마우스 유선의 냉동 섹션에 간접 면역 형광

요약

이 문서에서 설명하는 간접 면역 형광 프로토콜 탐지 및 마우스 유방 동맥에서 단백질의 현지화 할 수 있습니다. 완전한 방법은 유선 샘플을 제조 형광 현미경에 의해 이미지, 조직 절편을 면역 조직 화학 법을 수행하고, 이미지를 재구성하기 위해 주어진다.

초록

간접 면역 형광을 감지하고 조직에 대한 관심의 단백질을 찾는 데 사용됩니다. 여기에 제시된 프로토콜은 단백질의 면역 검출을위한 완전하고 간단한 방법은, 유선 수유 마우스를 예로 들어 설명되고. 특히 마우스 유방 분비선 조직 정착 냉동 조직 절편의 해부에 관한 조직 샘플의 준비를위한 프로토콜은, 상세한이다. 표준 프로토콜은 선택적 항원 검색 단계를 포함하는, 간접 면역 형광을 수행하도록 또한 제공된다. 표지 된 조직 절편의 관찰뿐만 아니라, 영상 획득 및 후 처리도 언급된다. 이 절차는 세포 단백질의 위치 파악에 동물 조직의 수집으로부터의 전체 개요를 제공한다. 이러한 일반적인 방법은 다른 조직 샘플에 적용 할 수 있지만, 각 조직은 연구 / 차 항체에 결합되도록 구성되어야한다.

서문

유선은 누구의 주요 기능 신생아를 공급하는 우유를 생산하는 전형적인 포유류의 외분비 기관이다. 유방 조직의 발달은 주로 출생 후 발생하고 상피 세포 주위 기질이 침입하는 독특한 방법을 특징으로한다. 이 조직은 부수적으로 생식 상태의 변화 (그림 1)과, 특히 성인 생활 동안 많은 변화 (성장, 분화 및 회귀)를 겪는다. 조직의 전체적인 형태에 더하여, 다른 유형의 세포뿐만 아니라 유선 내에서의 배치의 비율은 급격히 발달 동안 변경 ^1-5.

배아 생활 동안, 유방 상피 세포는 배아 일 10.5 (E10.5) (그림 1A 주위의 중간 선 양쪽의 앞과 뒷다리 사이, 외배엽의 약간의 농축 및 층화에 의해 정의된다 유방 우유 라인에서 파생 ).E11.5에서 우유 선 대칭 위치에서 재생 가능한 우유 유선 라인을 따라 위치되는 개별 placodes으로 끊기는 및 주변 간엽은 응축하기 시작한다. placodes는 진피로 깊이 가라 앉기 시작하고 유방 중간 엽은 유방 버드 (E12.5-E14.5) 주위에 동심 층으로 구성합니다. E15.5로, 유방 상피 세포는 증식과 지방 패드쪽으로 유방 중간 엽을 통해 밀어 주 새싹을 형성하기 위해 연장을 시작합니다. 기본 새싹 젖꼭지 시스의 형성에 의해 표시된 피부 개구와 중공 도관을 개발한다. E18.5에서 신장 덕트는 지방 패드로 성장하고 지방 패드에 포함 작은 arborized 유관 시스템으로 분기하고있다. 개발은 본질적으로 체포하고 기본적인 유선은 사춘기까지 morphogenetically 정지 남아있다. 남성 배아에서 안드로겐 수용체의 활성화가 사라 싹의 변성에 이르게E15.5에 의해. E18로, 유방 발달은 사춘기 ^6-9까지 중단.

출생시, 유선이의 신장 및 분기 천천히 (아이소 메트릭 성장) 기초 도관 시스템을 항구. 사춘기에, 덕트의 선단에 위치하는 구조는 구형 말단부 싹 (TEBS)가, 캡 세포의 외부 층과 셀의 다층 내부 코어 (체세포)로 형성했다. 이러한 구조는 매우 증식하고 호르몬 큐에 응답하여 주변 간질 조직에 침투. 유관 신장에 TEBS 결과 내 확산은, 형태 형성 분기와 결합. 이 프로세스는 유두 (그림 1B, 사춘기)에서 나오는 기본 상피 arborized 네트워크의 설립으로 이어집니다. ~ 10~12주 출산 후, 상피 전체 지방 패드를 침공했을 때, 그것의 확장이 중지에서 TEBS이 사라집니다. 유관 개발은 역동적 인 변화, 즉, successi을 겪는다발정주기 ⁽¹⁰⁾ (그림 1B, 성인)에 따라 상피 세포의 증식과 회귀 분석을했습니다.

임신의 시작에서, 유방 조직은 수유를 준비하는 중요한 성장과 형태 학적 변화를 겪는다. 유방 상피 광범위하게 높은 분기 세뇨관 폐포 네트워크로 이어지는, 증식 및 분화. 부수적으로, 유방 상피 세포 (MEC의)는 편광 및 합성 및 우유 제품을 분비 할 수됩니다. MEC의 수축은 근 상피 세포에 의해 둘러싸여 있으며, 지방 및 결합 조직, 혈관 및 신경 말단 (도 1b, 임신)로 이루어지는 기질에 결합되어 다수의 폐포 구조 (꽈리)로 구성. 또한, MEC의의 기부 쪽은 기저막 (세포 외 기질)에 밀착되어, 이들 두 엔티티 사이의 상호 작용은 밀접하게 유방의 양 및 형태 형성 분비 기능을 조절공예 상피 ^11-13.

이러한 모든 과정은 가장 중요한 hormones14있는 다양한 환​​경 단서, 주변 분비 인자 및 세포 외 기질의 작용에 의존한다. 예를 들어, 프로게스테론은 광범위한 측면 분지 프로락틴 (PRL)와 조합하여, ⁽¹⁵⁾ 및 그 alveologenesis ^{16,17 유도를} 촉진하고, 폐포의 분화를 유지한다. 스테로이드와 PRL18, 사이토 카인 및 개발과 관련된 신호 전달 경로에 추가하여 (이 Wnt 및 신호 전달 경로 노치)도 유방 계보 헌신과 개발 ^19-21에 참여하고 있습니다. 임신의 끝에서, MEC의 내강은 폐포의 내강에 초유로 알려진 단백질이 풍부한 우유를 생산하기 시작한다. 또한, 프로게스테론은 상피 투과성에 작용하고 단단한 접합부가 열려 있기 때문에, 초유는 모체 혈류에서 발견된다.

분만 후 mammarY 상피 (그림 2, 유방 상피) 거의 모든 유선 볼륨의 소요 높은 구성되어있다. 우유 - 생산 단위, 즉 폐포 (도 2, 폐포)는, 그 꼭대기 세포막은 루멘을 구분하여, 편광 유방 상피 세포 분비 (MESCs)의 단일 층에 의해 형성된다. 폐포는 외부 환경 (그림 2, 엽)에 우유를 배출 덕트에 연결 로브로 분류됩니다 소엽으로 자신을 준비. 수유가 발생 즉., MESCs 주로 태반 호르몬의 드롭 (주로 프로게스테론) (그림 1B, 수유)에 의해 트리거 우유의 풍부한 양을 분비하기 시작한다. 우유 단백질 유전자는 주로 유아시 방출 뇌하수체 PRL에 응답하여, 임신에서 수유 ^9,22,23 범위 정의 시간적 시간의 코스에 활성화된다. 부수적으로, MESCs 두 세포 외 기질 사이의 접촉은 우유 단백질 SYNT을 자극세포 인테그린 및 라미닌 ^{(24, 25)} 사이의 상호 작용을 통해 중재 및 MESCs ^{(26, 27)에서} 세포 사멸을 억제되어 신호를 통해 ​​hesis. 이러한 신호 전달 경로는 특정의 전사 활성화 ^{인자 (29)를} 통해 우유 단백질 유전자 프로모터 ^(28)의 활성화를 초래한다. 세포 - 세포 접촉도 혀끝 극성의 확립 및 유제품의 vectorial 분비 포함 분화의 일부의 측면에 중요하다. 수유 MESCs의 시작 후 급속히 확대 견고 연접 미세 신생아의 영양 요구에 응답하여, 혈액뿐만 아니라 우유 성분의 합성, 수송 및 분비에서 분자의 흡수를 조율. 유아의 때에, 폐포를 둘러싸 근 상피 세포의 수축 옥시토신 응답으로 발생과 덕트를 통해 니플에 우유 토출 리드. 우유는 단백질을 포함하는 복잡한 유체 (대부분입니다카제인), 당 (주로 락토스), 예컨대 면역 글로불린 A (적 IgA), 성장 인자 및 호르몬과 같은 지질, 광물뿐만 아니라 생리 활성 분자. 카제인, 즉 분비 경로를 따라 이송 미셀을, 카제인, 초분자 구조에서 조립, 합성 한 다음 세포 외 유출에 의해 발표되는 즉, MESC의 혀끝의 세포막과 카제인 함유 분비 소포의 융합 (SV들) (그림 2).

세포 내 트래픽은 막상 구획 사이의 물질 교환에 의존하고 포함 가용성 N-에틸 말레이에 맞는 퓨전 (NSF) 부착 단백질 (SNAP) 수용체 (SNARE) ^{30, 31.} 스네어 단백질 제품군은 대상 막에 지역화 된 소포 소포 막에 존재하는 함정 (V-덫), 및 목표 덫 (T-덫)에 세분화되어있다. 들은 꼬인 코일 도메인을 통해 완봉으로 V- 및 t-스네어가 매우 안정적인 네 나선 다발 복합체를 형성하도록 조립 함 번째로서전자 SNARE 복합체. 이 단지는 점차 근접 ^{(30, 32)로} 그 (것)들을 가져 와서 두 상대 지질 이중층의 융합을 촉진한다. 그 후, SNARE 복합체는 NSF 아데노신 triphosphatase에 의해 분해되고, 그 어댑터 단백질 SNAP과 SNARE 단백질은 기원 ^33의 자신의 구획에 다시 재활용됩니다. 흥미롭게도, 각 SNARE 단백질은 주로 세포 융합 이벤트 ^(34)의 특이성에 기여할 수있다 별개의 세포 구획과 SNARE 페어링에 있습니다. 이전의 연구는 적어도 단백질 23 (SNAP23) 및 소포 - 관련 막 단백질 8 (VAMP8), 및 syntaxins (STX)를 Synaptosomal이 관련 제안 -7과 -12 카제인 세포 외 유출 ^{(35, 36)의} 역할을한다. 이 단백질은 또한 우유의 지질 부분, 즉, 우유 지방 소 구체 (MFGs) ^(37)와 관련하여 발견되었다. 현재 통용 모델은 세포질의 지질 소적 (CLDs)가 중립 (L)의 퇴적에 의해 형성되는 것으로 가정한다ipids (주로 트리 아실 글리세롤과 스테롤 에스테르) 및 소포체 (ER) 막 ^38-41의 두 전단지 사이의 산모 식단에서 파생 된 콜레스테롤. 큰 CLDs는 MESC 혀끝 세포막에 의해 감싸여되고, 신진 의해 그들이 MFGs로 방출된다 MESCs의 선단 측 (직경 1-10 μm의)으로 이송되면서 작은 CLDs의 융합에 의해 적어도 부분적으로 형성되어있다 ^40-42. 새끼는 이유와 MESCs이 점진적으로 다시 사춘기 상태 (그림 1B, 퇴화)에 유방 조직의 회귀로 이어지는, 세포 사멸에 의해 사망 후 수유는 중단.

면역은 (IF)에서 연구 및 임상 진단 모두 생물학의 거의 모든 측면에 사용 된 일반적인 실험 분석 방법이다. 기술이 조직 섹션에서 수행 할 수있는 경우 (면역 조직 화학, IHC) 또는 세포 (면역 세포 화학, ICC) 샘플. 이 강력한 접근 방식은 직관 형 형광등의 사용에 의존구체적 따라서 형광 현미경을 통해 그 조직 분포의 시각화를 허용 관심 항원에 (직접 또는 간접적으로) 결합하는 표지 된 항체. 형광 신호는 대부분 시료의 품질과 농도의 항체 및 적절한 처리에 의존한다. 간단한 간접 면역 형광 (IIF) 프로토콜 우유 제품 (카제인과 MFGs)와 우유 제품 분비에 관여하는 단백질을 검출하기 위해 제공됩니다 마우스 유선 조직 (그림 3)의 동결 절편에 (butyrophilin (인 btn1), 단백질 스네어). 이 프로토콜은 조직 컬렉션에서 이미지 후 처리, 중요하고 선택적 단계뿐만 아니라 몇 가지 기술적 인 권고에 이르기까지 완벽한 IHC 개요를 제공하지만 또한 제시되고 논의된다.

프로토콜

CD1 마우스는 INRA (UE0907 IERP, JOUY-KO-Josas의, 프랑스)에서 사육 하였다. 동물 보호의 모든 윤리적 측면은 농업의 프랑스 교육부에 의해 규정 된 관련 지침 및 라이센스 요구 사항을 준수. 사용 절차는 (Comethea JOUY-KO-Josas의 / AgroParisTech에서 계약 12/097) 지역 윤리위원회에 의해 승인되었다.

1. 유선 샘플 준비

1. 마우스 유선의 해부
   1. 자궁 전위에 의해 수유의 날 (10)에 쥐를 안락사와 복부가 위를 향하도록 내려 동물을 핀.
   2. 에탄올로 복부 영역을 습식 및 종이 수건으로 건조.
   3. 집게를 사용하여 두 개의 뒷다리 사이의 복부 피부를 끌어와 날카로운 가위로 약 1cm의 (만 피부를 통해) 절개를합니다. 이 첫 번째 절개에서 시작, 다음, 마우스의 목 피부를 잘라 가위를 사용합니다. 복막 및 PI에서 피부를 당깁니다N시의 피부의 일측 아래,이 교시 연신.
   4. 복부와 면봉으로 피부에서 멀리 밀어 마지막으로 잡아 당기거나 멀리 복막에서이를 절단하여 사타구니 유선을 수집합니다.
      주의 :이 단계에서 카민 염색은 전체 선 ⁽⁴³⁾ 내에서 유선 상피 세포를 시각화하기 위해 수행 될 수있다. 이 접근 방식은 다양한 조건 (생리 발달 단계, 질환, 생체 치료법) 아래 유선의 글로벌 형태를 분석하는 것이 유용 할 수있다.
   5. 복부의 접합과 사타구니 동맥 ^{(44)에있는} 림프절을 제거합니다.
2. 유방 조직 고정
   1. 가능한 한 많은 우유를 제거하기 위해 (PBS) 용액의 pH 7.4, 인산 완충 식염수에있는이 조각을 씻어 바로 메스와 3mm ³ 조각으로 유방 조직을 잘라.
   2. 신속 종이 조각을 건조수건과 얼음에 10 ~ 15 분 동안 4 % 파라 포름 알데히드 (PFA, HCHO, 32 % 포름 알데히드 용액,주의)를 포함하는 차가운 PBS 용액에 넣어.
      참고 :이 IIF36에 의해 및 / 또는 현장 하이브리드 ⁴⁵ 유방 조직 슬라이스 이후의 분석을 허용하기에 충분한 시간이다. 알데히드 고정 제는 조직 조각을 다소 느리게 침투하지만, (~ 시간은 1-3 번 ㎜), 이번에는 조직 샘플의 최적의 정착을 위해 확장 될 수있다. 또한, 정착액 솔루션 (본 연구에서 자세히 설명하지 않음) 마취 된 동물을 관류하여 생체 내에서 조직을 고정한다.
3. 자당 주입
   1. 신속하게 차가운 PBS에서 유선 조각을 헹구고 부드러운 흔들림에서 4 ° C에서 16 시간 48 40 %의 자당 (D-사카, C12H22O11, 미스터 342.3 g / 몰)을 포함하는 차가운 PBS 용액을 담그지.
4. 조직 삽입
   주 :이 단계에서, 내유 단편 작은 단편 (2-3 내지 ^{3 mm를} 만들기 위해 재 절단 할 수있다) 또는 모양을 조정합니다.
   1. 적절 플라스틱 몰드 라벨 ​​및 RT 유지의 OCT 화합물과 몰드의 부피의 제 채운다. 금형 당 유방 조직의 한 조각 (2-3mm ^3)을 놓고 10월 화합물로 커버.
   2. (알루미늄 또는 금속 자체를 사용하는 시트)에 액체 질소의 표면에 금형을 넣고 제품을 고정 할 수있다.
      참고 : 액체 질소에 금형을 담근 전에 고체와 화이트가되어야합니다.
5. 조직 섹션이 수행 될 때까지 -80 ℃에서 냉동 샘플을 저장합니다.

2. 냉동 조직의 단면

참고 : 기본적으로 냉장고 내부 마이크로톰 인 저온 유지 장치를, 냉동 조직 절편을 만들기 위해 필요합니다. 낮은 온도는 종종 처녀 유선으로 지방이나 지질이 풍부한 조직이 필요합니다.

1. C ° -26에 저온 유지 장치의 온도를 조정하고 stabi을 때까지 기다리십시오하게 안정적. 전체 단면 절차 전반에 걸쳐 -26 ℃에서 냉동 조직 블록을 유지한다. 절대적 과정 중 언제든지 조직을 해동 피한다.
2. 적어도 10 분 동안 저온 유지 장치에 배치하여 -26 ° C에 면도날, 절삭 지원 티롤 장치 및 브러시 쿨. 또한 단면이 만들어 짐에 따라 유리 슬라이드를 저장할 수 있도록하기 위해 내부 저온 유지 슬라이드 박스를 배치했다.
3. 적절하게 RT에서 그들을 조직 절편을 수집하고 유지하기 위해 사용되는 유리 슬라이드 라벨; 그렇지 않으면 조직 절편들을 준수하지 않습니다. 저온 유지 장치 내부의 금형에서 샘플을 제거합니다.
   주 : 사용 양전하 유리 슬라이드 크게 인해 높은 정전 인력을 냉동 조직 절편의 밀착성을 선호 할 것이다.
4. (RT 유지)의 OCT 화합물과 금속 조직 디스크의 표면을 커버하고 그 위에 고정 된 샘플을 누른다. 습식 저온 유지 장치 내부에 탑재 배치하고 공동 보자적어도 15 분 동안 OL.
5. 저온 유지 장치의 디스크 홀더에 젖은 마운트를 놓습니다. 가능하면, 새로운 날카로운 칼날을 사용하거나 적어도 각 샘플 이후 일부 조직 것이다 빨리 무딘 잘라하는 데 사용되는 블레이드의 영역을 변경, 5-6 μm의 절단 두께를 조정합니다.
6. 슬라이스가 균일하고 정확하게 형성되도록 부착 매체의 절개함으로써 면도날 위에 티롤 장치의 위치를​​ 조정한다. 이상적으로, 안티 - 롤 장치는 약 1 mm 정도 면도날을 통해 단계 것입니다.
7. 설정이 올바른지되면, 연속 균일 한 동작으로 휠을 돌려 조직 섹션을 수행합니다. 온도가 적합하지 않는 한, 조직 섹션, 자연, 꼬고을 시도합니다.
   1. 잡아 유리 슬라이드에 원하는대로 배치하기 위해 상기 스테이지에 걸쳐 부를 기동하도록 브러쉬를 사용한다. 냉동 조직 블록 및 / 또는 면도날에 가능성이 존재하는 유물을 정리 브러시를 사용합니다.
8. 손잡이사용자쪽으로 조직 섹션은 저온 유지 장치의 스테이지로 눌러지지 않도록. 이 단계에 조직 절편 따라서 유리 슬라이드로 복구 할 수 없다는의 접착을 초래할 수 있으므로 저온 유지 장치의 스테이지로 조직 섹션을 눌러 마십시오.
9. 섹션 위를 유지하고 조직 섹션을 터치 내려 낚시를하여 유리 슬라이드의 표면에서 그들을 선택하여 조직 섹션을 하나씩 검색합니다.
   참고 : 조직 섹션 빠르게 인해 정적 인 매력에 따뜻한 유리 준수합니다. 여러 조직 섹션은 동일한 슬라이드에 배치하는 경우,이를 겹쳐과 공간에 충분한 개별적으로 소수성 원을 묶어야 할 수 있도록하지 않도록주의 (섹션 3.1.1을 참조하십시오.).

3. 간접 면역 형광

1. 섹션을 찾기
   1. 슬라이드에 장착 된 조직 주변의 소수성 원을 그릴 소수성 장벽 펜을 사용합니다. 실온에서 약 1 분 동안 원 건조하자. T 주위에 선을 그립니다이슈 미세 검정 영구 마커 부뿐만 있지만에 조직 절편은 하나 대향 유리 슬라이드의 측면.
      참고 :이 원은 발수이며, 아세톤, 알코올 불용성. 따라서 IHC 절차 중에 사용 된 수용액에 장벽을 제공하고 필요한 시약의 양을 감소시킨다.
   2. RT에서 몇 분 동안 ~ 한 방울 PBS 250 μl를 감싸는 조직 절편을 재수. ~으로 10 ~ 15 분 동안 PBS에서 새로 제조 3 % PFA 용액 250 μl를 감싸는 조직 섹션을 수정합니다.
      주 : 선택적으로,이 경우에는, 알데히드 켄칭 용액을 사용하여 (50 MM의 염화 암모늄 (NH ₄ CL 씨 PBS에서 53.5 g / ㏖) 또는 0.1M 글리신 (C ₂ H ₅ NO _2, 씨 75.07 g / mol)의 PBS에 ) 고정 반응을 중지합니다. 간단하고 풍부한 PBS 세척 미 반응 알데히드를 제거하기 위해 일반적으로 충분하다.
2. 항원 검색 (선택 사항)
   주 : 대부분의 항원은 항원 검색 (AR)없이 검출 할 수 있지만,이 단계를 수행하면, 나머지는 단지 관찰 할 것이다. 어떤 경우에는, AR은 또한 관찰 된 신호의 개선을 허용한다.
   1. 비커에 AR 용액 (100 mM 트리스 (C ₄ H ₁₁ NO _3, 미스터 121.14) 5 % 우레아 (NH ₂ CONH _2, 미스터 60.06)의 pH 9.6)를 놓습니다. AR 용액의 체적은 완전히 유리 홀더에 배치 된 유리 슬라이드를 커버하기에 충분해야한다.
   2. 온도계의 온도를 모니터링하여 95 ° C까지 AR 솔루션을 예열 한 후 적합한 랙에 유리 슬라이드를 놓고 뜨거운 버퍼에 랙을 immerge, 덮개는 증발을 제한하고 95 ℃에서 10 분 동안 배양한다.
   3. 수욕에서 비커를 꺼내고 다른 버퍼 10 분간 유리 슬라이드를 떠난다.
3. 면역
   1. PBS (~ 250 μL / 섹션)로 조직 절편을 씻어 솔루션을 포화3 % 소 혈청 알부민 (BSA, ~ 250 μL / 제) 실온에서 적어도 30 분 동안 PBS에서의.
   2. PBS는 각 조직 섹션에 2 % BSA를 포함하는 희석 차 항체의 30 ~ 50 μl를 넣습니다.
      주 :이 부피가 완전히 조직 절편을 커버 방울을 형성하기에 충분하다.
   3. 일차 항체가없는 음성 대조군을 수행하도록 조직 절편에 혼자 희석제 (PBS, 2 %의 BSA)의 동일한 양을 놓는다.
      1. 체계적 IHC 각 실험에서, 음성 대조군이 포함하고 (인해 이차 항체 및 / 또는 조직에 자동 형광 비특이적 라벨링) 실험의 배경을 추정하기 위해 사용되는 각각의 이차 항체에 대해 수행한다. 양 또는 음의 제어의 다른 유형도 (설명 참조) 표지의 특이성을 확인하기 위해 수행 될 수있다.
   4. 4 ° C에서 / 가습 박스 O에서 N을 유리 슬라이드를 놓습니다.
      참고 : 사용하는 차 항체가 마우스 단일 클론 항 cytokeratin했다8 (CK8 1:50 희석), 마우스 단일 클론 (14) (CK14 1:50 희석) 항 cytokeratin, 토끼 다 클론 항 - 마우스 카제인 (# 7781 1:50 희석, 관대 MC 네빌, 콜로라도 보건 대학 제공 과학 센터, CO, 미국), 토끼 다 클론 항 인 btn1 (1 : 관대 IH 메이, 동물 및 조류 과학과, 메릴랜드 대학, 컬리지 파크, 메릴랜드, 미국), 토끼 다 클론 항 Stx6 (가 제공하는 300 희석, 넉넉한 S. Tooze, 암 연구 영국, 런던 연구소, 런던, 영국)와 토끼 다 클론 항 VAMP4 (1시 50분 희석)에 의해 제공 1시 50분 희석.
   5. 철저하게 RT에서 10 분 동안 PBS로 4 회 이상을 조직 절편을 씻는다.
   6. , PBS가 2 % BSA를 포함하는 모든 조직 섹션에이 솔루션의 30 ~ 50 μl를 배치하고 1.5 시간 동안 품어 : 적절한 이차 항체 (300 희석 로다 민 결합 염소 항 - 토끼 IgG를 (H + 1), 1) 희석 실온에서.
      1. 형광 색소는 빛에 민감한 분자이기 때문에,하지그들의 분석 할 때까지 빛을 조직 섹션에 노출됩니다. 세포막 낮은 라벨을 방해 할 수 녹색 형광을 자동 생성하는 경향이 있기 때문에 조직 섹션에 IIF 들어, 적색 형광체에 결합 이차 항체를 선호. 또한, 적색 형광 결합 된 이차 항체를 선택하면 중성 지질 (아래 참조)의 병용 표시 할 수 있습니다.
   7. 철저하게 RT에서 10 분 동안 PBS로 4 회 이상을 조직 절편을 씻는다.
4. 후 고정 (선택 사항)
   1. 일부 실험에서, 항원 / 항체 골격을 안정화하기 위해 RT에서 10 분 동안 PBS에서 희석 한 2 % PFA와 샘플을 배양함으로써 사후 고정을 수행한다. 그러나,이 단계는 대부분의 경우에 생략 될 수있다.
5. 중성 지질과 DNA를 대조 염색
   1. BODIPY 3 μg의 493 / ㎖를 함유하는 PBS 용액에 30-50 ㎕의 조직 섹션을 인큐베이션하여 CLDs 및 MFGs 컬러 중성 지질을 시각화실온에서 10 분 / 503. 신속 PBS로 두 번 조직 섹션을 씻어.
   2. RT에서 10 분 동안 DAPI (4-6-diamidino -2- 페닐 인돌, 5 ㎎ / ㎖ 원액)의 3 μM을 함유하는 PBS 용액 30-50 μL 핵 DNA Counterstain과. 관찰 슬라이드를 장착하기 전에 PBS로 두 번 조직 섹션을 씻으십시오.
6. 섹션 장착
   1. PBS를 제거하고 각 조직 섹션에 매체를 장착 한 방울을 배치합니다.
   2. 공기 방울을 방지, 슬라이드 대 각도로 커버 슬립의 일측을 배치 액체 방울의 외부 에지와 접촉 한 후 서서히 저하 커버. 액체는 몇 분간 유리 슬라이드 및 커버 슬립 사이에 분산하고 종이 타월로 매체를 장착 과량을 제거 할 수있다.
   3. 관찰 될 때까지 빛에 노출을 방지하기 위해 4 ℃에서 매니큐어 및 저장 조직 섹션 유리 슬라이드에 커버 슬립을 밀봉.

4. 형광 관측 및 이미지 인식

주 : 화상 취득 소프트웨어에 의해 제어되는 카메라 IHC의 결과를 관찰 할 필요가 장착 형광 현미경.

1. 이미지를 획득하기 전에, 표지의 강도를 확인하고 음성 대조군 보면 실험의 배경을 평가. 개별적으로 각각의 형광 표지 (컬러 채널)의 사진을 획득.
2. 각 컬러 채널에 대해 동일한 조건 (노광 및 일반 설정)에 대응하는 제어 것과 포함한 모든 이미지를 획득.
3. 기존의 현미경
   1. (63) (오일 침지, NA 1.3) 목표 및 DP50 촬상 카메라 × 20를 ×, 표준 형광 염료 용 필터 (FITC, 녹색), 로다 민 (적색) 및 DAPI (청색) 배출 구비 현미경으로 표면 형광 현미경을 수행한다.
4. 공 초점 현미경
5. 마이크로와 공 초점 현미경을 수행63 (오일 침수, NA 1.4) 목표와 레이저의 488-과 568-nm의 여기 파장을하는 × × 20를 사용하여 ZEN 소프트웨어가 설치된 대처.

5. 이미지 처리

참고 : 모든 이미지 후 처리는 ImageJ에 무료 소프트웨어 (http://imagej.nih.gov/ij/)를 사용하여 수행됩니다.

1. 이미지를 중첩 (병합)
   1. (파일 / 열기) 결합 각 채널에서 획득 한 이미지를 엽니 다. 8 비트 그레이 스케일 이미지로 작업하는 경우, 룩업 테이블 (이미지 / 룩업 테이블)을 사용하여 각 채널에 인공 색 속성.
   2. 각 채널에 색상을 탓 후 (이미지 / 색상 / 채널을 병합) "채널을 병합"명령을 사용하여 그레이 스케일 또는 컬러 이미지의 합성 사진을 생성합니다.
   3. (파일 / 열기)에 결합 될 각 채널에서 획득 스택을 개방 및 채널 병합 "명령을 사용하여 이미지가 동일한 방식으로 중첩 스택 수행# 8221; 각 채널에 색상 속성에 (이미지 / 색상 / 채널을 병합). 이미지 시퀀스로 복합 스택을 저장하거나 동영상으로 (5.4 절 참조).
2. 이미지 스택 Z 프로젝션
   1. 이미지 평면 (Z 축)에 수직 인 축을 따라 그것들을 투영하여 화상 스택의 모든 이미지의 2 차원 뷰를 제공하는 Z 투사 기능 (이미지 / 스택 / Zproject, 최대 강도) 사용. "최대 강도"옵션은 각 픽셀이 스택의 모든 이미지를 통해 최대 값을 포함하는 이미지를 만듭니다. 이는 특정 채널 또는 여러 채널의 중첩 후에 화상 전체 스택을 통해 관찰 된 모든 얼룩의 시각화를 허용하는 하나의 이미지를 생성한다.
3. 화상 스택 차원 투영
   1. 평면 상으로 회전 볼륨의 돌기들의 시퀀스를 생성하기 위해 3 차원 투영 명령 (이미지 / 스택 / 3D 프로젝트, 밝은 점, Y 축)을 사용. 스와의 시각적 렌더링rfaces 및 내부 구조는 모두 투사 방법 (가장 가까운 점, 여기에 사용 된 밝은 점 (), 또는 평균 값)에 따라 달라집니다 및 시각화 매개 변수를 선택했습니다. 애니메이션 시퀀스의 각 프레임은 상이한 시야각으로부터 돌출 한 결과이다.
   2. 세 개의 직교 축 (y 축이 여기에 선정되었다)의 각각의 주위에 생성 된 3D 이미지를 회전합니다. 하나의 이미지 또는 동영상으로 제작 순서를 저장합니다.
4. 동영상 변환 이미지 스택
   1. 이미지 스택 (파일 / 열기)을 열고 명령 "AVI"(파일 / 저장 / AVI)를 사용하여 .AVI 형식의 동영상으로 저장합니다.

결과

유선은 흉부와 설치류의 복부 모두의 복부 구조를 따라 위치한 피하 선이다. 임신 기간 동안 마우스의 땀샘의 다섯 쌍의 위치는 그림 4에 표시됩니다. 유선의 형태는 크게 전체 수유 (그림 1B)를 준비하는 데 필요한 기능 변경을 반영, 개발 중에 변경됩니다. 처녀 또는 미산 동물, 유선 볼 어려울 수 있습니다 얇은 지방 기질에 포함 띄엄 띄엄 분기 유관 상피 세포?...

토론

IHC는 주로 특정 항원 - 항체의 상호 작용에 따라 조직 섹션에서 항원을 지역화 할 수있는 비교적 단순하고 간단 실험 방법이다. 프로토콜의 다수 IIF 의해 단백질 국산화 사용되지만,이 절차의 핵심은 거의 항상 동일하다. 그러나 강하게 결과에 영향을 미칠 수 있으므로 각 개별 IHC 연구에 최적화해야합니다 몇 가지 중요한 측면이있다. 이 방식의 가장 도전적인 양태, 즉 가장 실험 조건을 결...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dissection	Company	Catalog Number	Comments/Description
Pins
Ethanol
Scissors
Scalpel and adapted blades
Ice
Towel paper
Tissue sample preparation	Company	Catalog Number	Comments/Description
Phosphate Buffered Saline (pH7.4)	Sigma	P-3813
Paraformaldehyde (PFA, 32% EM grade, 100 ml)	Electron Microscopy Sciences	15714-S	personnal protection equipment required WARNING: this product will expose you to Formaldehyde Gas, a chemical known to cause cancer
OCT compound/Tissue Tek	Sakura	4583
Sucrose (D-saccharose)	VWR	27480.294
Plastic molds	Dominique Dutscher	39910
Liquid nitrogen
Cryostat/sample support	Leica	CM3050S
Razor blades (SEC35)	Thermo Scientific	152200
Slide box
Glass slides Superfrost/Superfrost Ultra Plus	Thermo Scientific	10143560W90/1014356190
Brushes
IHC	Company	Catalog Number	Comments/Description
Super Pap Pen	Sigma	Z377821-1EA
Permanent marker (black)
50 mM NH4Cl in PBS	Sigma	A-0171
0.1 M glycine in PBS	VWR	24403.367
Antigen Retrieval solution: Tris 100 mM 5% urea pH9.6
Heater (up to 100°C)
Bovine Serum Albumin (BSA)	Sigma	A7906-100G
Vectashield (anti-fading mounting medium) without DAPI/with DAPI	Vector Laboratories	H-1000/H-1200
Glass coverslips 22x50mm (microscopy grade)	VWR	CORN2980-225
Nail polish
Primary antibodies	Company	Catalog Number	Comments/Description
Rabbit anti-mouse caseins (#7781; 1:50 dilution)	generously gifted by M.C. Neville (University of Colorado Health Sciences Center, USA)
Mouse anti-cytokeratin 8 (CK8, clone 1E8, 1:50 dilution)	Biolegend (Covance)	MMS-162P
Mouse anti-cytokeratin 14 (CK14, cloneLL002, 1:50 dilution)	Thermo Scientific	MS-115-P0/P1
Rabbit anti-butyrophilin (1:300 dilution)	generously gifted by I.H. Mather (Department of Animal and Avian Sciences University of Maryland College Park, USA)
Rabbit anti-Stx6 (1:50 dilution)	generously gifted S. Tooze (Cancer Research UK, London Research Institute, London, UK)
Rabbit anti-VAMP4 (1:50 dilution)	Abcam	ab3348
Secondary antibodies	Company	Catalog Number	Comments/Description
Rhodamine-conjugated goat anti-rabbit IgG (H + L) (1:300 dilution)	Jackson ImmunoResearch Laboratories	111-025-003
Counterstains	Company	Catalog Number	Comments/Description
Bodipy 493/503	Life Technologies (Molecular Probes)	D-3922
DAPI (4-6-diamidino-2-phenylindole)	Life Technologies (Molecular Probes)	D-1306
Observation/Image capture	Company	Catalog Number	Comments/Description
conventional fluorescence microscope	Leica Leitz DMRB microscope		Standard filters for FITC, Rhodamine and DAPI emissions,                     ×63 oil-immersion objective (NA 1.3), DP50 imaging camera (Olympus), CellˆF software (Olympus)
Laser Scanning Microscope (confocal microscopy)	Zeiss LSM 510 microscope		Plan-Apochromat ×63 oil-immersion objective (NA 1.4),                  CLSM 510 software,               Confocal facilities, MIMA2 Platform, INRA Jouy-en-Josas, France, http://mima2.jouy.inra.fr/mima2)
Image treatment	Company	Catalog Number	Comments/Description
ImageJ 1.49k software			Free software