、周囲の間質組織に潜入。乳管の伸長でTEBS結果内増殖は、分枝形態形成と相まって。このプロセスは、ニップル（ 図1B、思春期）から発せられる基本的な上皮樹状のネットワークの構築につながります。上皮が全体の脂肪パッドに侵入した時に生後〜10〜12週目に、その拡張は停止し、TEBSが消えます。乳管の開発は、動的変化、 すなわち 、successiを受けます発情周期10（ 図1B、成人）によると、上皮細胞の増殖と回帰しまし。

妊娠の発症から、乳房組織は、授乳の準備をするために重要な成長と形態学的変化を受けます。乳腺上皮は、広範囲に増殖し、分化する、高度に分岐した尿細管肺胞ネットワークにつながります。付随して、乳腺上皮細胞（のMEC）は、偏光と乳製品を合成し、分泌できるようになります。 MECは、収縮筋上皮細胞に囲まれており、結合および脂肪組織、血管や神経終末（ 図1B、妊娠）からなる間質に組み込まれている多数の肺胞構造（腺房）に整理します。さらに、のMECの基底側は基底膜（細胞外マトリックス）に密着しており、これら2つのエンティティ間の相互作用は、しっかりと乳房の両方の形態形成および分泌機能を調節しますRY上皮11-13。

これらのプロセスはすべて最も重要なのはhormones14、パラクリン因子や細胞外マトリックスであるの様々な環境手がかりの作用に依存しています。例えば、プロゲステロンは広範側分岐15を誘導し、そのalveologenesis、プロラクチン（PRL）16,17との組み合わせで、肺胞の分化を促進し、維持します。ステロイドとPRL18、サイトカインおよび開発に関連するシグナル伝達経路に加えて、（Wntおよびシグナル伝達経路ノッチ）も乳腺系譜コミットメントと開発19-21に関与しています。妊娠の終わりには、管腔のMECは、肺胞の内腔に初乳として知られるタンパク質が豊富な牛乳を生成し始めます。また、プロゲステロンは、上皮透過性に作用し、タイトジャンクショ​​ンがまだ開いているので、初乳はまた、母体血流中に見出されます。

分娩後、mammarY上皮は（ 図2、乳腺上皮）ほぼすべての乳腺ボリュームのアップかかり、高度に組織化されています。乳汁産生の単位、すなわち肺胞（ 図2、肺胞）は、それらの頂端細胞膜の内腔を画定して、偏乳房上皮分泌細胞（たmESC）の単層によって形成されます。肺胞は、外部環境（ 図2、葉）にミルクを排出ダクトに接続されたローブにグループ化されている小葉に自分自身を配置します。母乳は、発生すなわち 、たmESCは主に胎盤ホルモンの低下（主にプロゲステロン）（ 図1B、母乳）によってトリガミルクの豊富な量を分泌し始めます。乳タンパク質遺伝子は、主に授乳時に放出され、下垂体PRLに応答して、妊娠から授乳9,22,23の範囲で定義された一時的な時間経過で活性化されます。付随して、たmESCと細胞外マトリックス間の接触は、乳タンパク質SYNTを刺激両方携帯インテグリンおよびラミニン24,25の間の相互作用を介して媒介され、たmESC 26,27においてアポトーシスを抑制した信号を通じてhesis。これらのシグナル伝達経路は、特定の転写因子の活性化を介して29乳タンパク質遺伝子プロモーター28の活性化をもたらします。細胞間接触は、頂端の極性の確立と乳製品のベクトル分泌を含む分化のいくつかの側面のためにも重要です。授乳やたmESCの開始後速やかに近いタイトジャンクショ​​ンは細かく新生児の栄養要求に応じて、血液からの分子の取り込みだけでなく、乳成分の合成、輸送および分泌を調整。授乳時には、肺胞を取り巻く筋上皮細胞の収縮は、オキシトシンに反応して発生し、ダクトを通って乳首に射乳につながります。ミルクはタンパク質を含む複雑な流体（主にありますカゼイン）、糖（主に乳糖）、脂質、ミネラル、ならびにそのような免疫グロブリンA（IgAの）、成長因子およびホルモンなどの生理活性分子。カゼイン、すなわち分泌経路に沿って搬送ミセル、カゼイン、超分子構造に組み立てられ、合成され、その後、エキソサイトーシスにより放出され、すなわち 、MESCの頂端細胞膜でのカゼイン含有分泌小胞の融合（のSV）（ 図2）。

細胞内のトラフィックは、膜状の区画間の材料の交換に依存しており、可溶性N-エチルマレイミド感受性融合（NSF）付着タンパク質（SNAP）受容体（SNARE）30,31を含んでいます。 SNAREタンパク質ファミリーは、ターゲット膜に局在水疱性小胞膜内に存在するのSNARE（V-のSNARE）、および目標のSNARE（T-のSNARE）に細分されます。それらのコイルドコイルドメイン、VおよびTのSNAREは非常に安定な4ヘリックス束複合体を形成するために組み立てを通してジッピングによって、目と称される電子スネア複合体。この複合体は徐々に近接30,32にそれらをもたらすことによって、2つの対向する脂質二重層の融合を促進します。その後、SNARE複合体は、NSFアデノシン三リン酸によって解離され、そのアダプタータンパク質SNAPおよびSNAREタンパク質は、起源33のその区画に戻して再利用されています。興味深いことに、各SNAREタンパク質は、主に個別の細胞区画内に存在し、SNAREのペアリングは、細胞内の融合事象34の特異性に寄与することができます。以前の研究では、少なくともタンパク質23（SNAP23）および小胞関連膜タンパク質8（VAMP8）、およびシンタキシン（のStx）のシナプトソームが関連することを示唆している-7および-12カゼインエキソサイトーシス35,36における役割を果たしています。これらのタンパク質はまた、乳の脂質画分、 すなわち 、乳脂肪球（MFGs）37に関連して発見されています。現在の支配的なモデルは、細胞質脂質滴（CLDs）は中立リットルの蓄積によって形成されていることを仮定しますipids（主にトリアシルグリセロールおよびステロールエステル）および小胞体（ER）膜38〜41の2リーフレットの間の母体の食事由来のコレステロール。彼らは（直径1〜10ミクロン）MFGsとしてリリースされたmESCの頂端側に輸送されながら大CLDsはMESC頂端形質膜によって包まれて、出芽によって少なくとも部分的には、小さいCLDsの融合によって形成され、 40-42。子犬が乳離れした後に授乳を停止し、たmESCは徐々にアポトーシスによって死ぬ、バック思春期状態（ 図1B、退縮）に乳房組織の回帰につながります。

免疫蛍光（IF）は、研究および臨床診断の両方で、生物学のほぼすべての面で使用される一般的な分析実験室の方法です。技術は、組織切片（免疫組織化学、IHC）または細胞（免疫細胞化学、ICC）のサンプル上で行うことができます。この強力なアプローチはfluorescent-の使用に依存しています具体的にはこのようにして、蛍光顕微鏡を通じて組織分布の可視化を可能にする、目的の抗原に（直接または間接的に）結合する標識された抗体。蛍光シグナルは、主に品質や濃度の抗体と試料の適切な処理に依存します。単純な間接免疫蛍光（IIF）プロトコルは、乳製品（カゼインとMFGs）およびマウス乳房組織（ 図3）の凍結切片上の乳製品分泌（butyrophilin（BTN1）、SNAREタンパク質）に関与するタンパク質を検出するために提示されます。このプロトコルは、組織採取から画像後処理、クリティカルおよびオプションのステップだけでなく、いくつかの技術的な勧告に至るまで、完全なIHCの概要を提供していますが、また提示し、議論されています。

プロトコル

CD1マウスは、INRA（UE0907 IERP、ジュイ・アン・ジョザス、フランス）で飼育しました。動物のケアのすべての倫理的側面は、農業のフランスの省が定めた関連するガイドラインとライセンス要件を遵守。使用手順は、（Cometheaジュイ・アン・ジョザス/ AgroParisTechから契約12/097）ローカル倫理委員会によって承認されました。

1.乳腺サンプル調製

  1. マウス乳腺の解剖
    1. 頸椎脱臼により授乳の10日目にマウスを安楽死させると、その腹部を上に向けてダウン動物をピン。
    2. エタノールで腹側領域を湿らせ、ペーパータオルでそれを乾燥させます。
    3. 鉗子を使用して、2つの後ろ足の間に腹部の皮膚を引き上げ、鋭いハサミで約1cmの（唯一の皮膚を通して）切開を行います。この最初の切開から始めて、その後、マウスの首に皮膚をカットするはさみを使用してください。腹膜およびPIから皮膚を引き離しますnは時間の皮膚の片側の下、それは教えてストレッチ。
    4. 綿棒で皮膚からそれらを押し、最後に引いたり離れ腹膜からそれらを切断することにより、腹部および鼠径部乳腺を収集します。
      注：このステップでカーミン染色全腺43内の乳腺上皮を可視化するために行うことができます。このアプローチは、（インビボでの治療において、生理的発達段階、疾患）は、様々な条件下での乳腺の全体的な形態を分析するのに有用であり得ます。
    5. 腹部の接合部と鼠径腺44にあるリンパ節を削除します。
  2. 乳腺組織固定
    1. メスで3ミリメートル3断片に乳腺組織を切断し、すぐにできるだけ多くのミルクを除去するためにリン酸緩衝生理食塩水（PBS）溶液のpH 7.4、これらの断片をすすぎます。
    2. すぐに紙の上に断片を乾燥タオルと氷上で10〜15分間、4％パラホルムアルデヒド（PFA、HCHO、32％ホルムアルデヒド溶液、注意）を含有する冷PBS溶液に入れて。
      注：これはIIF36によっておよび/ ​​またはin situハイブリダイゼーション45に乳腺組織切片上でその後の分析を可能にするために十分な時間です。アルデヒド固定液は、組織片（毎時〜1-3 mm）のではなく、ゆっくりと浸透するようしかし、この時間は、組織サンプルの最適な固定を確実にするために拡張することができます。また、固定液（本研究では詳述しない）で麻酔した動物を灌流することにより、in vivoで組織を固定します。
  3. スクロース注入
    1. すぐに冷PBSで乳腺の断片をすすぎ、穏やかに振盪下に4℃で16〜48時間、40％スクロース（D-サッカロース、C12H22O11、ミスター342.3グラム/モル）を含有する冷PBS溶液でそれらを浸します。
  4. 組織埋め込み
    注：このステップでは、乳房のフラグメントは小さな断片を作るために再切断することができる（2-3 mmの3）またはその形状を調整します。
    1. 適切にプラスチック金型にラベルを付け、OCT化合物と金型の体積の3分の1を記入し、室温で維持しました。金型ごとの乳房組織の一つの断片（2-3 mm 3で）を配置し、OCT化合物でそれをカバーしています。
    2. 液体窒素（アルミのシート上や金属篩を用いて）の表面に金型を置き、製品を凍結することができます。
      注：これは、液体窒素中で金型を浸漬する前に、固体と白にならなければなりません。
  5. 組織切片が実行されるまで-80℃で凍結したサンプルを保管してください。

2.凍結組織セクショニング

注：基本的に冷凍庫内部ミクロトームでクライオスタットは、凍結組織切片を作成するのに必須です。より低い温度は、多くの場合、処女乳腺などの脂肪または脂質の多い組織のために必要とされます。

  1. ℃〜-26にクライオスタットの温度を調整し、それがスタビを有するまで待ちますlized。全体セクショニング手順を通して、-26℃で凍結した組織ブロックを維持します。絶対に手続き中の任意の時点で組織を解凍することは避けてください。
  2. 少なくとも10分間、クライオスタット内にそれらを配置することにより、C°-26にカミソリの刃、切断のサポート、アンチロール装置とブラシを冷却します。また、セクションが行われるように、ガラススライドを保存できるようにするために、クライオスタットの内側スライドボックスを配置します。
  3. 適切に組織切片を採取し、室温でそれらを維持するために使用されるガラススライドにラベルを付けます。そうでない場合は組織切片は、それらに付着しません。クライオスタット内部モールドからサンプルを削除します。
    注：正に荷電したガラススライドを使用すると、大幅により高い静電引力に新鮮凍結組織切片の接着に有利であろう。
  4. （室温で維持される）10月化合物と金属組織のディスクの表面を覆い、その上に凍結サンプルを押してください。ウェットクライオスタット内部にマウント置き、共同しましょう少なくとも15分間OL。
  5. クライオスタットのディスクホルダに湿ったマウントを配置します。 5-6μmのカットの厚さを調整し、可能な場合は、新しい鋭い刃を使用するか、少なくともいくつかの組織はすぐに退屈なことになるので、各サンプルを切断するために使用されるブレード上の領域を変更します。
  6. スライスが均等にかつ正確に形成されるまで、封入剤のカットを行うことで、カミソリの刃の上にアンチロール装置の位置を調整します。理想的には、アンチロール装置は、1mm程度カミソリの刃の上にステップインします。
  7. 設定が正しいならば、連続的に均一な運動でホイールを回すことで、組織切片を行います。温度が理想的でない限り、組織切片は、性質上、丸くしようとします。
    1. 取得し、スライドガラス上に、必要に応じてそれを配置するために、ステージ全体のセクションを操縦するためにブラシを使用してください。凍結組織ブロックおよび/または剃刀の刃上に存在する可能性が残ってクリーンアップするためにブラシを使用してください。
  8. 引くユーザーに向けた組織切片とクライオスタットのステージにそれを押すことは避けてください。それは、ステージ上の組織切片の接着、ガラススライドでそれを回復することができないことにつながる可能性としてクライオスタットのステージに組織切片を押す避けてください。
  9. セクションの上にそれを保持し、組織切片に触れ、それを下に傾けることにより、スライドガラスの表面でそれらをピックアップして、組織切片を一つずつ取り出します。
    注：組織切片を迅速に静電引力による温かいガラスに付着します。いくつかの組織切片は、同じスライド上に配置されている場合は、それらをオーバーラップするようにし、スペースには十分に個別に疎水性の円で囲むことができないように注意してください（3.1.1項を参照してください。）。

3.間接免疫

  1. セクションの検索
    1. スライドに取り付けられた組織の周りに疎水性の円を描くように、疎水性バリアペンを使用してください。室温で約1分間、サークル、乾燥をしてみましょう。トンの周りに線を引きます細かい黒の油性マジックでの問題のセクションだけでなく、ガラススライド側の組織切片である1と反対。
      注：この円は、撥水とアセトンとアルコールに不溶です。したがって、IHC手順中に使用される水溶液に対する障壁を提供し、必要な試薬の量を減少させます。
    2. 室温で数分間のPBS〜250μLのドロップでそれらを覆うことにより、組織切片を再水和。 10〜15分間、PBS中の新たに調製した3％PFA溶液を〜250μlのでそれらを覆うことにより、組織切片を固定してください。
      注：必要に応じて、この場合に、PBS中のアルデヒド急冷溶液（50mMの塩化アンモニウム（NH 4 Clで、氏53.5グラム/モル）を使用するか、またはPBS中の0.1Mのグリシン（C 2 H 5 NO 2、ミスター75.07グラム/モル） ）固定反応を停止します。シンプルで豊かなPBS洗浄、未反応のアルデヒドを除去するために、一般的に十分です。
  2. 抗原検索（オプション）
    注：ほとんどの抗原は、抗原回復（AR）なしに検出することができるが、他のものは、このステップが実行された場合にのみ観察されます。いくつかの場合において、ARはまた、観測信号の増強を可能にします。
    1. ビーカー内のAR溶液（100 mMトリス（C 4 H 11 NO 3、ミスター121.14）は、5％尿素（NH 2 CONH 2、ミスター60.06）は、pH 9.6）を配置します。 AR溶液の量は、完全にガラスホルダーに入れたガラススライドをカバーするのに十分なものでなければなりません。
    2. 温度計で温度を監視することにより95°CまでAR溶液を予熱した後、適切なラックにスライドガラスを置き、ホットバッファにラックを飛び込む、カバーは、蒸発を制限し、95℃で10分間インキュベートします。
    3. 水浴からビーカーを取り出して、バッファ内の別の10分間ガラススライドを残します。
  3. 免疫検出
    1. PBS（〜250μL/セクション）を組織切片をすすぎ、溶液を用いて、それらを飽和RTで少なくとも30分間、PBS中の3％ウシ血清アルブミン（BSA、〜250μL/セクション）の。
    2. 各組織切片上の2％BSAを含むPBSで希釈した一次抗体の30〜50μLを入れてください。
      注：このボリュームは完全に組織切片をカバーするドロップを形成するのに十分です。
    3. 一次抗体なしのネガティブコントロールを実行するために組織切片上で単独の希釈剤（PBS中の2％BSA）の同体積を置きます。
      1. 系統的各IHC実験では、このネガティブコントロールが含まれており、（これは二次抗体、および/または組織の自家蛍光に非特異的標識）は、実験のバックグラウンドを推定するために使用される各二次抗体のために行います。ポジティブ又はネガティブコントロールの他のタイプは、（説明を参照）、標識の特異性を確実にするために行うことができます。
    4. 4℃の加湿ボックス、O / Nでガラススライドを置きます。
      注：使用した一次抗体は、マウスモノクローナル抗サイトケラチンました寛大MCネビル、コロラド州保健大学が提供する8（CK8、1:50希釈）、マウスモノクローナル抗サイトケラチン14（CK14、1:50希釈）、ウサギポリクローナル抗マウスカゼイン（＃7781、1:50希釈、科学総合研究センター、CO、USA）、ウサギポリクローナル抗BTN1（1：寛大IHメイザー、動物や鳥科学科、メリーランド大学、カレッジパーク、メリーランド州、米国）、ウサギポリクローナル抗Stx6（が提供する300希釈、寛大S. Tooze、癌研究イギリス、ロンドン研究所、ロンドン、英国）とウサギポリクローナル抗VAMP4（1:50希釈）により提供される1:50希釈、。
    5. 十分にRTで10分間、少なくとも4回、PBSで組織切片を洗浄します。
    6. 、2％BSAを含有するPBS中のすべての組織切片上でこの溶液の30-50μLを入れ、そして1.5時間インキュベートする。適切な二次抗体（300希釈ローダミン結合ヤギ抗ウサギIgG（H + L）、1）希釈RTで。
      1. 蛍光色素は、感光性分子であるので、ありません彼らの分析まで、光に組織切片を公開します。細胞膜は低い標識を妨害することができる緑色自己蛍光を発生する傾向があるので、組織切片上のIIFは、赤色蛍光体に結合された二次抗体を好みます。また、赤色の蛍光団結合二次抗体を選択すると、中性脂質（下記参照）の同時標識化を可能にします。
    7. 完全に室温で10分間、PBSで少なくとも4回の組織切片を洗浄します。
  4. ポスト固定（オプション）
    1. いくつかの実験のために、抗原/抗体足場を安定化させるために室温で10分間、PBSで希釈した2％PFAを有する試料をインキュベートすることによって、ポスト固定を行います。しかし、この手順は、ほとんどの場合には、省略することができます。
  5. 中性脂質及びDNAの対比
    1. BODIPY 493の3μgの/ mlで含むPBS溶液の30~50μlの組織切片をインキュベートすることによってCLDsとMFGs、色中性脂質を可視化します/ RTで10分間503。急速にPBSで2回組織切片をリンス。
    2. RTで10分間DAPI（4-6ジアミジノ-2-フェニルインドール、5 mg / mlのストック溶液）の3μMを含むPBS溶液を30~50μlの核DNA対比。観察用のスライドをマウントする前にPBSで2回組織切片を洗浄してください。
  6. 第実装
    1. PBSを削除し、各組織部にメディアをマウントするのドロップを置きます。
    2. 液滴の外縁に接触して、スライドに対する角度でカバースリップの片側を置き、ゆっくりとカバーを下げて、気泡を避けます。液体は数分間スライドガラスとカバースリップの間に広がった後、ペーパータオルでメディアをマウントするの過剰を削除することができます。
    3. 観察されるまで、光への曝露を防止するために4℃でマニキュアや店舗組織切片を用いてガラススライドにカバースリップをシール。

4.蛍光観察画像の取得

注：画像取得ソフトウェアによって制御されるカメラを備えた蛍光顕微鏡をIHCの結果を観察する必要があります。

  1. 画像を取得する前に、ラベル付けの強度を確認し、陰性対照を見て、実験の背景を評価します。個別蛍光標識（カラーチャンネル）の写真を取得します。
  2. 各カラーチャンネルの同じ条件（露出と一般設定）で対応するコントロールのものを含む、すべての画像を取得します。
  3. 従来の顕微鏡
    1. 63（油浸、NA 1.3）目標とDP50撮像カメラを×20が×、標準フルオレセインイソチオシアネートのためのフィルター（FITC、緑）、ローダミン（赤）およびDAPI（青）の排出量を備えた顕微鏡と落射蛍光顕微鏡を実行します。
  4. 共焦点顕微鏡検査
  5. MICROSと共焦点顕微鏡を実行します63（油浸、NA 1.4）×する×20を使用して、ZENソフトウェアを装備した目標とレーザーの488と568 nmの励起波長を対応。

5.画像処理

注：すべての画像の後処理は、ImageJのフリーソフトウェア（http://imagej.nih.gov/ij/）を使用して実行されます。

  1. 画像をスーパーインポーズ（マージ）
    1. （ファイル/開く）結合される各チャネルで取得された画像を開きます。 8ビットグレースケール画像を扱う場合は、ルックアップテーブル（画像/ルックアップテーブル）を使用して、各チャンネルに人工の色を属性。
    2. （画像/カラー/チャンネルをマージ）」チャンネルを統合」コマンドを使用して、グレースケールまたはカラー画像から合成画像を生成し、各チャンネルに色を帰。
    3. （ファイル/開く）を結合される各チャネルで取得されたスタックを開いて、＆チャンネルを統合」コマンドを使用して、イメージが同じように重畳スタックの実行＃8221;各チャンネルに色を帰する（画像/カラー/チャンネルをマージ）。イメージシーケンスとして、あるいは映画（セクション5.4を参照）のような複合スタックを保存します。
  2. 画像スタックZ突起
    1. 画像平面（z軸）に垂直な軸に沿ってそれらを投影することによって画像スタックのすべての画像の2次元図を提供するために、Z投影機能（画像/スタック/ Zproject、最大強度）を使用します。 「最大強度」オプションは、各ピクセルは、スタック内のすべての画像の上に最大値が含まれていた画像を作成します。これは、特定のチャネルまたは複数のチャネルの重ね合わせ後に全体画像スタックを通して観察すべての染色の可視化を可能にする、単一の画像を生成します。
  3. 画像スタックの3D投影
    1. 平面上の回転量の突起のシーケンスを生成するために3D投影コマンド（画像/スタック/ 3Dプロジェクト、明るい点、y軸）を使用します。 SUの視覚的レンダリングrfacesと内部構造は、両方の投影法（最も近い点、ここで使用される最も明るい点（）、または平均値）に依存し、可視化パラメータは、選択されまし​​た。アニメーションシーケンスの各フレームは、異なる視角から突出した結果です。
    2. 直交3軸（y軸は、ここで選択された）のそれぞれの周囲に作成した3D画像を回転させます。単一の画像やムービーのように製造シーケンスを保存します。
  4. 映画への変換画像スタック
    1. 画像スタック（ファイル/開く）を開き、「AVI」（ファイル/名前を付けて保存/ AVI）コマンドを使用して、.AVI形式の動画として保存します。

結果

乳腺は胸部やげっ歯類における腹部の両方の腹側構造に沿って配置された皮下腺です。妊娠中のマウスの腺の5組の位置は、図4に示されている。乳腺の形態が劇的に完全授乳（ 図1B）の準備をするために必要な機能の変更を反映し、その開発中に変化します。バージンまたは未経産の動物では、乳腺が見えにくいかもしれ薄い脂肪間質内に埋め込まれた疎分...

ディスカッション

IHCは、特定のエピトープ - 抗体相互作用に主に依存する組織切片中の抗原をローカライズすることは比較的単純明快な実験方法です。プロトコルの多数IIFによってタンパク質を局在化するために使用されているが、これらの手順のコアは、ほとんど同じです。しかし、強く結果に影響を与えることができるため、各個人のIHC研究のために最適化されなければならないいくつかの重要な側面が...

開示事項

著者は、彼らが競合する金融利害関係を有していないことを宣言します。

謝辞

著者は、INRA MIMA2イメージングコア施設（INRA、UMR1198、ジュイ・アン・ジョザス）へと動物のケアと施設のIERPユニット（UE 0907、INRA、ジュイ・アン・ジョザス）のスタッフに感謝しています。我々はまた、非常に便利なantibodieをご提供するためのIHメイザー、MCネヴィルとS. Toozeに感謝したいと思います。

資料

NameCompanyCatalog NumberComments
DissectionCompanyCatalog NumberComments/Description
Pins
Ethanol
Scissors
Scalpel and adapted blades
Ice
Towel paper
Tissue sample preparationCompanyCatalog NumberComments/Description
Phosphate Buffered Saline (pH7.4)SigmaP-3813
Paraformaldehyde (PFA, 32% EM grade, 100 ml)Electron Microscopy Sciences15714-Spersonnal protection equipment required WARNING: this product will expose you to Formaldehyde Gas, a chemical known to cause cancer
OCT compound/Tissue TekSakura4583
Sucrose (D-saccharose)VWR27480.294
Plastic moldsDominique Dutscher39910
Liquid nitrogen
Cryostat/sample supportLeica CM3050S
Razor blades (SEC35)Thermo Scientific152200
Slide box
Glass slides Superfrost/Superfrost Ultra PlusThermo Scientific10143560W90/1014356190
Brushes
IHCCompanyCatalog NumberComments/Description
Super Pap PenSigmaZ377821-1EA
Permanent marker (black)
50 mM NH4Cl in PBSSigmaA-0171
0.1 M glycine in PBSVWR24403.367
Antigen Retrieval solution: Tris 100 mM 5% urea pH9.6
Heater (up to 100°C)
Bovine Serum Albumin (BSA)SigmaA7906-100G
Vectashield (anti-fading mounting medium) without DAPI/with DAPIVector LaboratoriesH-1000/H-1200
Glass coverslips 22x50mm (microscopy grade)VWRCORN2980-225
Nail polish
Primary antibodiesCompanyCatalog NumberComments/Description
Rabbit anti-mouse caseins (#7781; 1:50 dilution)generously gifted by M.C. Neville (University of Colorado Health Sciences
Center, USA)
Mouse anti-cytokeratin 8 (CK8, clone 1E8, 1:50 dilution)Biolegend (Covance)MMS-162P
Mouse anti-cytokeratin 14 (CK14, cloneLL002, 1:50 dilution)Thermo ScientificMS-115-P0/P1
Rabbit anti-butyrophilin (1:300 dilution)generously gifted by I.H. Mather (Department of Animal and Avian Sciences University of Maryland College Park, USA)
Rabbit anti-Stx6 (1:50 dilution)generously gifted S. Tooze
(Cancer Research UK, London Research Institute, London, UK)
Rabbit anti-VAMP4 (1:50 dilution)Abcamab3348
Secondary antibodiesCompanyCatalog NumberComments/Description
Rhodamine-conjugated goat anti-rabbit IgG (H + L) (1:300 dilution)Jackson ImmunoResearch Laboratories111-025-003
CounterstainsCompanyCatalog NumberComments/Description
Bodipy 493/503Life Technologies (Molecular Probes)D-3922
DAPI (4-6-diamidino-2-phenylindole)Life Technologies (Molecular Probes)D-1306
Observation/Image captureCompanyCatalog NumberComments/Description
conventional fluorescence microscopeLeica Leitz DMRB
microscope		Standard filters for FITC, Rhodamine
and DAPI emissions,                     ×63 oil-immersion objective (NA 1.3), DP50 imaging camera (Olympus), CellˆF software (Olympus)
Laser Scanning Microscope (confocal microscopy)Zeiss LSM
510 microscope		Plan-Apochromat ×63 oil-immersion objective (NA 1.4),                  CLSM 510 software,               Confocal facilities, MIMA2 Platform, INRA Jouy-en-Josas, France, http://mima2.jouy.inra.fr/mima2)
Image treatmentCompanyCatalog NumberComments/Description
ImageJ 1.49k softwareFree software

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