Immunofluorescence indirecte sur des coupes congelées de glande mammaire de souris

Résumé

Le protocole d'immunofluorescence indirecte décrite dans cet article permet la détection et la localisation de protéines dans la glande mammaire de la souris. Procédé complète est donnée pour préparer des échantillons de la glande mammaire, pour effectuer l'immunohistochimie, l'image de coupes de tissus par microscopie à fluorescence, et de reconstruire des images.

Résumé

L'immunofluorescence indirecte est utilisé pour détecter et localiser des protéines d'intérêt dans un tissu. Le protocole présenté ici décrit un procédé simple et complet pour la détection de protéines immunitaire, la souris glande mammaire en lactation étant pris comme exemple. Un protocole de préparation des échantillons de tissu, en particulier en ce qui concerne la dissection de la glande mammaire de la souris, la fixation du tissu et la coupe de tissu congelé, sont décrites en détail. Un protocole standard pour effectuer immunofluorescence indirecte, y compris une étape de récupération de l'antigène en option, est également présenté. L'observation des coupes de tissus marqués ainsi que l'acquisition de l'image et post-traitements sont également indiqués. Cette procédure donne une vue d'ensemble, à partir de la collection de tissus d'origine animale pour la localisation cellulaire d'une protéine. Bien que ce procédé général peut être appliqué à d'autres échantillons de tissu, elle doit être adaptée à chaque couple d'anticorps de tissu / primaire étudié.

Introduction

La glande mammaire est un organe exocrine mammifère atypique dont la fonction principale est de produire du lait pour nourrir les nouveau-nés. Le développement du tissu mammaire survient principalement après la naissance et se caractérise par un processus unique dans lequel l'épithélium envahit le stroma environnant. Ce tissu subit de nombreux changements (croissance, la différenciation et de régression), en particulier au cours de la vie adulte, de manière concomitante avec des variations dans l'état reproducteur (Figure 1). En plus de la morphologie globale du tissu, les proportions des différents types de cellules, ainsi que leur disposition à l'intérieur de la glande mammaire changer de façon spectaculaire au cours du développement ^5.1.

Au cours de la vie embryonnaire, l'épithélium mammaire dérive de lignes de lait mammaires, qui est défini par un léger épaississement et la stratification de l'ectoderme, entre les parties avant et arrière des membres de chaque côté de la ligne médiane autour jour embryonnaire 10,5 (de E10.5) (Figure 1A ).Sur E11.5, la ligne de lait se décompose en placodes individuels, qui sont positionnés de manière symétrique le long de la ligne de lait mammaire en des emplacements reproductibles, et le mésenchyme environnant commence à se condenser. Les placodes commencent à sombrer plus profondément dans le derme et le mésenchyme mammaire organise en couches concentriques autour du bourgeon mammaire (E12.5-E14.5). Comme de E15.5, l'épithélium mammaire, commence à proliférer et allongé pour former le germe primaire qui pousse à travers le mésenchyme mammaire vers le coussinet adipeux. Le germe primaire développe un lumen creux avec une ouverture sur la peau, caractérisée par la formation de la gaine du mamelon. Sur a 18,5, le conduit allongeant a grandi dans le coussinet de graisse et a ramifié dans un petit système canalaire arborisée englobé dans le coussinet adipeux. Développement est essentiellement arrêté et la glande mammaire reste rudimentaire morphogenetically repos jusqu'à la puberté. Dans l'embryon mâle, l'activation des récepteurs androgènes conduit à la dégénérescence des bourgeons, qui disparaissentpar E15.5. Comme de E18, le développement mammaire cesse jusqu'à la puberté ^6-9.

À la naissance, la glande mammaire abrite un système canalaire rudimentaire qui allonge et les branches lentement (croissance isométrique). Au début de la puberté, les structures sphériques situés aux extrémités des conduits appelés les bourgeons terminaux (TEBS), sont formées d'une couche externe de cellules de la coiffe et une âme interne multicouche de cellules (cellules de l'organisme). Ces structures sont très proliférative et infiltrent le tissu stromal environnante en réponse aux signaux hormonaux. Prolifération dans les résultats TEBS d'allongement canalaire, couplé avec la morphogenèse de ramification. Ce processus conduit à la mise en place d'un réseau arborisée épithéliale de base émanant de la tétine (figure 1B, la puberté). A ~ 10-12 semaines après la naissance, lorsque l'épithélium envahi tout le a coussinet adipeux, son expansion et arrête le TEB disparaître. Le développement de Ductal subit alors des modifications dynamiques, à savoir, successive la prolifération et la régression des cellules épithéliales selon des cycles oestraux ¹⁰ (figure 1B, adultes).

Dès le début de la gestation, le tissu mammaire subit une croissance importante et des changements morphologiques pour se préparer à l'allaitement. L'épithélium mammaire largement proliférer et se différencier, ce qui conduit à un réseau tubulo-alvéolaire hautement ramifié. En même temps, les cellules epitheliales mammaires (CEM) deviennent polarisés et capable de synthétiser et sécréter des produits laitiers. CEM organisent en de nombreuses structures alvéolaires (de acini) qui sont entourés par des cellules myoépithéliales contractiles et incorporés dans un stroma composée de tissus conjonctifs et adipeux, les vaisseaux sanguins et les terminaisons nerveuses (figure 1B, la grossesse). En outre, le côté basal de CEM est en contact étroit avec la membrane basale (de la matrice extracellulaire), et les interactions entre ces deux entités réguler étroitement à la fois fonction de la morphogenèse et sécrétoire de la mamanry épithélium ^11-13.

Tous ces procédés reposent sur l'action de divers signaux de l'environnement, dont les plus importants sont les facteurs paracrines hormones14, et la matrice extracellulaire. Par exemple, la progestérone induit étendue latérale de ramification ¹⁵ et alveologenesis qui, en combinaison avec la prolactine (PRL) ^16,17, favorise et entretient la différenciation des alvéoles. En plus de stéroïdes et PRL18, les cytokines et les voies de signalisation associées au développement (Wnt et Notch voies de signalisation) sont également impliqués dans l'engagement de la lignée mammaire et le développement ^19-21. À la fin de la grossesse, les CEM luminal commencent à produire un lait riche en protéines connu sous le nom de colostrum dans la lumière des alvéoles. En outre, la progestérone agit sur la perméabilité épithéliale et depuis les jonctions serrées sont encore ouverts, le colostrum est également trouvé dans la circulation sanguine maternelle.

Après l'accouchement, la mammarépithélium y occupe la quasi-totalité du volume de la glande mammaire et est hautement organisée (Figure 2, l'épithélium mammaire). Unités productrices de lait, à savoir les alvéoles (Figure 2, alvéole), sont formés par une monocouche de cellules épithéliales mammaires sécrétoires polarisées (de mESCs), avec leur membrane plasmique apicale délimitant la lumière. Alvéoles se disposent en lobules qui sont regroupés en lobes reliés à des conduits qui drainent le lait au milieu extérieur (Figure 2, lobe). Allaitement se produit, ie., MESCs commencent à sécréter des quantités abondantes de lait, déclenchées principalement par la baisse des hormones placentaires (principalement la progestérone) (figure 1B, lactation). Les gènes de protéines de lait sont activés dans un cours à temps temporelle définie allant de la grossesse à l'allaitement ^9,22,23, principalement en réponse à PRL pituitaire publié au moment de la tétée. Parallèlement, les contacts entre mESCs et la matrice extracellulaire de protéines de lait à la fois stimuler Synthesis par des signaux qui sont médiés par les interactions entre les intégrines cellulaires et laminine ^24,25, et suppriment l'apoptose dans mESCs ^26,27. Ces voies de signalisation donnent lieu à l'activation des protéines de lait ^{de 28} promoteurs de gènes par le biais de l'activation de facteurs de transcription spécifique ^29. Contacts cellule-cellule sont également importants pour certains aspects de la différenciation, y compris l'établissement de la polarité apicale et la sécrétion vectoriel de produits laitiers. Jonctions serrées rapidement fermer après le début de la lactation et mESCs orchestrer finement l'absorption de molécules dans le sang ainsi que la synthèse, le transport et la sécrétion des composants du lait, en réponse aux besoins nutritionnels des nouveau-nés. Au moment de la tétée, la contraction des cellules myoépithéliales entourant les alvéoles se produit en réponse à l'ocytocine et conduit à l'éjection du lait à travers les conduits et dans le mamelon. Le lait est un liquide complexe qui contient des protéines (surtoutcaséines), des sucres (lactose principalement), des lipides et des minéraux, ainsi que des molécules bioactives telles que des immunoglobulines A (IgA), des facteurs de croissance et hormones. Les caséines sont synthétisés, assemblés en structures supramoléculaires, à savoir les micelles de caséine, transportés le long de la voie sécrétoire, et ensuite libérés par exocytose, à savoir la fusion des vésicules de sécrétion contenant de la caséine (SV) avec la membrane plasmique apicale des MESC (figure 2).

Trafic intracellulaire repose sur les échanges de matériels entre les compartiments membranaires et implique Soluble N-éthylmaléimide sensible Fusion (NSF) Attachment Protein (SNAP) Receptor (SNARE) ^30,31. La famille des protéines SNARE est subdivisé en SNAREs vésiculaires (v-SNARE), présents dans la membrane des vésicules, et des pièges cibles (t-SNARE), localisés sur les membranes cibles. Par zipping à travers leurs domaines coiled-coil, V- et t-SNARE assemblent pour former un complexe de faisceau à quatre hélices hautement stable, dénommé ecomplexe SNARE e. Ce complexe favorise la fusion de deux bicouches lipidiques opposées en les amenant progressivement à proximité immédiate ^30,32. Ensuite, complexes SNARE sont dissociées par l'adénosine triphosphatase NSF et ses protéine adaptatrice protéines SNAP et le filet, sont recyclés à leur compartiment d'origine ^33. Fait intéressant, chaque protéine SNARE réside principalement dans les compartiments cellulaires distincts et SNARE appariement peut contribuer à la spécificité des événements intracellulaires ³⁴ de fusion. Des études antérieures suggèrent qu'au moins 23 protéines (SNAP23) et associée à la vésicule Membrane Protein 8 (VAMP8), et syntaxins (STX) Synaptosomal associée -7 et -12 jouent un rôle dans la caséine exocytose ^35,36. Ces protéines ont également été trouvés en association avec la fraction lipidique du lait, à savoir, matière grasse du lait globules (MFG) ^37. Le modèle qui prévaut courant postule que les gouttelettes lipidiques cytoplasmiques (CLD) sont formées par l'accumulation de l neutreipids (principalement des triglycérides et des esters de sterol) et cholestérol dérivé de l'alimentation maternelle entre les deux feuillets du réticulum endoplasmique (ER) ^{de 38 à 41} membrane. Pour les CLD sont formées, au moins en partie, par la fusion de petites CLD pendant son transport vers le côté apical de mESCs où ils sont libérés en tant que MFG (1-10 um de diamètre) par bourgeonnement, étant enveloppé par la membrane plasmique apicale des MESC ^40-42. Allaitement cesse après petits sont sevrés et les mESCs meurent progressivement par apoptose, conduisant à la régression du tissu mammaire à un état ​​pubertaire (figure 1B, l'involution).

Immunofluorescence (IF) est une méthode de laboratoire analytique commun utilisé dans presque tous les aspects de la biologie, à la fois dans la recherche et en diagnostic clinique. Si les techniques peuvent être effectuées sur des coupes de tissus (immunohistochimie, IHC) ou cellulaires (immunocytochimie, CPI) échantillons. Cette approche puissante repose sur l'utilisation de fluorescent-des anticorps marqués qui se lient spécifiquement (directement ou indirectement) à l'antigène d'intérêt, permettant ainsi la visualisation de sa distribution dans les tissus par microscopie de fluorescence. Les signaux de fluorescence dépendent principalement de la qualité et la concentration des anticorps et la manipulation de l'échantillon. Un protocole simple immunofluorescence indirecte (IIF) est présenté pour détecter les produits de lait (caséines et MFG) et des protéines impliquées dans la sécrétion de lait produit (butyrophiline (BTN1), caisse claire protéines) sur des sections congelées de tissu mammaire de la souris (Figure 3). Bien que ce protocole fournit un aperçu complet IHC, allant de la collecte de tissus à l'image de post-traitement, critique et des étapes facultatives ainsi que quelques recommandations techniques sont également présentés et discutés.

Protocole

Souris CD1 ont été élevés à l'INRA (UE0907 IERP, Jouy-en-Josas, France). Tous les aspects éthiques du soin des animaux conformes aux lignes directrices et aux exigences d'octroi de licences prévues par le ministère français de l'Agriculture. Les procédures utilisées ont été approuvées par le comité d'éthique local (accord 12/097 du Comethea Jouy-en-Josas / AgroParisTech).

1. glande mammaire Préparation d'échantillons

1. Souris glande mammaire dissection
   1. Euthanasier les souris au jour 10 de la lactation par dislocation cervicale et épingler l'animal vers le bas avec son abdomen vers le haut.
   2. Mouiller la zone ventrale avec de l'éthanol et le sécher avec une serviette en papier.
   3. En utilisant des pinces, tirez la peau abdominale entre les deux pattes de derrière et faire une incision (à travers la peau seulement) d'environ 1 cm avec des ciseaux pointus. A partir de cette première incision, puis utilisez des ciseaux pour couper la peau jusqu'au cou sur la souris. Tirez la peau loin du péritoine et pin sur un côté de la peau à la fois, l'étirant enseigné.
   4. Recueillir les abdominaux et les glandes mammaires inguinales en les poussant loin de la peau avec un tampon et enfin en tirant ou en les coupant du péritoine.
      Remarque: À cette étape Carmine coloration peut être effectuée afin de visualiser l'épithélium mammaire dans le totalité de la glande ^43. Cette approche peut être utile d'analyser la morphologie globale de la glande mammaire dans diverses conditions (traitements physiologiques stades de développement, les maladies, in vivo).
   5. Retirer le ganglion situé à la jonction de l'abdomen et les ganglions inguinaux ^44.
2. Fixation du tissu mammaire
   1. Coupez le tissu mammaire en 3 mm ³ fragments avec un scalpel et rincez immédiatement ces fragments dans un tampon phosphate salin (PBS), pH 7,4, afin d'éliminer autant de lait que possible.
   2. Sécher rapidement les fragments sur un papierserviette et mettez-les dans une solution froide PBS contenant 4% de paraformaldéhyde (PFA, HCHO, 32% de solution de formaldéhyde, ATTENTION) pour 10 à 15 min sur la glace.
      Note: Ceci est assez de temps pour permettre une analyse ultérieure sur des tranches de tissu mammaire par IIF36 et / ou hybridation in situ ^45. Cependant, comme fixateurs aldéhyde pénètrent lentement dans les morceaux de tissus (~ 1-3 mm par heure), ce délai peut être prolongé pour assurer une fixation optimale de l'échantillon de tissu. Alternativement, fixer des tissus in vivo par perfusion un animal anesthésié avec une solution de fixation (non détaillé dans la présente étude).
3. Perfusion de saccharose
   1. Rincer rapidement les fragments mammaires dans du PBS froid et les plonger dans une solution PBS froid contenant 40% de saccharose (D-saccharose, C12H22O11, M. 342,3 g / mol) pendant 16 48 h à 4 ° C sous agitation douce.
4. Intégration tissulaire
   Note: À cette étape, les fragments mammaires peut être re-découpée afin de faire fragments plus petits (2-3 mm ³) Ou pour régler leur forme.
   1. Étiqueter correctement les moules en plastique et de remplir un tiers du volume du moule avec du composé OCT, maintenu à la température ambiante. Placez un fragment (2-3 mm ³⁾ du tissu mammaire par moule et couvrir avec le composé octobre
   2. Placer les moules sur la surface de l'azote liquide (sur une feuille d'aluminium ou en utilisant un tamis métallique) et laisser le produit à congeler.
      Remarque: Il doit devenir solide et blanc avant d'immerger le moule dans de l'azote liquide.
5. Stocker les échantillons congelés à -80 ° C jusqu'à ce que les coupes de tissus sont exécutées.

2. sectionnement de tissu congelé

Remarque: un cryostat, qui est essentiellement un microtome à l'intérieur d'un congélateur, qui est nécessaire pour faire des coupes de tissus congelés. Une température plus basse est souvent nécessaire pour les tissus adipeux ou riches en lipides tels que la glande mammaire vierge.

1. Réglez la température du cryostat à -26 ° C et attendre jusqu'à ce qu'il ait Stabilisée. Maintenir le bloc de tissu congelé à -26 ° C pendant toute la procédure de découpe entière. Absolument éviter la décongélation du tissu à tout moment pendant la procédure.
2. On refroidit la lame de rasoir, le support de coupe, le dispositif anti-roulis et la brosse à -26 ° C en les plaçant dans le cryostat pendant au moins 10 min. Également placer une boîte de glissement à l'intérieur du cryostat afin d'être en mesure de stocker les lames, les sections sont faites.
3. Étiqueter correctement les lames de verre qui seront utilisés pour recueillir les coupes de tissus et de les maintenir à température ambiante; autrement coupes de tissus ne seront pas les respecter. Retirer l'échantillon du moule à l'intérieur du cryostat.
   Note: Utilisation des lames de verre chargées positivement vont grandement favoriser l'adhérence des coupes de tissus congelés frais en raison de l'attraction électrostatique élevé.
4. Couvrez la surface d'un disque de tissu métallique avec le composé OCT (maintenu à RT) et pousser l'échantillon congelé sur elle. Placer le montage humide à l'intérieur du cryostat et laissez-cool pendant au moins 15 min.
5. Placez le montage humide dans le support de disque du cryostat. Réglez l'épaisseur de coupe à 5-6 pm et, si possible, utiliser une nouvelle lame tranchante ou au moins modifier la zone sur la lame utilisée pour couper chaque échantillon, car il certains tissus suffit à émousser rapidement.
6. Ajustez la position du dispositif anti-roulis sur la lame de rasoir en faisant des coupures du milieu de montage jusqu'à ce que les tranches sont formées uniformément et correctement. Idéalement, le dispositif anti-roulis va enjamber la lame de rasoir par environ 1 mm.
7. Une fois que les paramètres sont corrects, effectuer des coupes de tissus en tournant la roue dans un mouvement continu et uniforme. Sauf si la température est idéale, une coupe de tissu sera, par nature, essayer de se recroqueviller.
   1. Utilisez une brosse à saisir et manœuvrer la section sur la scène afin de le placer comme désiré sur la lame de verre. Utilisez la brosse pour nettoyer les restes éventuellement présents sur le bloc de tissu congelé et / ou la lame de rasoir.
8. tirerla coupe de tissu vers l'utilisateur et éviter appuyant sur la scène du cryostat. Evitez d'appuyer sur la coupe de tissu sur la scène de cryostat elle peut conduire à l'adhésion de la tranche de tissu sur la scène et donc l'incapacité de le récupérer avec la lame de verre.
9. Récupérer des coupes de tissus, un par un en les ramassant à la surface d'une lame de verre, en le tenant au-dessus de la section et l'inclinant vers le bas pour toucher la coupe de tissu.
   Remarque: Les coupes de tissus adhèrent rapidement au verre chaud due à l'attraction statique. Si plusieurs sections de tissus sont placés sur la même lame, veiller à ne pas se chevaucher et de les espacer suffisamment pour être en mesure de les joindre individuellement dans un cercle hydrophobe (voir section 3.1.1.).

3. immunofluorescence indirecte

1. Localisation sections
   1. Utilisez un stylo de barrière hydrophobe pour dessiner un cercle autour du tissu hydrophobe coulissant monté. Supposons que le cercle à sec pendant environ 1 min à température ambiante. Tracez une ligne autour de la tsections d'émission avec un marqueur permanent noir bien ainsi, mais sur le côté de la lame de verre opposée à celle où les coupes de tissus sont.
      Remarque: Ce cercle est hydrofuge et acétone et insoluble dans l'alcool. Elle fournit donc un obstacle à des solutions aqueuses utilisées pendant la procédure IHC et réduit le volume des réactifs nécessaires.
   2. Réhydrater les coupes de tissus en les recouvrant d'une baisse de ~ 250 pl de PBS pendant quelques minutes à la température ambiante. Correction des coupes de tissus en les recouvrant d'~ 250 ul d'une solution à 3% de PFA fraîchement préparée dans du PBS pendant 10 à 15 min.
      Remarque: En option dans ce cas, utiliser une solution d'aldéhyde de trempe (chlorure d'ammonium 50 mM (NH _{4 Cl,} M. 53,5 g / mol) dans du PBS ou de glycine 0,1 M (C _{2 H 5 NO} 2, M. 75.07 g / mol) dans du PBS ) pour arrêter la réaction de fixation. Simple et abondante lavage PBS est généralement suffisante pour éliminer l'aldéhyde qui n'a pas réagi.
2. La récupération de l'antigène (facultatif)
   Remarque: Bien que la plupart des antigènes peuvent être détectés sans récupération d'antigène (AR), d'autres seront observées que si cette étape est réalisée. Dans certains cas, AR permet également à l'amélioration du signal observé.
   1. Placer la solution de AR (Tris 100 mM _(C 4 H ₁₁ NO _3, MM 121,14) 5% d'urée (NH _{2 CONH} 2, M. 60,06) pH 9,6) dans un bêcher. Le volume de solution d'AR doit être suffisante pour recouvrir complètement les lames de verre placées dans un support en verre.
   2. Préchauffer la solution de AR à 95 ° C en contrôlant la température avec un thermomètre, puis placer les lames de verre sur un support approprié, immerger la crémaillère dans le tampon à chaud, couverture pour limiter l'évaporation et incuber pendant 10 min à 95 ° C.
   3. Retirer le bécher du bain d'eau et de laisser les lames de verre pendant 10 minutes dans le tampon.
3. Immunodétection
   1. Rincer les sections de tissus avec du PBS (~ 250 pi / section) et les saturer avec une solutionde 3% d'albumine de sérum bovin (BSA, ~ 250 ul / section) dans du PBS pendant au moins 30 min à température ambiante.
   2. Mettre 30 à 50 pi de l'anticorps primaire dilué dans du PBS contenant 2% de BSA dans chaque section de tissu.
      Remarque: Ce volume est suffisant pour former une goutte qui recouvre entièrement la section de tissu.
   3. Placer le même volume de diluant (2% de BSA dans du PBS) seul sur une coupe de tissu pour effectuer un contrôle négatif sans anticorps primaire.
      1. Inclure systématiquement ce témoin négatif dans chaque expérience IHC et effectuer pour chaque anticorps secondaire utilisé pour estimer le fond de l'expérience (marquage non spécifique due à l'anticorps secondaire et / ou le tissu auto-fluorescence). D'autres types de contrôles positifs ou négatifs peuvent également être effectuées pour garantir la spécificité de l'étiquetage (voir la discussion).
   4. Placer les lames de verre dans une boîte humidifiée O / N à 4 ° C.
      Remarque: Les anticorps primaires utilisés étaient monoclonal de souris anti-cytokératine8 (CK8, dilution 1:50), anticorps monoclonal de souris anti-cytokératine 14 (CK14, dilution 1:50), la caséine polyclonaux de lapin anti-souris (# 7781, dilution 1:50, généreusement offert par MC Neville, Université du Colorado Health Sciences Center, CO, USA), polyclonal de lapin anti-BTN1 (dilution 1: 300, généreusement fournis par IH Mather, Département des animaux et aviaires Sciences, Université du Maryland, College Park, MD, USA), polyclonal de lapin anti-STX6 ( dilution 1:50, généreusement offert par S. Tooze, Cancer Research UK, London Research Institute, Londres, Royaume-Uni) et polyclonaux de lapin anti-VAMP4 (dilution 1:50).
   5. Laver soigneusement les coupes de tissus avec du PBS au moins quatre fois pendant 10 min à température ambiante.
   6. Diluer l'anticorps approprié secondaire (chèvre rhodamine conjugué anti-lapin IgG (H + L), dilution 1: 300) dans du PBS contenant 2% de BSA, placer 30 à 50 pl de cette solution sur toutes les sections de tissu, et incuber pendant 1,5 h à la température ambiante.
      1. Depuis fluorochromes sont des molécules sensibles à la lumière, ne pasexposer des coupes de tissus à la lumière jusqu'à ce que leur analyse. Par IIF sur des coupes de tissus, favoriser des anticorps secondaires couplés à un fluorochrome rouge depuis les membranes cellulaires ont tendance à produire une auto-fluorescence verte qui peut interférer avec le bas étiquetage. En outre, le choix d'un anticorps secondaire rouge fluorophore couplé permet l'étiquetage concomitante de lipides neutres (voir ci-dessous).
   7. Laver soigneusement les coupes de tissus avec du PBS au moins quatre fois pendant 10 min à température ambiante.
4. Post-fixation (en option)
   1. Pour certaines expériences, effectuer post-fixation en incubant les échantillons contenant 2% de PFA dilué dans du PBS pendant 10 min à température ambiante, afin de stabiliser les échafaudages antigène / anticorps. Cependant, cette étape peut être omise dans la plupart des cas.
5. Les lipides neutres et de l'ADN contre-coloration
   1. Pour visualiser CLD et MFG, la couleur des lipides neutres en incubant les coupes de tissus dans 30-50 pi d'une solution de PBS contenant 3 ug / ml de BODIPY 493/ 503 pendant 10 min à température ambiante. Rincer rapidement des sections de tissu à deux reprises avec du PBS.
   2. Contre-ADN nucléaire avec 30-50 ul d'une solution de PBS contenant 3 M de DAPI (4-6 diamidino-2-phénylindole, 5 mg / ml solution mère) pendant 10 min à température ambiante. Laver les coupes de tissu avec du PBS avant de deux fois le montage des lames pour l'observation.
6. Section montage
   1. Retirer du PBS et placer une goutte de milieu de montage sur chaque section de tissu.
   2. Placez un côté de la lamelle à un angle contre le tiroir, prendre contact avec le bord extérieur de la goutte de liquide, puis abaissez lentement le capot, éviter les bulles d'air. Laisser le liquide de se répandre entre la lame de verre et la lamelle pendant quelques minutes, puis retirez l'excès de milieu de montage avec une serviette en papier.
   3. Sceller la lamelle à la lame de verre avec des sections vernis à ongles et de tissus de conserver à 4 ° C pour éviter leur exposition à la lumière jusqu'à l'observation.

4. Observation fluorescence et Image Acquisition

Remarque: Un microscope à fluorescence équipé d'une caméra contrôlée par le logiciel d'acquisition d'image est nécessaire pour observer les résultats IHC.

1. Avant l'acquisition d'images, de vérifier l'intensité de l'étiquetage et d'évaluer l'arrière-plan de l'expérience en regardant les contrôles négatifs. Acquérir des photos de chaque marqueur fluorescent (de canal de couleur) individuellement.
2. Acquérir toutes les images, y compris celles des contrôles correspondants, dans les mêmes conditions (exposition et les paramètres généraux) pour chaque canal de couleur.
3. Microscopie conventionnelle
   1. Effectuer microscopie à épifluorescence avec un microscope équipé de filtres standard pour l'isothiocyanate de fluorescéine (FITC, vert), la rhodamine (rouge) et DAPI (bleu) les émissions, × 20 à × 63 (immersion d'huile, NA 1.3) objectifs et une caméra d'imagerie DP50.
4. La microscopie confocale
5. Effectuer la microscopie confocale avec microsadaptation se trouve équipé du logiciel ZEN, en utilisant × 20 × 63 à (immersion d'huile, NA 1.4) et les objectifs 488- et 568-nm excitation longueurs d'onde du laser.

5. Traitement de l'image

Remarque: Toutes les images post-traitements sont effectués en utilisant le logiciel gratuit ImageJ (http://imagej.nih.gov/ij/).

1. Superposer l'image (fusion)
   1. Ouvrez les images acquises dans chaque canal qui sera combinée (Fichier / Ouvrir). Si vous travaillez avec 8 bits images en niveaux de gris, couleur artificielle attribuer à chaque canal en utilisant la table de consultation (tableaux image / Lookup).
   2. Générer l'image composite à partir d'images en niveaux de gris ou de couleur en utilisant la commande «Fusionner les canaux" (Image / Couleur / fusionner des couches), puis attribuer une couleur à chaque canal.
   3. Effectuer l'image empile superposition de la même manière par des empilements acquises dans chaque canal qui sera combinée (Fichier / Ouvrir) ouvrant et en utilisant la commande «Fusionner canaux &# 8221; (Image / Couleur / fusionner des couches) d'attribuer une couleur à chaque canal. Enregistrer la pile composite comme une séquence d'images ou un film (voir section 5.4).
2. Image pile Z projection
   1. Utilisez la fonction Z de projection (Image / Stack / Zproject, Intensité Max) pour fournir une vue en deux dimensions de toutes les images d'une pile d'images en les projetant sur l'axe perpendiculaire au plan de l'image (axe z). L'option "Maximum Intensity" crée une image dans laquelle chaque pixel contient la valeur maximale sur toutes les images de la pile. Cela génère une seule image permettant la visualisation de tous les coloration observée à travers l'ensemble de la pile d'image pour un canal particulier ou après la superposition de plusieurs canaux.
3. Projection d'images 3D de pile
   1. Utilisez la commande de projection 3D (image projet / Stack / 3D, Brightest Point, l'axe Y) pour générer une séquence de projections d'un volume de rotation sur un plan. Le rendu visuel de surfaces et les structures internes dépend à la fois la méthode de projection (le plus proche point, point le plus lumineux (utilisé ici), ou valeur moyenne) et les paramètres de visualisation sélectionnés. Chaque trame de la séquence d'animation est le résultat de la projection à partir d'un angle de vue différent.
   2. Faire pivoter l'image 3D créée autour de chacun des trois axes orthogonaux (l'axe des y a été choisi ici). Enregistrer la séquence produite comme une seule image ou un film.
4. Pile de l'image à la conversion de film
   1. Ouvrez une pile d'images (Fichier / Ouvrir) et l'enregistrer comme un film au format AVI en utilisant la commande "AVI" (Fichier / Enregistrer sous / AVI).

Résultats

La glande mammaire est une glande sous-cutané situé le long de la structure à la fois ventrale du thorax et de l'abdomen chez les rongeurs. L'emplacement des cinq paires de glandes de la souris pendant la gestation est montré dans la figure 4. La morphologie de la glande mammaire change radicalement au cours de son développement, reflétant des modifications fonctionnelles requises pour préparer la lactation complète (figure 1B). Chez les ani...

Discussion

IHC est une méthode expérimentale relativement simple et directe pour localiser l'antigène dans des sections de tissus, qui dépend principalement sur les interactions épitope-anticorps spécifiques. Bien qu'un grand nombre de protocoles sont utilisés pour localiser une protéine par IIF, l'âme de ces procédures est presque toujours le même. Cependant, il ya certains aspects critiques qui peuvent fortement influencer le résultat et doivent donc être optimisés pour chaque étude IHC individu. L'...

matériels

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Ethanol
Scissors
Scalpel and adapted blades
Ice
Towel paper
Tissue sample preparation	Company	Catalog Number	Comments/Description
Phosphate Buffered Saline (pH7.4)	Sigma	P-3813
Paraformaldehyde (PFA, 32% EM grade, 100 ml)	Electron Microscopy Sciences	15714-S	personnal protection equipment required WARNING: this product will expose you to Formaldehyde Gas, a chemical known to cause cancer
OCT compound/Tissue Tek	Sakura	4583
Sucrose (D-saccharose)	VWR	27480.294
Plastic molds	Dominique Dutscher	39910
Liquid nitrogen
Cryostat/sample support	Leica	CM3050S
Razor blades (SEC35)	Thermo Scientific	152200
Slide box
Glass slides Superfrost/Superfrost Ultra Plus	Thermo Scientific	10143560W90/1014356190
Brushes
IHC	Company	Catalog Number	Comments/Description
Super Pap Pen	Sigma	Z377821-1EA
Permanent marker (black)
50 mM NH4Cl in PBS	Sigma	A-0171
0.1 M glycine in PBS	VWR	24403.367
Antigen Retrieval solution: Tris 100 mM 5% urea pH9.6
Heater (up to 100°C)
Bovine Serum Albumin (BSA)	Sigma	A7906-100G
Vectashield (anti-fading mounting medium) without DAPI/with DAPI	Vector Laboratories	H-1000/H-1200
Glass coverslips 22x50mm (microscopy grade)	VWR	CORN2980-225
Nail polish
Primary antibodies	Company	Catalog Number	Comments/Description
Rabbit anti-mouse caseins (#7781; 1:50 dilution)	generously gifted by M.C. Neville (University of Colorado Health Sciences Center, USA)
Mouse anti-cytokeratin 8 (CK8, clone 1E8, 1:50 dilution)	Biolegend (Covance)	MMS-162P
Mouse anti-cytokeratin 14 (CK14, cloneLL002, 1:50 dilution)	Thermo Scientific	MS-115-P0/P1
Rabbit anti-butyrophilin (1:300 dilution)	generously gifted by I.H. Mather (Department of Animal and Avian Sciences University of Maryland College Park, USA)
Rabbit anti-Stx6 (1:50 dilution)	generously gifted S. Tooze (Cancer Research UK, London Research Institute, London, UK)
Rabbit anti-VAMP4 (1:50 dilution)	Abcam	ab3348
Secondary antibodies	Company	Catalog Number	Comments/Description
Rhodamine-conjugated goat anti-rabbit IgG (H + L) (1:300 dilution)	Jackson ImmunoResearch Laboratories	111-025-003
Counterstains	Company	Catalog Number	Comments/Description
Bodipy 493/503	Life Technologies (Molecular Probes)	D-3922
DAPI (4-6-diamidino-2-phenylindole)	Life Technologies (Molecular Probes)	D-1306
Observation/Image capture	Company	Catalog Number	Comments/Description
conventional fluorescence microscope	Leica Leitz DMRB microscope		Standard filters for FITC, Rhodamine and DAPI emissions,                     ×63 oil-immersion objective (NA 1.3), DP50 imaging camera (Olympus), CellˆF software (Olympus)
Laser Scanning Microscope (confocal microscopy)	Zeiss LSM 510 microscope		Plan-Apochromat ×63 oil-immersion objective (NA 1.4),                  CLSM 510 software,               Confocal facilities, MIMA2 Platform, INRA Jouy-en-Josas, France, http://mima2.jouy.inra.fr/mima2)
Image treatment	Company	Catalog Number	Comments/Description
ImageJ 1.49k software			Free software