Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

פרוטוקול immunofluorescence העקיף המתואר במאמר זה מאפשר זיהוי והלוקליזציה של חלבונים בבלוטת החלב עכבר. שיטה שלמה ניתן להכין דגימות בלוטת החלב, לבצע אימונוהיסטוכימיה, לתמונת סעיפי רקמות על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי, ולשחזר תמונות.

Abstract

immunofluorescence העקיף משמש כדי לזהות ולאתר חלבוני עניין ברקמה. הפרוטוקול המובא כאן מתאר שיטה שלמה ופשוטה לגילוי חיסוני של חלבונים, העכבר המניקים בלוטת החלב שנלקח כדוגמא. פרוטוקול להכנת דגימות הרקמה, במיוחד בנוגע לנתיחה של בלוטת החלב עכבר, קיבעון רקמות וחתך רקמה קפוא, מפורט. פרוטוקול סטנדרטי לבצע immunofluorescence העקיף, כולל שלב אחזור אנטיגן אופציונאלי, מוצג גם. ההתבוננות בסעיפי הרקמות שכותרתו כמו גם רכישת תמונה ופוסט-טיפולים גם מוצגים. הליך זה נותן סקירה מלאה, מהאוסף של רקמת חיה ללוקליזציה הסלולרית של חלבון. למרות ששיטה כללית זה יכול להיות מיושמת על דגימות רקמה אחרות, זה צריך להיות מותאם לכל זוג נוגדן רקמה / העיקרית למד.

Introduction

בלוטת החלב היא איבר אקסוקרינית יונקים טיפוסי שעיקר תפקידו הוא לייצר חלב כדי להאכיל תינוקות. הפיתוח של רקמת השד מתרחש בעיקר לאחר לידה ומאופיינת בתהליך ייחודי שבו האפיתל פולש סטרומה שמסביב. רקמה זו עוברת שינויים רבים (צמיחה, בידול ורגרסיה), במיוחד במהלך החיים הבוגרים, במקביל עם וריאציות במצב פוריות (איור 1). בנוסף למורפולוגיה הכוללת של הרקמה, פרופורציות סוגי תאים שונים, כמו גם ההסדר שלהם בתוך בלוטת החלב של לשנות באופן דרמטי במהלך פיתוח 1-5.

במהלך חיים עובריים, אפיתל החלב נובע מהקווים חלב החלב, אשר מוגדרים על ידי עיבוי וריבוד קל של האאקטודרם, בין הגפיים הקדמי ואחוריים בכל צד של קו האמצע סביב יום עוברי 10.5 (E10.5) (איור 1 א ).על E11.5, קו חלב שובר לתוך placodes הבודד, אשר ממוקמים באופן סימטרי לאורך קו חלב החלב במקומות לשחזור, וmesenchyme מסביב מתחיל להתעבות. Placodes מתחיל לשקוע עמוק יותר לתוך הדרמיס וmesenchyme החלב מארגן בשכבות קונצנטריות סביב ניצן החלב (E12.5-E14.5). נכון לE15.5, האפיתל החלב, מתחיל להתרבות ולהאריך כדי ליצור את הנבט הראשוני שדוחף דרך mesenchyme החלב לכרית השומן. הנבט הראשוני מתפתח לומן חלול עם פתיחה לעור, מסומנת על ידי ההיווצרות של נדן הפטמה. על E18.5, צינור ההארכה גדל לתוך כרית השומן ומסועף למערכת ductal arborized קטנה הקיפה בכרית השומן. פיתוח הוא למעשה נעצר ובלוטת החלב הבסיסית נשארה morphogenetically שקטה עד גיל ההתבגרות. בעובר ממין זכר, ההפעלה של קולטני אנדרוגן מובילה לניוון של הניצנים, שייעלמועל ידי E15.5. נכון לE18, פיתוח החלב מפסיק עד גיל ההתבגרות 6-9.

בלידה, בלוטת החלב מטפחת מערכת ductal בסיסית שמתארכת וסניפים לאט (צמיחת איזומטרי). בתחילת גיל התבגרות, מבנים כדוריים הממוקמים בקצוות של הצינורות הנקראים ניצני מסוף הסוף (TEBs), נוצרים משכבה חיצונית של תאי כובע וליבה רב שכבתית פנימית של תאים (תאי גוף). מבנים אלה הם שגשוג ביותר ולחדור לרקמות שמסביב סטרומה בתגובה לאותות הורמונליים. הפצת נשק בתוך תוצאות TEBs בהתארכות ductal, בשילוב עם הסתעפות המורפוגנזה. תהליך זה מוביל להקמתה של רשת arborized אפיתל בסיסית הנובעת מהפטמה (איור 1, גיל ההתבגרות). ב ~ 10-12 שבועות לאחר הלידה, כאשר האפיתל פלש כל כרית השומן, הרחבתה עוצרת ונעלמת TEBs. פיתוח ductal אז עובר שינויים דינמיים, כלומר, successiיש התפשטות ונסיגה של תאי האפיתל על פי מחזורי ייחום 10 (איור 1, מבוגר).

מתחילת ההריון, רקמת החלב עוברת צמיחה חשובה ושינויים מורפולוגיים להתכונן להנקה. אפיתל החלב בהרחבה להתרבות ולהבדיל, שמוביל לרשת tubulo-alveolar מסועף מאוד. במקביל, תאי אפיתל החלב (MECs) הפכו מקוטבים ומסוגלים לסנתז ולהפריש מוצרי חלב. MECs לארגן למבנים רבים מכתשיים (acini) שמוקפים בתאי myoepithelial התכווצות והתאגד בסטרומה המורכבת מרקמות חיבור ושומן, כלי דם ומסוף עצב (איור 1, הריון). יתר על כן, בצד הבסיסי של MECs נמצא בקשר הדוק עם הקרום במרתף (מטריקס), ויחסי גומלין בין שני גופים אלה בחוזקה להסדיר שתי פונקצית המורפוגנזה והפרשה של האמאאפיתל ר"י 11-13.

כל התהליכים האלה מסתמכים על הפעולה של רמזים סביבתיים שונים, שהחשוב ביותר הם hormones14, גורמים אוטוקריני ומטריקס. לדוגמא, פרוגסטרון גורם נרחב 15 וalveologenesis ש, בשילוב עם פרולקטין (PRL) הסתעפות בצד 16,17, מקדם ושומר על הבידול של alveoli. בנוסף לסטרואידים וPRL18, ציטוקינים ומסלולי איתות הקשורים בהתפתחות (Wnt וNotch מסלולי איתות) הם מעורבים גם במחויבות שושלת החלב ופיתוח 19-21. בסוף ההריון, MECs luminal מתחיל לייצר חלב עשיר בחלבון הידוע כקולוסטרום בלומן של alveoli. בנוסף, פרוגסטרון פועל על חדירות אפיתל ומאז צמתים ההדוקים עדיין פתוחים, קולוסטרום נמצא גם בזרם הדם האימהי.

לאחר המלטה, mammarאפיתל y תופס כמעט את כל החלב בלוטת הנפח ומאורגן ביותר (איור 2, אפיתל החלב). יחידות ייצור חלב, כלומר alveoli (איור 2, נֹאדִית), נוצרות על ידי monolayer של תאים מקוטבים החלב אפיתל הפרשה (MESCs), עם קרום הפלזמה פסגתם תיחום לומן. Alveoli לארגן את עצמם לאוניות שמקובצות לאונות מחוברות לצינורות המנקזים חלב לסביבה החיצונית (איור 2, אונה). הנקה מתרחשת, כלומר., MESCs להתחיל להפריש כמויות שופעות של חלב, מופעלות בעיקר על ידי הירידה בהורמוני שליה (בעיקר פרוגסטרון) (איור 1, הנקה). גני חלבון חלב מופעלים בקורס זמן זמני מוגדר החל הריון להנקת 9,22,23, בעיקר בתגובה לPRL יותרת המוח שוחרר בזמן היניקה. במקביל, אנשי קשר בין MESCs ומטריקס שני לעורר synt חלבון חלבhesis באמצעות אותות שמתווכים באמצעות האינטראקציות בין integrins וlaminin 24,25 הסלולריים, ולדכא אפופטוזיס בMESCs 26,27. מסלולי איתות אלה יגרמו להפעלה של יזמי גן חלבון חלב 28 דרך ההפעלה של שעתוק ספציפי גורמי 29. קשר תאי תאים הם חשוב גם להיבטים מסוימים של בידול לרבות הקמת קוטביות הפסגה והפרשת הווקטורים של מוצרי חלב. צמתים הדוקים קרובים במהירות לאחר תחילת ההנקה וMESCs דק לתזמר את הספיגה של מולקולות מהדם, כמו גם את הסינתזה, התחבורה וההפרשה של מרכיבי חלב, בתגובה לדרישות התזונתיות של ילודים. בזמן היניקה, ההתכווצות של התאים המקיפים את myoepithelial alveoli מתרחשת בתגובה לאוקסיטוצין וגורמת לשחרור חלב דרך הצינורות ולפטמה. חלב הוא נוזל מורכב שמכיל חלבונים (בעיקרcaseins), סוכרים (בעיקר לקטוז), שומנים ומינרלים, כמו גם מולקולות ביו כגון נוגדנים (IgA), גורמי גדילה והורמונים. Caseins מסונתזים, התאסף במבנים על-מולקולריים, כלומר קזאין מיצלות, מועבר לאורך מסלול ההפרשה, ולאחר מכן שוחרר על ידי exocytosis, כלומר, שילוב של שלפוחית ​​הפרשה המכיל קזאין (SVS) עם קרום הפלזמה הפסגה של המסקלין (איור 2).

תנועה תאית מסתמכת על חילופי חומרים בין תאים הקרומיים וכרוכה מסיס N-ethylmaleimide רגיש Fusion (NSF) חלבון קובץ מצורף (SNAP) קולטן (מלכודת) 30,31. חלבוני מלכודת המשפחה מחולק במלכודות לפוחי (V-מלכודות), הנמצאות בקרום השלפוחית, ומלכודות יעד (t-מלכודות), מקומיות על קרומי היעד. על ידי רוכס דרך תחומים סליל המפותל שלהם, למלכודות לא V- ולהרכיב כדי ליצור חבילה מורכבת ארבעה-סליל מאוד יציב, המכונה המורכב מלכודת דואר. מורכב זו מקדמת את השילוב של שני bilayers שומנים היריב על ידי הבאת אותם בהדרגה לקרבה 30,32. לאחר מכן, מתחמי מלכודת הם ניתקו על ידי triphosphatase אדנוזין NSF וחלבוני SNAP ומלכודת חלבון מתאם שלה ממוחזרים בחזרה לתא מוצאם 33. מעניין, כל חלבון מלכודת בעיקר מתגורר בתאים סלולריים שונים וזיווג מלכודת עשויה לתרום לספציפיות של אירועי היתוך תאיים 34. המחקרים קודמים מצביעים על כך שלפחות Synaptosomal הקשורים חלבון 23 (SNAP23) וחלבון שלפוחיות קרום הקשורים 8 (VAMP8), וsyntaxins (STX) -7 ו-12 לשחק תפקיד בexocytosis קזאין 35,36. חלבונים אלה יש גם נמצאים בקשר עם חלק השומנים חלב, כלומר, שומן חלב כדוריות (MFGs) 37. המודל הרווח הנוכחי מניח כי טיפות cytoplasmic שומנים (CLDs) נוצרות על ידי ההצטברות של l הניטרליipids (בעיקר triacylglycerols ואסטרים סטרולים) וכולסטרול נובע מהתזונה האימהית בין שני העלונים של קרום reticulum endoplasmic (ER) 38-41. CLDs הגדול נוצרים, לפחות בחלקו, על ידי השילוב של CLDs הקטן יותר, תוך העברתו לצד הפסגה של MESCs שבו הם שוחררו כMFGs (1-10 מיקרומטר בקוטר) על ידי ניצנים, שעטופה בקרום הפלזמה פסגת המסקלין 40-42. הנקה מפסיקה אחרי הגורים נגמלים וMESCs למות בהדרגה על ידי אפופטוזיס, שהוביל לנסיגה של רקמת השד בחזרה למצב התבגרות (איור 1, פוף).

Immunofluorescence (IF) הוא שיטת מעבדה האנליטית נפוצה בשימוש כמעט בכל ההיבטים של ביולוגיה, הן במחקר ואבחון קליני ב. אם ניתן לבצע טכניקות בסעיפי רקמות (אימונוהיסטוכימיה, IHC) או תא (immunocytochemistry, ICC) דגימות. גישה זו עוצמה מסתמכת על השימוש בניאוןנוגדנים שכותרתו כי דווקא להיקשר לאנטיגן של עניין (במישרין או בעקיפין), ובכך מאפשרים ההדמיה של רקמות ההפצה שלה באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי. אותות הקרינה בעיקר תלויים באיכות ובריכוז של הנוגדנים וטיפול נכון של הדגימה. פרוטוקול פשוט immunofluorescence העקיף (IIF) מוצג לזהות מוצרי חלב (caseins וMFGs) וחלבונים מעורבים בהפרשת מוצר חלב (butyrophilin (BTN1), מלכודת חלבונים) בחלקים קפואים של רקמת שד עכבר (איור 3). בעוד פרוטוקול זה מספק סקירת IHC מלאה, החל מאיסוף רקמות לאחר טיפול תמונה, ביקורתי וצעדים אופציונליים, כמו גם כמה המלצות טכניות גם הוצג ונדון.

Protocol

עכברי CD1 גדלו בINRA (UE0907 IERP, Jouy-en-Josas, צרפת). כל ההיבטים האתיים של טיפול בבעלי החיים עמדו בהנחיות הרלוונטיות ודרישות רישוי שנקבעו על ידי משרד החקלאות הצרפתי. הנהלים המשמשים אושרו על ידי הוועדה המקומית אתיקה (הסכם 12/097 מComethea Jouy-en-Josas / AgroParisTech).

לדוגמא הכנת 1. בלוטת החלב

  1. נתיחת בלוטת החלב עכבר
    1. להרדים עכברים ביום 10 בהנקה על ידי נקע בצוואר הרחם ולהצמיד את החיה למטה עם הבטן שלה פונה כלפי מעלה.
    2. להרטיב את אזור הגחון עם אתנול ולייבש אותו עם מגבת נייר.
    3. בעזרת מלקחיים, למשוך את עור הבטן בין שתי רגליו האחוריות ועושה חתך (דרך העור בלבד) של כ 1 סנטימטר במספריים חדים. החל מהחתך הראשון, ולאחר מכן להשתמש במספריים לחתוך את העור עד הצוואר בעכבר. למשוך את העור מהצפק ופאיn את הצד של עור אחד בכל פעם, מותח אותו לימד.
    4. אסוף את הבטן ובלוטות החלב מפשעתי ידי דוחף אותם במרחק של העור עם ספוגית ולבסוף מושכים או חיתוכם מהצפק.
      הערה: בשלב זה מכתים קרמיין ניתן לבצע על מנת להמחיש את האפיתל החלב בתוך הבלוטה כולה 43. גישה זו יכולה להיות שימושית כדי לנתח את המורפולוגיה הגלובלית של בלוטת החלב בתנאים שונים (שלבי התפתחות פיסיולוגיים, מחלות, in vivo טיפולים).
    5. הסר את הבלוטה לימפה ממוקמת בצומת של הבטן והבלוטות מפשעתי 44.
  2. קיבעון רקמות החלב
    1. חותך את רקמת השד ל3 מ"מ 3 שברים עם אזמל ומייד לשטוף ברים אלה שבנאגרו מלוח פוספט פתרון (PBS), pH 7.4, על מנת להסיר כמה שיותר חלב ככל האפשר.
    2. מהירות לייבש את שברים על ניירמגבת ולשים אותם בפתרון קר PBS המכיל paraformaldehyde 4% (PFA, HCHO, 32% תמיסת פורמלדהיד, זהירות) במשך 10 עד 15 דקות על קרח.
      הערה: זה מספיק זמן כדי לאפשר ניתוח שלאחר מכן על פרוסות רקמת שד על ידי IIF36 ו / או הכלאה באתר 45. עם זאת, כפי שfixatives אלדהיד לחדור די לאט בחתיכות רקמה (~ 1-3 מ"מ לשעה), זמן זה עשוי להתארך כדי להבטיח קיבוע אופטימלי של דגימת הרקמה. לחלופין, לתקן רקמות in vivo על ידי מרוסס חיה הרדים עם פתרון מקבע (לא פורט במחקר הנוכחי).
  3. עירוי סוכרוז
    1. מהירות לשטוף את שברי החלב בקור PBS ולטבול אותם בפתרון קר PBS המכיל סוכרוז 40% (D-saccharose, C12H22O11, גרם מר 342.3 / mol) ל16-48 שעות על 4 מעלות צלזיוס בטלטול עדין.
  4. הטבעת רקמות
    הערה:, יכולים לחתוך מחדש בשלב זה שברי החלב להיות על מנת להפוך את שברים קטנים (2-3 מ"מ 3) או להתאים את צורתם.
    1. כראוי לתייג את תבניות הפלסטיק ולמלא שליש מהנפח של העובש עם מתחם אוקטובר, שמרו על RT. מניחים שבר אחד (2-3 מ"מ 3) של רקמת שד לעובש ולכסות אותו עם מתחם OCT.
    2. מניחים את התבניות על פני השטח של החנקן הנוזלי (על גיליון האלומיניום או באמצעות מסננת מתכתית) ולאפשר למוצר להקפיא.
      הערה: זה חייב להיות מוצק ולבן לפני טבילת העובש בחנקן נוזלי.
  5. אחסן את הדגימות קפואות ב -80 ° C עד סעיפי רקמות מבוצעים.

2. חתך רקמה קפוא

הערה: cryostat, שהוא למעשה microtome בתוך מקפיא, נדרש כדי להפוך את קטעי רקמה קפוא. טמפרטורה נמוכה יותר לעתים קרובות נדרשת לרקמות שומן או שומנים בדם עשיר כגון בלוטת החלב בתולה.

  1. כוון את הטמפרטורה של cryostat ל-26 מעלות צלזיוס ולחכות עד שיש לו stabilized. לשמור על גוש הרקמה הקפוא ב-26 מעלות צלזיוס לאורך כל הליך חתך. בהחלט למנוע הפשרת הרקמה בכל עת במהלך ההליך.
  2. לקרר את סכין הגילוח, תמיכת החיתוך, מכשיר אנטי-רול והמברשת ל-26 מעלות צלזיוס על ידי הצבת אותם בcryostat לפחות 10 דקות. גם למקם תיבת שקופיות בתוך cryostat כדי להיות מסוגל לאחסן שקופיות זכוכית כחלקים נעשים.
  3. כראוי לתייג את שקופיות הזכוכית שתשמש לאיסוף קטעי הרקמה ולשמור אותם בRT; אחרת סעיפי רקמות לא ידבקו אליהם. הסר את המדגם מהעובש בתוך cryostat.
    הערה: מטען חשמלי חיובית שקופיות זכוכית באמצעות תעדיף את ההידבקות של חלקי רקמות קפואים מאוד בשל משיכה אלקטרוסטטית גבוהה יותר.
  4. מכסה את פני השטח של דיסק רקמת מתכת עם מתחם אוקטובר (שמרו על RT) ולדחוף את המדגם הקפוא על גבי זה. הנח הר הרטוב בתוך cryostat ולתת לו במשותףol לפחות 15 דקות.
  5. מניחים את ההר הרטוב בבעל הדיסק של cryostat. התאם את עובי חתך 5-6 מיקרומטר, ואם אפשר, להשתמש בסכין חד חדש או לפחות לשנות את האזור על הלהב משמש לחיתוך כל דגימה שכן כמה רקמות תהיה במהירות משעממת.
  6. להתאים את המיקום של המכשיר אנטי-רול על סכין הגילוח על ידי ביצוע חתכים של ההרכבה בינונית עד שהפרוסות נוצרות באופן שווה ונכון. באופן אידיאלי, המכשיר אנטי-רול יהיה לדרוך על סכין הגילוח בכ -1 מ"מ.
  7. ברגע שההגדרות נכונות, לבצע קטעי רקמה על ידי סיבוב הגלגל בתנועה אחידה רציפה. אלא אם כן הטמפרטורה אידיאלית, סעיף רקמה, על ידי הטבע, מנסה להתכרבל.
    1. השתמש במברשת כדי לתפוס ולתמרן את הסעיף לרוחב הבמה כדי למקם אותו כרצונך בשקופית הזכוכית. השתמש במברשת כדי לנקות את השרידים אולי קיימים בבלוק הקפוא רקמות ו / או סכין הגילוח.
  8. מְשׁוֹךסעיף הרקמה כלפי המשתמש ולהימנע מללחוץ אותו על הבמה cryostat. הימנע לחיצה על קטע הרקמה על הבמה cryostat כפי שהוא עשוי להוביל להידבקות של פרוסת הרקמה על הבמה ובכך חוסר היכולת לשחזר אותו עם שקופיות הזכוכית.
  9. אחזר סעיפי רקמות אחד אחד על ידי לקטוף אותם על פני השטח של שקופיות זכוכית, על ידי מחזיק אותו מעל לסעיף ולדוג אותו לגעת בסעיף הרקמה.
    הערה: סעיפי רקמות לדבוק במהירות לזכוכית החמה בשל המשיכה סטטי. אם כמה קטעי רקמה ממוקמים באותו השקופיות, להיזהר שלא חופף אותם ולחלל אותם מספיק כדי להיות מסוגל לצרף אותם בנפרד במעגל הידרופובי (ראה סעיף 3.1.1.).

3. Immunofluorescence העקיף

  1. איתור חלקים
    1. השתמש בעט מחסום הידרופובי לצייר מעגל הידרופובי סביב רקמה רכוב שקופיות. בואו יבש המעגל כ 1 דקות ב RT. למתוח קו סביב tסעיפי בעיה עם סמן קבע שחור משובח, כמו גם, אבל בצד של שקופיות הזכוכית הפוכה לזה שבו סעיפי הרקמות הם.
      הערה: מעגל זה הוא דוחה מים וacetone- ואלכוהול מסיס. לכן מספק מחסום לתמיסות מימיות המשמשות במהלך הליך IHC ומקטין את הנפח של חומרים כימיים הנדרשים.
    2. רעננות סעיפי רקמות על ידי מכסה אותם עם טיפה ~ 250 μl של PBS במשך כמה דקות על RT. לתקן סעיפי רקמות על ידי מכסה אותם עם ~ 250 μl של 3% פתרון PFA מוכן טרי בPBS במשך 10 עד 15 דקות.
      הערה: לחלופין במקרה זה, להשתמש בפתרון מרווה אלדהיד (אמוניום כלוריד 50 מ"מ (NH 4 Cl, מר 53.5 g / mol) ב PBS או 0.1M גליצין (C 2 H 5 מס '2, מר ז 75.07 / mol) ב PBS ) כדי לעצור את תגובת הקיבעון. שטיפת PBS פשוטה ושפע היא בדרך כלל מספיק כדי להסיר אלדהיד unreacted.
  2. אחזור Antigen (אופציונאלי)
    הערה: בעוד שניתן מזוהים ביותר אנטיגנים ללא אחזור אנטיגן (AR), אחרים יקויימו רק אם צעד זה מבוצע. במקרים מסוימים, AR גם מאפשר השיפור של האות נצפתה.
    1. מניחים את פתרון AR (4 H 100 מ"מ טריס (C 11 NO 3, מר 121.14) אוריאה 5% (NH 2 CONH 2, מר 60.06) pH 9.6) בכוס. הנפח של פתרון AR חייב להיות מספיק כדי לכסות את שקופיות הזכוכית להציב בבעל זכוכית לחלוטין.
    2. מחממים את פתרון AR עד 95 ° C על ידי ניטור הטמפרטורה עם מדחום ולאחר מכן למקם את שקופיות זכוכית על מדף מתאים, טובלי המדף במאגר החם, כיסוי להגביל אידוי ודגירה של 10 דקות על 95 מעלות צלזיוס.
    3. הסר את הכוס מאמבט המים ולהשאיר את שקופיות זכוכית לעוד 10 דקות במאגר.
  3. Immunodetection
    1. יש לשטוף את חלקי רקמות עם PBS (~ 250 μl / סעיף) ולהרוות אותם עם פתרוןשל 3% אלבומין בסרום שור (BSA, ~ 250 μl / סעיף) ב PBS לפחות 30 דקות ב RT.
    2. שים 30-50 μl של הנוגדן הראשוני מדולל PBS המכיל BSA 2% על כל קטע רקמה.
      הערה: נפח זה מספיק כדי ליצור טיפה שמכסה את קטע הרקמה לחלוטין.
    3. הנח את אותו הנפח של diluent (BSA 2% ב PBS) לבד בקטע רקמה לבצע ביקורת שלילית בלי נוגדן ראשוני.
      1. באופן שיטתי כולל שליטה שלילית זה בכל ניסוי IHC ולבצע עבור כל נוגדנים משני המשמשים להערכת הרקע של הניסוי (התיוג שאינו ספציפי בשל נוגדנים משני ו / או אוטומטי הקרינה הרקמות). סוגים אחרים של בקרות חיוביות או שליליות יכולים גם להתבצע על מנת להבטיח את הספציפיות של התיוג (ראו דיון).
    4. מניחים את שקופיות הזכוכית בO תיבת humidified / N ב 4 ° C.
      הערה: נוגדנים חד שבטי עיקריים בם השתמשו היו עכבר אנטי cytokeratinקזאין 8 (CK8, 01:50 דילול), חד שבטי עכבר אנטי cytokeratin 14 (CK14, 01:50 דילול), ארנב polyclonal אנטי עכבר (# 7781, 01:50 דילול, הניתן בנדיבות על ידי MC נוויל, אוניברסיטת קולורדו הבריאות מרכז למדעים, CO, ארה"ב), polyclonal הארנב נגד BTN1 (דילול 1: 300, ובלבד בנדיבות על ידי IH מאת'ר, מחלקה למדעי בעלי חיים ועופות, אוניברסיטת מרילנד, MD, ארה"ב), polyclonal הארנב נגד Stx6 ( 01:50 דילול, הניתן בנדיבות על ידי ס Tooze, מחקר הסרטן בבריטניה, לונדון מכון מחקר, לונדון, בריטניה) ואנטי-VAMP4 ארנב polyclonal (01:50 דילול).
    5. ביסודיות לשטוף חלקי רקמות עם PBS לפחות ארבע פעמים במשך 10 דקות ב RT.
    6. לדלל את הנוגדן המתאים המשני (IgG העז rhodamine מצומדות- נגד ארנב (L H +), 1: 300 דילול) בPBS המכיל BSA 2%, מקום 30-50 μl של פתרון זה על כל סעיפי הרקמות, ודגירה של 1.5 שעות ב RT.
      1. מאז fluorochromes הן מולקולות רגישות לאור, לאלחשוף חלקי רקמות לאור עד הניתוח שלהם. לIIF על סעיפי רקמות, להעדיף נוגדנים משני מצמידים את fluorophore אדום מאז קרום תא נוטה ליצור אוטומטי הקרינה ירוקה שיכול להפריע לתיוג נמוך. יתר על כן, בחירת נוגדנים משני מצמידים fluorophore אדומים מאפשרת תיוג הנלווה של שומנים ניטראליים (ראה להלן).
    7. ביסודיות לשטוף את חלקי רקמות עם PBS לפחות ארבע פעמים במשך 10 דקות ב RT.
  4. לאחר קיבוע (אופציונאלי)
    1. עבור חלק מניסויים, לבצע לאחר קיבוע-ידי דוגרים הדגימות עם 2% PFA מדולל PBS במשך 10 דקות ב RT על מנת לייצב את פיגומי אנטיגן / נוגדן. עם זאת, ניתן לוותר על שלב זה עם ברוב המקרים.
  5. שומנים ניטראליים וcounterstaining DNA
    1. כדי להמחיש CLDs וMFGs, שומנים ניטראליים צבע על ידי דוגרים סעיפי רקמות ב30-50 μl של פתרון PBS המכיל 3 מיקרוגרם / מיליליטר של bodipy 493/ 503 במשך 10 דקות ב RT. מהירות לשטוף חלקי רקמות פעמיים עם PBS.
    2. Counterstain DNA הגרעיני עם 30-50 μl של פתרון PBS המכיל 3 מיקרומטר של DAPI (4-6-diamidino-2-phenylindole, 5 מ"ג / מיליליטר פתרון מניות) במשך 10 דקות ב RT. שטוף את חלקי רקמות פעמיים עם PBS לפני ההרכבה המגלשות לתצפית.
  6. הרכבת סעיף
    1. הסר PBS ומניח ירידה של מדיום הרכבה על כל קטע רקמה.
    2. הנח בצד אחד של להחליק את המכסה בזווית נגד השקופיות, יצירת קשר עם הקצה החיצוני של הירידה הנוזלית ולאחר מכן להוריד את הכיסוי באיטיות, למנוע בועות אוויר. תאפשר לנוזל התפשט בין שקופיות הזכוכית ולהחליק את המכסה לכמה דקות ולאחר מכן להסיר את העודפים של הרכבה בינונית עם מגבת נייר.
    3. לאטום את תלוש לכסות לשקופית הזכוכית עם חלקי לק ורקמת החנות ב 4 מעלות צלזיוס, כדי למנוע החשיפה שלהם לאור עד תצפית.

4. הקרינה תצפית ותמונת רכישה

הערה: מיקרוסקופ פלואורסצנטי מצויד במצלמה הנשלטת על ידי תוכנת רכישת תמונה נדרשה לבחון את תוצאות IHC.

  1. לפני רכישת תמונות, לבדוק את עוצמת התיוג ולהעריך את הרקע של הניסוי על ידי הסתכלות על הפקדים השליליים. לרכוש תמונות בכל תווית ניאון (ערוץ צבע) בנפרד.
  2. לרכוש את כל התמונות, כולל אלו של הבקרות המתאימות, באותם תנאים (חשיפה והגדרות כלליות) עבור כל ערוץ צבע.
  3. מיקרוסקופיה הקונבנציונלית
    1. בצע מיקרוסקופיה epifluorescence עם מיקרוסקופ מצויד במסננים סטנדרטיים לisothiocyanate והעמסת (FITC, ירוק), rhodamine (אדום) ופליטת DAPI (כחול), × 20 × 63 ל( טבילה שמן, NA 1.3) מטרות ומצלמה ההדמיה DP50.
  4. מיקרוסקופיה confocal
  5. בצע מיקרוסקופיה confocal עם מיקרוהתמודד, מצויד בתוכנת ZEN, באמצעות × 20 × 63 ל( טבילה שמן, NA 1.4) מטרות ואורכי גל עירור 488- 568 ננומטר ושל הלייזר.

טיפול 5. תמונה

הערה: כל פוסט טיפולי התמונה מבוצעים באמצעות תוכנת ImageJ בחינם (http://imagej.nih.gov/ij/).

  1. להרכיב תמונה (למזג)
    1. פתח את התמונות שנרכשו בכל ערוץ שיהיה משולב (קובץ / פתוח). אם עובד עם 8 ביט תמונות בגווני אפור, צבע מלאכותי לייחס לכל אחד מערוצים באמצעות טבלת החיפוש (לוחות תמונה / בדיקה).
    2. צור תמונה המורכבת מ תמונות בגווני אפור או בצבע באמצעות הפקודה "מיזוג ערוצים" (תמונה / צבע / מיזוג ערוצים) ולאחר מכן ייחוס צבע לכל ערוץ.
    3. בצע תמונת ערימות חפיפה באותו אופן על ידי פתיחת ערימות נרכשו בכל ערוץ שיהיה משולב (קובץ / פתוח) ובאמצעות הפקודה "מיזוג ערוצים ו# 8221; (תמונה / צבע / מיזוג ערוצים) לייחס צבע לכל ערוץ. שמור את המחסנית מרוכבת כרצף תמונה או כסרט (ראה סעיף 5.4).
  2. הקרנת Z ערימת תמונה
    1. השתמש בפונקצית הקרנת Z (תמונה / מחסנית / Zproject, עצמת מקס) כדי לספק תצוגה דו-ממדית של כל התמונות של ערימת תמונה על ידי הקרנתם לאורך ציר ניצב למישור התמונה (ציר z). האפשרות "העוצמה מקסימלית" יוצרת תמונה שבה כל פיקסל מכיל את הערך המקסימאלי על כל התמונות בערימה. זה יוצר תמונה אחת המאפשרת ההדמיה של כל הכתמים שנצפו דרך כל ערימת התמונה לערוץ מסוים או לאחר חפיפה של מספר ערוצים.
  3. הקרנת 3D ערימת תמונה
    1. השתמש בפקודת הקרנת 3D (פרויקט תמונה / מחסנית / 3D, הצבע בהיר, ציר y) כדי ליצור רצף של תחזיות של נפח מסתובב על מטוס. העיבוד החזותי של surfaces ומבנים פנימיים תלויים הן בשיטת ההקרנה (הקרובה ביותר לנקודה, הנקודה הבהירה ביותר (משמשת כאן), או מתכוון-הערך) ופרמטרי ההדמיה נבחרו. כל מסגרת של רצף האנימציה היא התוצאה של תכנון מזווית צפייה שונה.
    2. סובב את תמונת 3D שנוצרה סביב כל אחת משלושת הצירים המאונכות (ציר y נבחר כאן). שמור את הרצף מיוצר כתמונה אחת או סרט.
  4. ערימת תמונה להמרת סרט
    1. פתח ערימת תמונה (קובץ / פתוח) ולשמור אותו כסרט בפורמט .AVI באמצעות הפקודה "AVI" (קובץ / שמירה ב/ AVI).

תוצאות

בלוטת החלב היא בלוטה תת עורית הממוקמת לאורך מבנה הגחון של שני החזה והבטן במכרסמים. המיקום של חמישה הזוגות של בלוטות של העכבר במהלך ההריון מוצג באיור 4. המורפולוגיה של בלוטת החלב באופן דרמטי משתנה במהלך התפתחותו, המשקף שינויים פונקציונליים הנדרשים להכ...

Discussion

IHC הוא שיטה ניסיונית יחסית פשוטה וישירה בתרגום אנטיגן בסעיפים רקמות, שתלוי בעיקר באינטראקציות epitope-נוגדן ספציפיים. למרות מספר גדול של פרוטוקולים המשמש בתרגום חלבון על ידי IIF, הליבה של הליכים אלה היא כמעט תמיד זהה. עם זאת, יש כמה היבטים קריטיים שיכול מאוד להשפיע על התוצ?...

Disclosures

המחברים מצהירים שאין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.

Acknowledgements

המחברים מודים למתקן גרעין ההדמיה INRA MIMA2 (INRA, UMR1198, Jouy-en-Josas) וצוות של יחידת IERP (UE 0,907, INRA, Jouy-en-Josas) לטיפול בבעלי חיים ומתקנים. כמו כן, אנו רוצים להודות לIH מאת'ר, MC נוויל וס Tooze שספק לנו antibodie מאוד שימושי.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
DissectionCompanyCatalog NumberComments/Description
Pins
Ethanol
Scissors
Scalpel and adapted blades
Ice
Towel paper
Tissue sample preparationCompanyCatalog NumberComments/Description
Phosphate Buffered Saline (pH7.4)SigmaP-3813
Paraformaldehyde (PFA, 32% EM grade, 100 ml)Electron Microscopy Sciences15714-Spersonnal protection equipment required WARNING: this product will expose you to Formaldehyde Gas, a chemical known to cause cancer
OCT compound/Tissue TekSakura4583
Sucrose (D-saccharose)VWR27480.294
Plastic moldsDominique Dutscher39910
Liquid nitrogen
Cryostat/sample supportLeica CM3050S
Razor blades (SEC35)Thermo Scientific152200
Slide box
Glass slides Superfrost/Superfrost Ultra PlusThermo Scientific10143560W90/1014356190
Brushes
IHCCompanyCatalog NumberComments/Description
Super Pap PenSigmaZ377821-1EA
Permanent marker (black)
50 mM NH4Cl in PBSSigmaA-0171
0.1 M glycine in PBSVWR24403.367
Antigen Retrieval solution: Tris 100 mM 5% urea pH9.6
Heater (up to 100°C)
Bovine Serum Albumin (BSA)SigmaA7906-100G
Vectashield (anti-fading mounting medium) without DAPI/with DAPIVector LaboratoriesH-1000/H-1200
Glass coverslips 22x50mm (microscopy grade)VWRCORN2980-225
Nail polish
Primary antibodiesCompanyCatalog NumberComments/Description
Rabbit anti-mouse caseins (#7781; 1:50 dilution)generously gifted by M.C. Neville (University of Colorado Health Sciences
Center, USA)
Mouse anti-cytokeratin 8 (CK8, clone 1E8, 1:50 dilution)Biolegend (Covance)MMS-162P
Mouse anti-cytokeratin 14 (CK14, cloneLL002, 1:50 dilution)Thermo ScientificMS-115-P0/P1
Rabbit anti-butyrophilin (1:300 dilution)generously gifted by I.H. Mather (Department of Animal and Avian Sciences University of Maryland College Park, USA)
Rabbit anti-Stx6 (1:50 dilution)generously gifted S. Tooze
(Cancer Research UK, London Research Institute, London, UK)
Rabbit anti-VAMP4 (1:50 dilution)Abcamab3348
Secondary antibodiesCompanyCatalog NumberComments/Description
Rhodamine-conjugated goat anti-rabbit IgG (H + L) (1:300 dilution)Jackson ImmunoResearch Laboratories111-025-003
CounterstainsCompanyCatalog NumberComments/Description
Bodipy 493/503Life Technologies (Molecular Probes)D-3922
DAPI (4-6-diamidino-2-phenylindole)Life Technologies (Molecular Probes)D-1306
Observation/Image captureCompanyCatalog NumberComments/Description
conventional fluorescence microscopeLeica Leitz DMRB
microscope		Standard filters for FITC, Rhodamine
and DAPI emissions,                     ×63 oil-immersion objective (NA 1.3), DP50 imaging camera (Olympus), CellˆF software (Olympus)
Laser Scanning Microscope (confocal microscopy)Zeiss LSM
510 microscope		Plan-Apochromat ×63 oil-immersion objective (NA 1.4),                  CLSM 510 software,               Confocal facilities, MIMA2 Platform, INRA Jouy-en-Josas, France, http://mima2.jouy.inra.fr/mima2)
Image treatmentCompanyCatalog NumberComments/Description
ImageJ 1.49k softwareFree software

References

  1. Watson, C. J., Khaled, W. T. Mammary development in the embryo and adult: a journey of morphogenesis and commitment. Development. , 135-995 (2008).
  2. Smith, G. H. Experimental mammary epithelial morphogenesis in an in vivo model: evidence for distinct cellular progenitors of the ductal and lobular phenotype. Breast Cancer Res Treat. 39, 21-31 (1996).
  3. Van Keymeulen, A., et al. Distinct stem cells contribute to mammary gland development and maintenance. Nature. 479, 189-193 (2011).
  4. Oakes, S. R., Gallego-Ortega, D., Ormandy, C. J. The mammary cellular hierarchy and breast cancer. Cell Mol Life Sci. 71, 4301-4324 (2014).
  5. Visvader, J. E., Stingl, J. Mammary stem cells and the differentiation hierarchy: current status and perspectives. Genes & development. 28, 1143-1158 (2014).
  6. Robinson, G. W. Cooperation of signalling pathways in embryonic mammary gland development. Nat Rev Genet. 8, 963-972 (2007).
  7. Cowin, P., Wysolmerski, J. Molecular mechanisms guiding embryonic mammary gland development. Cold Spring Harb Perspect Biol. 2, a003251 (2010).
  8. Brisken, C., O'Malley, B. Hormone action in the mammary gland. Cold Spring Harb Perspect Biol. 2, a003178 (2010).
  9. Gjorevski, N., Nelson, C. M. Integrated morphodynamic signalling of the mammary gland. Nat Rev Mol Cell Biol. 12, 581-593 (2011).
  10. Daniel, C. W., Smith, G. H. The mammary gland: a model for development. J Mammary Gland Biol Neoplasia. 4, 3-8 (1999).
  11. Howlett, A. R., Bissell, M. J. The influence of tissue microenvironment (stroma and extracellular matrix) on the development and function of mammary epithelium. Epithelial Cell Biol. 2, 79-89 (1993).
  12. Edwards, G., Streuli, C. Signalling in extracellular-matrix-mediated control of epithelial cell phenotype. Biochem Soc Trans. 23, 464-468 (1995).
  13. Hennighausen, L., Robinson, G. W. Think globally, act locally: the making of a mouse mammary gland. Genes & development. 12, 449-455 (1998).
  14. Topper, Y. J., Freeman, C. S. Multiple hormone interactions in the developmental biology of the mammary gland. Physiol Rev. 60, 1049-1106 (1980).
  15. Brisken, C., et al. A paracrine role for the epithelial progesterone receptor in mammary gland development. Proc Natl Acad Sci U S A. 95, 5076-5081 (1998).
  16. Ormandy, C. J., Binart, N., Kelly, P. A. Mammary gland development in prolactin receptor knockout mice. J Mammary Gland Biol Neoplasia. 2, 355-364 (1997).
  17. Oakes, S. R., Rogers, R. L., Naylor, M. J., Ormandy, C. J. Prolactin regulation of mammary gland development. J Mammary Gland Biol Neoplasia. 13, 13-28 (2008).
  18. Hennighausen, L., Robinson, G. W. Information networks in the mammary gland. Nat Rev Mol Cell Biol. 6, 715-725 (2005).
  19. Kouros-Mehr, H., Werb, Z. Candidate regulators of mammary branching morphogenesis identified by genome-wide transcript analysis. Dev Dyn. 235, 3404-3412 (2006).
  20. Khaled, W. T., et al. The IL-4/IL-13/Stat6 signalling pathway promotes luminal mammary epithelial cell development. Development. 134, 2739-2750 (2007).
  21. Asselin-Labat, M. L., et al. Gata-3 is an essential regulator of mammary-gland morphogenesis and luminal-cell differentiation. Nat Cell Biol. 9, 201-209 (2007).
  22. Barcellos-Hoff, M. H., Aggeler, J., Ram, T. G., Bissell, M. J. Functional differentiation and alveolar morphogenesis of primary mammary cultures on reconstituted basement membrane. Development. 105, 223-235 (1989).
  23. Robinson, G. W., McKnight, R. A., Smith, G. H., Hennighausen, L. Mammary epithelial cells undergo secretory differentiation in cycling virgins but require pregnancy for the establishment of terminal differentiation. Development. 121, 2079-2090 (1995).
  24. Streuli, C. H., Bissell, M. J. Mammary epithelial cells, extracellular matrix, and gene expression. Cancer Treat Res. 53, 365-381 (1991).
  25. Streuli, C. H., et al. Laminin mediates tissue-specific gene expression in mammary epithelia. J Cell Biol. 129, 591-603 (1995).
  26. Boudreau, N., Sympson, C. J., Werb, Z., Bissell, M. J. Suppression of ICE and apoptosis in mammary epithelial cells by extracellular matrix. Science. 267, 891-893 (1995).
  27. Pullan, S., et al. Requirement of basement membrane for the suppression of programmed cell death in mammary epithelium. J Cell Sci. 109 (Pt 3), 631-642 (1996).
  28. Schmidhauser, C., Bissell, M. J., Myers, C. A., Casperson, G. F. Extracellular matrix and hormones transcriptionally regulate bovine beta-casein 5' sequences in stably transfected mouse mammary cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 87, 9118-9122 (1990).
  29. Streuli, C. H., et al. Stat5 as a target for regulation by extracellular matrix. J Biol Chem. 270, 21639-21644 (1995).
  30. Sollner, T., et al. SNAP receptors implicated in vesicle targeting and fusion. Nature. 362, 318-324 (1993).
  31. Jahn, R., Scheller, R. H. SNAREs--engines for membrane fusion. Nat Rev Mol Cell Biol. 7, 631-643 (2006).
  32. Weber, T., et al. SNAREpins: minimal machinery for membrane fusion. Cell. 92, 759-772 (1998).
  33. Sollner, T., Bennett, M. K., Whiteheart, S. W., Scheller, R. H., Rothman, J. E. A protein assembly-disassembly pathway in vitro that may correspond to sequential steps of synaptic vesicle docking, activation, and fusion. Cell. 75, 409-418 (1993).
  34. McNew, J. A. Regulation of SNARE-mediated membrane fusion during exocytosis. Chem Rev. 108, 1669-1686 (2008).
  35. Wang, C. C., et al. VAMP8/endobrevin as a general vesicular SNARE for regulated exocytosis of the exocrine system. Mol Biol Cell. 18, 1056-1063 (2007).
  36. Chat, S., et al. Characterisation of the potential SNARE proteins relevant to milk product release by mouse mammary epithelial cells. Eur J Cell Biol. 90, 401-413 (2011).
  37. Reinhardt, T. A., Lippolis, J. D. Bovine milk fat globule membrane proteome. J Dairy Res. 73, 406-416 (2006).
  38. Robenek, H., et al. Butyrophilin controls milk fat globule secretion. Proc Natl Acad Sci U S A. 103, 10385-10390 (2006).
  39. Fujimoto, T., Ohsaki, Y., Cheng, J., Suzuki, M., Shinohara, Y. Lipid droplets: a classic organelle with new outfits. Histochem Cell Biol. 130, 263-279 (2008).
  40. Mather, I. H., Keenan, T. W. Origin and secretion of milk lipids. J Mammary Gland Biol Neoplasia. 3, 259-273 (1998).
  41. Heid, H. W., Keenan, T. W. Intracellular origin and secretion of milk fat globules. Eur J Cell Biol. 84, 245-258 (2005).
  42. McManaman, J. L., Russell, T. D., Schaack, J., Orlicky, D. J., Robenek, H. Molecular determinants of milk lipid secretion. J Mammary Gland Biol Neoplasia. 12, 259-268 (2007).
  43. de Assis, S., Warri, A., Cruz, M. I., Hilakivi-Clarke, L. Changes in mammary gland morphology and breast cancer risk in rats. Journal of visualized experiments : JoVE. , (2010).
  44. Plante, I., Stewart, M. K., Laird, D. W. Evaluation of mammary gland development and function in mouse models. Journal of visualized experiments : JoVE. , (2011).
  45. Galio, L., et al. MicroRNA in the ovine mammary gland during early pregnancy: spatial and temporal expression of miR-21, miR-205, and miR-200. Physiol Genomics. 45, 151-161 (2013).
  46. Linzell, J. L., Peaker, M. The effects of oxytocin and milk removal on milk secretion in the goat. J Physiol. 216, 717-734 (1971).
  47. Knight, C. H., Peaker, M., Wilde, C. J. Local control of mammary development and function. Rev Reprod. 3, 104-112 (1998).
  48. Walid, M. S., Osborne, T. J., Robinson, J. S. Primary brain sarcoma or metastatic carcinoma?. Indian J Cancer. 46, 174-175 (2009).
  49. Hue-Beauvais, C., et al. Localisation of caveolin in mammary tissue depends on cell type. Cell Tissue Res. 328, 521-536 (2007).
  50. McManaman, J. L., Neville, M. C. Mammary physiology and milk secretion. Adv Drug Deliv Rev. 55, 629-641 (2003).
  51. Mather, I. H., Jack, L. J. A review of the molecular and cellular biology of butyrophilin, the major protein of bovine milk fat globule membrane. J Dairy Sci. 76, 3832-3850 (1993).
  52. Heid, H. W., Winter, S., Bruder, G., Keenan, T. W., Jarasch, E. D. Butyrophilin, an apical plasma membrane-associated glycoprotein characteristic of lactating mammary glands of diverse species. Biochim Biophys Acta. 728, 228-238 (1983).
  53. Bock, J. B., Klumperman, J., Davanger, S., Scheller, R. H. Syntaxin 6 functions in trans-Golgi network vesicle trafficking. Mol Biol Cell. 8, 1261-1271 (1997).
  54. Tran, T. H., Zeng, Q., Hong, W. VAMP4 cycles from the cell surface to the trans-Golgi network via sorting and recycling endosomes. J Cell Sci. 120, 1028-1041 (2007).
  55. Wendler, F., Page, L., Urbe, S., Tooze, S. A. Homotypic fusion of immature secretory granules during maturation requires syntaxin 6. Mol Biol Cell. 12, 1699-1709 (2001).
  56. Wendler, F., Tooze, S. Syntaxin 6: the promiscuous behaviour of a SNARE protein. Traffic. 2, 606-611 (2001).
  57. Shitara, A., et al. VAMP4 is required to maintain the ribbon structure of the Golgi apparatus. Mol Cell Biochem. 380, 11-21 (2013).
  58. Thibault, C., Levasseur, M. C. . La reproduction chez les mammifères et l'homme. , 928 (2001).
  59. Truchet, S., Wietzerbin, J., Debey, P. Mouse oocytes and preimplantation embryos bear the two sub-units of interferon-gamma receptor. Mol Reprod Dev. 60, 319-330 (2001).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

106immunofluorescence

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved