Immunofluorescenza indiretta su sezioni congelate di mouse ghiandola mammaria

Riepilogo

Il protocollo immunofluorescenza indiretta descritto in questo articolo consente il rilevamento e la localizzazione delle proteine ​​nella ghiandola mammaria del mouse. Un metodo completo è dato per la preparazione di campioni della ghiandola mammaria, per eseguire immunoistochimica, per l'immagine delle sezioni di tessuto al microscopio a fluorescenza, e di ricostruire le immagini.

Abstract

L'immunofluorescenza indiretta è utilizzato per rilevare e localizzare le proteine ​​di interesse in un tessuto. Il protocollo qui presentato descrive un metodo semplice e completo per la rilevazione di proteine ​​immunitario, mouse allattamento ghiandola mammaria essere preso come esempio. Un protocollo per la preparazione dei campioni di tessuto, soprattutto per quanto riguarda la dissezione del mouse di ghiandola mammaria, la fissazione dei tessuti e sezionamento tessuti congelati, sono dettagliati. Un protocollo standard per eseguire immunofluorescenza indiretta, tra cui un passo di recupero dell'antigene opzionale, è anche presentato. L'osservazione delle sezioni di tessuto etichettati così come l'acquisizione di immagini e post-trattamenti sono anche indicati. Questa procedura fornisce una panoramica completa, dalla raccolta di tessuto animale per la localizzazione cellulare di una proteina. Anche se questo metodo generale può essere applicato ad altri campioni di tessuto, deve essere adattato ad ogni coppia anticorpo tessuto / primary studiato.

Introduzione

La ghiandola mammaria è un atipico organo esocrina mammiferi la cui principale funzione è quella di produrre latte per nutrire i neonati. Lo sviluppo del tessuto mammario si verifica soprattutto dopo la nascita ed è caratterizzata da un processo unico in cui l'epitelio invade lo stroma circostante. Questo tessuto subisce molti cambiamenti (crescita, differenziazione e regressione), soprattutto durante la vita adulta, in concomitanza con variazioni di stato riproduttivo (Figura 1). Oltre alla morfologia generale del tessuto, le proporzioni dei vari tipi di cellule, nonché la loro disposizione all'interno della ghiandola mammaria cambiare radicalmente durante lo sviluppo ^1-5.

Durante la vita embrionale, l'epitelio mammario deriva da linee latte mammarie, che è definita da un lieve ispessimento e stratificazione della ectoderma, tra gli arti anteriori e posteriori su ciascun lato della linea mediana intorno al giorno embrionale 10.5 (E10.5) (Figura 1A ).Sulla E11.5, la linea del latte scompone in singoli placodi, simmetricamente posizionati lungo la linea di latte mammaria in posizioni riproducibili, e il mesenchima circostante inizia a condensare. I placodi cominciano ad affondare più in profondità nel derma e mesenchima mammaria organizza a strati concentrici intorno al bocciolo mammaria (E12.5-E14.5). A partire dal E15.5, dell'epitelio mammario, comincia a proliferare e allungare a formare il germoglio principale che spinge attraverso il mesenchima mammaria verso il cuscinetto adiposo. Il germoglio primario sviluppa un lume cavo con un'apertura per la pelle, contrassegnata dalla formazione della guaina capezzolo. Sul E18.5, il condotto di allungamento è diventato il cuscinetto adiposo e si è ramificata in un piccolo sistema duttale arborized inglobato nel cuscinetto adiposo. Lo sviluppo è essenzialmente arrestato e la ghiandola mammaria rudimentale rimane morphogenetically quiescente fino alla pubertà. Nel embrione maschio, l'attivazione dei recettori degli androgeni porta alla degenerazione dei germogli, che scompaionoda E15.5. Come di E18, sviluppo mammario cessa fino alla pubertà ^6-9.

Alla nascita, la ghiandola mammaria ospita un sistema duttale rudimentale che allunga e rami lentamente (una crescita isometrica). All'inizio della pubertà, strutture sferiche situate alle estremità dei condotti chiamati gemme estremità terminale (TEBS), sono formate da uno strato esterno di cellule del cappuccio e un nucleo interno multistrato di cellule (cellule del corpo). Queste strutture sono altamente proliferative e infiltrano il tessuto stromale circostante in risposta a stimoli ormonali. La proliferazione all'interno dei risultati TEBS in allungamento duttale, accoppiato con ramificazione morfogenesi. Questo processo porta alla creazione di una rete arborized epiteliale di base che emana dal capezzolo (Figura 1B, pubertà). A ~ 10-12 settimane dopo la nascita, quando l'epitelio ha invaso tutto il cuscinetto di grasso, la sua espansione si arresta e il TEBS scomparire. Sviluppo duttale subisce quindi cambiamenti dinamici, vale a dire, successive la proliferazione e la regressione delle cellule epiteliali secondo cicli estrali ¹⁰ (Figura 1B, adulti).

Dall'inizio di gestazione, il tessuto mammario subisce importante crescita e cambiamenti morfologici per preparare l'allattamento. L'epitelio mammario ampiamente proliferano e differenziare, portando ad una ramificata rete altamente tubulo-alveolari. Allo stesso tempo, le cellule epiteliali mammarie (MECS) diventano polarizzata e in grado di sintetizzare e secernere prodotti lattiero-caseari. MECs organizzano in numerose strutture alveolari (acini), che sono circondati da cellule mioepiteliali contrattili e incorporati in uno stroma composta da tessuto connettivo e adiposo, vasi sanguigni e terminazioni nervose (Figura 1B, gravidanza). Inoltre, il lato basale MECs è in stretto contatto con la membrana basale (matrice extracellulare) e le interazioni tra queste due entità strettamente regolano sia la funzione morfogenesi e secretoria della mammellary epitelio ^11-13.

Tutti questi processi si basano sull'azione di vari segnali ambientali, di cui i più importanti sono hormones14, fattori paracrini e la matrice extracellulare. Ad esempio, progesterone induce vasta ramificazione laterale ^{15 e} alveologenesis che, in combinazione con prolattina (PRL) ^16,17, promuove e mantiene la differenziazione degli alveoli. Oltre a steroidi e PRL18, citochine e vie di segnalazione associate allo sviluppo (Wnt e Notch vie di segnalazione) sono anche coinvolti nell'impegno lignaggio mammaria e di sviluppo ^19-21. Al termine della gravidanza, i MECs luminali iniziano a produrre un latte ricco di proteina nota come colostro nel lume degli alveoli. Inoltre, il progesterone agisce sulla permeabilità epiteliale e dato che le giunzioni strette sono ancora aperte, il colostro si trova anche nel sangue materno.

Dopo il parto, il Mammary epitelio occupa quasi tutto il volume della ghiandola mammaria e è altamente organizzato (Figura 2, mammario). Unità latte produzione, ovvero alveoli (Figura 2, alveoli), sono formate da un monostrato di polarizzati mammarie epiteliali cellule secretorie (MESCs), con la loro membrana plasmatica apicale delimita il lume. Alveoli si dispongono in lobuli che sono raggruppati in lobi collegati a condotti che drenano il latte con l'ambiente esterno (Figura 2, del lobo). Allattamento si verifica, ad esempio., MESCs iniziano a secernere abbondanti quantità di latte, innescato principalmente dal calo di ormoni della placenta (principalmente progesterone) (Figura 1B, allattamento). Geni delle proteine ​​del latte sono attivati ​​in un corso a tempo temporale definito che va dalla gravidanza al allattamento ^9,22,23, soprattutto in risposta a ipofisaria PRL rilasciato al momento dell'allattamento. Allo stesso tempo, i contatti tra MESCs e la matrice extracellulare, sia stimolano proteine ​​del latte syntESI attraverso i segnali che sono mediati attraverso le interazioni tra integrine e laminina ^24,25 cellulari, e sopprimono l'apoptosi in MESCs ^26,27. Queste vie di segnalazione provocano l'attivazione di proteine ​​del latte gene promoters ²⁸ attraverso l'attivazione della trascrizione specifici fattori di ^29. Contatti cellula-cellula sono importanti anche per alcuni aspetti della differenziazione tra cui l'istituzione della polarità apicale e la secrezione vettoriale di prodotti lattiero-caseari. Giunzioni strette rapidamente stretti dopo l'inizio della lattazione e MESCs finemente orchestrano l'assorbimento di molecole dal sangue così come la sintesi, il trasporto e la secrezione di componenti del latte, in risposta alle esigenze nutrizionali dei neonati. Al momento della suzione, la contrazione delle cellule mioepiteliali circondano gli alveoli si verifica in risposta a ossitocina e porta alla emissione del latte attraverso i condotti e nel capezzolo. Il latte è un liquido che contiene proteine ​​complessa (principalmentecaseine), zuccheri (principalmente lattosio), lipidi e minerali, come pure molecole bioattive come immunoglobuline A (IgA), fattori di crescita e ormoni. Sono sintetizzati caseine, assemblati in strutture supramolecolari, ossia micelle di caseina, trasportate lungo la via secretoria, e poi rilasciato per esocitosi, cioè, la fusione delle vescicole secretorie-caseina contenente (SV) con la membrana plasmatica apicale di MESC (Figura 2).

Traffico intracellulare si basa su scambi materiali tra compartimenti membranose e coinvolge solubile N-ethylmaleimide sensibile Fusion (NSF) Allegato Protein (SNAP) Receptor (SNARE) ^30,31. La famiglia delle proteine ​​SNARE è suddivisa in SNAREs vescicolari (v-lacci), presenti nella membrana della vescicola e SNAREs bersaglio (t-lacci), localizzati sulle membrane di destinazione. Con sfreccia tra loro domini coiled-coil, V e t-SNARE assemblare per formare un complesso altamente stabile fascio quattro elica, indicati come thcomplesso SNARE e. Questo complesso promuove la fusione di due doppi strati lipidici opposti gradualmente portarli in prossimità ^30,32. In seguito, i complessi SNARE sono dissociate dalla adenosina trifosfatasi NSF e le sue proteine ​​adattatore Snap e SNARE proteine ​​sono riciclati di nuovo al loro compartimento di origine ^33. È interessante notare che, ogni proteina SNARE risiede prevalentemente in compartimenti cellulari distinti e rullante accoppiamento possono contribuire alla specificità degli eventi di fusione intracellulari ^34. Precedenti studi suggeriscono che almeno Protein 23 (SNAP23) e vescicole associata a membrana di proteine ​​8 (VAMP8), e sintaxine (Stx) sinaptosomiali associata -7 e -12 svolgono un ruolo nella caseina esocitosi ^35,36. Queste proteine ​​sono state trovate anche in associazione con la frazione lipidica del latte, vale a dire, di grasso del latte (globuli MFGs) ^37. Il modello prevalente corrente postula che gocce lipidiche citoplasmatici (CLD) sono formati dall'accumulo di l neutroipids (soprattutto trigliceridi ed esteri di steroli) e colesterolo deriva dalla dieta materna tra i due volantini del reticolo endoplasmatico (ER) membrane ^38-41. Grandi CLD si formano, almeno in parte, dalla fusione di CLD piccole mentre viene trasportato al lato apicale MESCs dove vengono rilasciati come MFGs (1-10 micron di diametro) per gemmazione, essendo avvolto dalla membrana plasmatica apicale MESC ^40-42. Allattamento cessa dopo cuccioli sono svezzati e le MESCs progressivamente muoiono per apoptosi, che porta alla regressione del tessuto mammario a uno stato puberale (Figura 1B, involuzione).

Immunofluorescenza (IF) è un metodo di laboratorio di analisi comune usato in quasi tutti gli aspetti della biologia, sia nella ricerca e nella diagnostica clinica. SE tecniche possono essere eseguite su sezioni di tessuto (immunoistochimica, IHC) o cellulari (immunocitochimica, ICC) campioni. Questo approccio potente si basa sull'utilizzo di fluorescente-anticorpi marcati che specificamente si legano (direttamente o indirettamente) all'antigene di interesse, permettendo così la visualizzazione della sua distribuzione tissutale tramite microscopia a fluorescenza. Segnali di fluorescenza per lo più dipendono dalla qualità e la concentrazione degli anticorpi e corretta manipolazione del campione. Un protocollo semplice immunofluorescenza indiretta (IIF) viene presentato per rilevare prodotti lattiero-caseari (caseine e MFGs) e proteine ​​coinvolte nella secrezione di prodotti lattiero-caseari (butirofilina (BTN1), rullante proteine) su sezioni congelate di tessuto mammario del mouse (Figura 3). Anche se questo protocollo offre una panoramica completa IHC, che vanno dalla raccolta di tessuto per l'immagine dopo il trattamento, critica e passaggi facoltativi, nonché alcune raccomandazioni tecniche vengono anche presentati e discussi.

Protocollo

Topi CD1 sono stati allevati presso l'INRA (UE0907 IERP, Jouy-en-Josas, Francia). Tutti gli aspetti etici della cura degli animali conformi alle relative linee guida ei requisiti di licenza stabiliti dal Ministero dell'Agricoltura francese. Le procedure utilizzate sono state approvate dal comitato locale di etica (accordo 12/097 dal Comethea Jouy-en-Josas / AgroParisTech).

1. ghiandola mammaria preparazione del campione

1. Mouse ghiandola mammaria dissezione
   1. Euthanize topi al giorno 10 di lattazione per dislocazione cervicale e appuntare l'animale verso il basso con l'addome rivolto verso l'alto.
   2. Bagnare la zona ventrale con etanolo e asciugare con un tovagliolo di carta.
   3. Utilizzando pinze, tirare la pelle addominale tra le due zampe posteriori e fare un'incisione (solo attraverso la pelle) di circa 1 cm con le forbici affilate. A partire da questa prima incisione, quindi utilizzare le forbici per tagliare la pelle fino al collo sul mouse. Tirare la pelle lontano dal peritoneo e pin lungo un lato della pelle alla volta, allungandolo insegnato.
   4. Raccogliere il addominale e le inguinali ghiandole mammarie spingendole dalla pelle con un tampone e infine tirando o tagliando via dal peritoneo.
      Nota: In questo passaggio Carmine colorazione può essere eseguita per visualizzare l'epitelio mammario entro tutta la ghiandola ^43. Questo approccio può essere utile per analizzare la morfologia globale della ghiandola mammaria in varie condizioni fisiologiche (stadi di sviluppo, le malattie, in vivo trattamenti).
   5. Togliere il linfonodo si trova all'incrocio tra la addominale e le ghiandole inguinali ^44.
2. Fissaggio tessuto mammario
   1. Tagliare il tessuto mammario in 3 ^mm 3 frammenti con un bisturi e sciacquare immediatamente questi frammenti in una soluzione salina tampone fosfato (PBS), pH 7,4, al fine di eliminare il più possibile il latte.
   2. Asciugare rapidamente i frammenti su una cartaasciugamano e metterli in una soluzione di PBS freddo contenente 4% paraformaldeide (PFA, HCHO, 32% soluzione di formaldeide, ATTENZIONE) per 10 a 15 minuti in ghiaccio.
      Nota: Questo è il tempo sufficiente per consentire la successiva analisi su sezioni di tessuto mammario da IIF36 e / o ibridazione in situ ^45. Tuttavia, come fissativi aldeidi penetrano piuttosto lentamente a pezzi di tessuto (~ 1-3 mm per ora), questo può essere prorogato per garantire una fissazione ottimale del campione di tessuto. In alternativa, riparare i tessuti in vivo mediante perfusione un animale anestetizzato con una soluzione fissativa (non specificato nel presente studio).
3. Infusione di saccarosio
   1. Sciacquare rapidamente i frammenti mammari in PBS freddo e immergerli in una soluzione PBS freddo contenente 40% di saccarosio (D-saccarosio, C12H22O11, Mr 342,3 g / mol) per 16 a 48 ore a 4 ° C sotto leggero scuotimento.
4. Tissue incorporamento
   Nota: In questo passaggio, frammenti mammaria può essere ri-tagliata per rendere frammenti più piccoli (2-3 mm ³) O per regolare la loro forma.
   1. Correttamente etichettare gli stampi di plastica e riempire un terzo del volume dello stampo con OCT, mantenuta a RT. Mettere un frammento (2-3 mm ³⁾ di tessuto mammario per stampo e coprire con mescola ottobre
   2. Mettere gli stampi sulla superficie del azoto liquido (su un foglio di alluminio o usando un setaccio metallico) e lasciare il prodotto di congelare.
      Nota: Deve diventare solido e bianco prima di immergere lo stampo in azoto liquido.
5. Conservare i campioni congelati a -80 ° C fino a quando vengono eseguite sezioni di tessuto.

2. congelato sezionamento dei tessuti

Nota: Un criostato, che è essenzialmente un microtomo in freezer, è necessario fare sezioni di tessuto congelato. Una temperatura più bassa è spesso richiesto per i tessuti grassi o ricchi di lipidi, come ghiandola mammaria vergine.

1. Regolare la temperatura del criostato a -26 ° C e attendere che si ha stabizato. Mantenere il blocco di tessuto congelato a -26 ° C durante l'intera procedura di sezionamento. Evitare assolutamente scongelamento del tessuto in qualsiasi momento durante la procedura.
2. Raffreddare la lametta, supporto di taglio, il dispositivo anti-rollio ed il pennello a -26 ° C mettendoli in criostato per almeno 10 min. Anche mettere una casella scorrevole all'interno del criostato per essere in grado di memorizzare vetrini delle sezioni sono fatti.
3. Correttamente etichettare i vetrini che verranno utilizzati per raccogliere le sezioni di tessuto e mantenerle a temperatura ambiente; altrimenti sezioni di tessuto non aderirvi. Togliere il campione dalla muffa all'interno del criostato.
   Nota: Utilizzando vetrini con carica positiva notevolmente favorire l'adesione delle sezioni di tessuto congelato fresche a causa della maggiore attrazione elettrostatica.
4. Coprire la superficie di un disco di tessuto metallico con OCT (mantenuta a RT) e spingere il campione congelato su di esso. Posizionare il bagnato montare all'interno del criostato e lasciarlo coolo per almeno 15 minuti.
5. Posizionare il supporto bagnato nel supporto del disco del criostato. Regolare lo spessore del taglio di 5-6 micron e, se possibile, utilizzare un nuovo lama affilata o almeno modificare l'area sulla lama utilizzata per tagliare ogni campione, poiché alcuni tessuti sarà rapidamente noioso.
6. Regolare la posizione del dispositivo anti-rollio sulla lama di rasoio mediante tagli del mezzo di montaggio fino a quando le fette sono formate in modo uniforme e corretto. Idealmente, il dispositivo anti-rollio si scavalcare la lama di rasoio di circa 1 mm.
7. Una volta che le impostazioni siano corrette, eseguire sezioni di tessuto girando la ruota in un movimento continuo uniforme. A meno che la temperatura è ideale, una sezione di tessuto sarà, per sua natura, cerca di rannicchiarsi.
   1. Utilizzare un pennello per afferrare e manovrare la sezione attraverso il palco in modo da mettere come desiderato sul vetrino. Utilizzare la spazzola per pulire i resti eventualmente presenti sul blocco tessuti congelati e / o la lama di rasoio.
8. Tirarela sezione di tessuto verso l'utente ed evitare premendolo sul palco criostato. Evitare di premere la sezione di tessuto sulla scena criostato in quanto può portare alla adesione della fetta del tessuto sulla scena, e quindi l'impossibilità di recuperare con il vetrino.
9. Recupero sezioni di tessuto uno per uno prendendoli alla superficie di un vetrino, tenendolo sopra la sezione e inclinare fino a toccare la sezione di tessuto.
   Nota: Le sezioni di tessuto aderiscano rapidamente al vetro caldo a causa di attrazione statica. Se più sezioni di tessuto sono posti sullo stesso vetrino, fare attenzione a non sovrapporre loro e con lo spazio abbastanza per essere in grado di racchiuderli singolarmente in un cerchio idrofoba (vedi paragrafo 3.1.1.).

3. immunofluorescenza indiretta

1. Individuazione sezioni
   1. Utilizzare una penna barriera idrofobica per disegnare un cerchio intorno al tessuto idrofobico montato-slide. Lasciate che il cerchio asciugare per circa 1 minuti a temperatura ambiente. Tracciare una linea intorno alla temissione sezioni con un pennarello indelebile nero fine così, ma sul lato del vetrino opposto a quello in cui le sezioni di tessuto sono.
      Nota: Questo cerchio è idrorepellente e acetone- e alcool-solubile. Si prevede quindi una barriera alle soluzioni acquose utilizzati durante la procedura IHC e riduce il volume dei reagenti richiesti.
   2. Reidratare sezioni di tessuto coprendoli con una goccia di ~ 250 microlitri di PBS per alcuni minuti a temperatura ambiente. Fissare sezioni di tessuto coprendoli con ~ 250 ml di una soluzione PFA 3% appena preparato in PBS per 10 a 15 minuti.
      Nota: Facoltativamente in questo caso, utilizzare una soluzione di aldeide quenching (cloruro di ammonio 50 mM (NH _{4 Cl,} Mr 53,5 g / mol) in PBS 0,1 M glicina o (C ₂ H _{5 NO} 2, Mr 75,07 g / mol) in PBS ) per arrestare la reazione di fissazione. Semplice e abbondante lavaggio PBS è generalmente sufficiente per eliminare l'aldeide reagito.
2. Recupero antigene (opzionale)
   Nota: Mentre la maggior parte degli antigeni possono essere rilevati senza recupero dell'antigene (AR), gli altri saranno osservati solo se viene eseguito questo passaggio. In alcuni casi, AR consente inoltre il potenziamento del segnale osservato.
   1. Posizionare la soluzione AR (Tris 100 mm _(C 4 H ₁₁ NO _3, il sig 121.14) 5% di urea _(NH 2 CONH _2, il sig 60.06) pH 9.6) in un bicchiere. Il volume di soluzione AR deve essere sufficiente a coprire completamente i vetrini collocato in un supporto di vetro.
   2. Preriscaldare la soluzione AR a 95 ° C controllando la temperatura con un termometro e quindi posizionare i vetrini in un rack adatto, immergere la cremagliera nel buffer caldo, copertura per limitare l'evaporazione e incubare per 10 min a 95 ° C.
   3. Rimuovere il becher dal bagnomaria e lasciare i vetrini per altri 10 min nel buffer.
3. Immunolocalizzazione
   1. Risciacquare sezioni di tessuto con PBS (~ 250 microlitri / sezione) e saturare con una soluzione3% di albumina di siero bovino (BSA, ~ 250 microlitri / sezione) in PBS per almeno 30 minuti a temperatura ambiente.
   2. Mettere 30-50 microlitri di anticorpo primario diluito in PBS contenente 2% BSA in ogni sezione di tessuto.
      Nota: Questo volume è sufficiente per formare una goccia che copre completamente la sezione di tessuto.
   3. Posizionare lo stesso volume di diluente (2% BSA in PBS) da solo su una sezione di tessuto per eseguire un controllo negativo senza anticorpo primario.
      1. Includere sistematicamente questo controllo negativo in ogni esperimento IHC ed eseguire per ciascun anticorpo secondario utilizzato per stimare lo sfondo dell'esperimento (etichettatura non specifica dovuta alla anticorpo secondario e / o il tessuto auto-fluorescenza). Altri tipi di controlli positivi o negativi possono essere eseguite anche per garantire la specificità del etichettatura (vedi la discussione).
   4. Porre i vetrini in una scatola umidificata O / N a 4 ° C.
      Nota: Gli anticorpi primari utilizzati sono stati topo monoclonale anti-citocheratina8 (CK8, diluizione 1:50), mouse monoclonale anti-citocheratina 14 (CK14, diluizione 1:50), policlonale di coniglio caseina anti-topo (# 7781, 1:50 diluizione, generosamente fornito da MC Neville, dell'Università del Colorado Salute Sciences Center, CO, USA), policlonale di coniglio anti-BTN1 (1: 300 di diluizione, generosamente fornito da IH Mather, Dipartimento di Scienze Animali e aviaria, University of Maryland, College Park, MD, USA), policlonale di coniglio anti-Stx6 ( 01:50 diluizione, generosamente fornito da S. Tooze, Cancer Research UK, London Research Institute, Londra, Regno Unito) e policlonale di coniglio anti-VAMP4 (diluizione 1:50).
   5. Lavare accuratamente sezioni di tessuto con PBS almeno quattro volte per 10 minuti a temperatura ambiente.
   6. Diluire l'anticorpo secondario appropriata (IgG anti-coniglio di capra coniugato con rodamina (H + L), 1: 300 diluizione) in PBS contenente 2% BSA, posizionare 30-50 ml di questa soluzione in tutte le sezioni di tessuto, e incubare per 1,5 ore a RT.
      1. Poiché fluorocromi sono molecole sensibili alla luce, non lo fannoesporre sezioni di tessuto alla luce fino alla loro analisi. Per IFI su sezioni di tessuto, favorire anticorpi secondari accoppiati a un fluoroforo rosso da membrane cellulari tendono a generare un auto-fluorescenza verde che possono interferire con basso etichettatura. Inoltre, la scelta di un anticorpo secondario fluoroforo accoppiati rosso permette l'etichettatura concomitante di lipidi neutri (vedi sotto).
   7. Lavare accuratamente le sezioni di tessuto con PBS almeno quattro volte per 10 minuti a temperatura ambiente.
4. Post-fissaggio (opzionale)
   1. Per alcuni esperimenti, eseguire post-fissazione incubando i campioni con 2% PFA diluito in PBS per 10 minuti a RT per stabilizzare i ponteggi antigene / anticorpo. Tuttavia, questo passo può essere soppressa in molti casi.
5. Lipidi neutri e di contrasto del DNA
   1. Per visualizzare CLD e MFGs, colore lipidi neutri incubando sezioni di tessuto in 30-50 ml di una soluzione PBS contenente 3 mg / ml di BODIPY 493/ 503 per 10 minuti a RT. Rapidamente sciacquare sezioni di tessuto due volte con PBS.
   2. Controcolorare DNA nucleare con 30-50 ml di una soluzione di PBS contenente 3 mM di DAPI (4-6-diamidino-2-phenylindole, 5 mg / ml soluzione madre) per 10 minuti a RT. Lavare le sezioni di tessuto due volte con PBS prima del montaggio dei vetrini per l'osservazione.
6. Montaggio Sezione
   1. Rimuovere PBS e una goccia di mezzo di montaggio per ogni sezione di tessuto.
   2. Collocare un lato del vetrino ad un angolo contro la slitta, il contatto con il bordo esterno della goccia liquido e abbassare il coperchio lentamente, evitare bolle d'aria. Lasciare che il liquido per diffondere tra il vetrino e vetrino per alcuni minuti e poi rimuovere l'eccesso di mezzo di montaggio con un tovagliolo di carta.
   3. Sigillare la polizza di copertura al vetrino con le sezioni smalto e del tessuto conservare a 4 ° C per impedire la loro esposizione alla luce fino osservazione.

4. Fluorescenza Osservazione e Image Acquisition

Nota: Un microscopio a fluorescenza dotato di una fotocamera controllato dal software di acquisizione immagini è tenuto ad osservare i risultati IHC.

1. Prima di acquisire immagini, controllare l'intensità della etichettatura e valutare il fondo dell'esperimento, cercando in controlli negativi. Acquisire le immagini di ciascuna etichetta fluorescente (canale di colore) individualmente.
2. Acquisire tutte le immagini, compresi quelli dei controlli corrispondenti, nelle stesse condizioni (esposizione e le impostazioni generali) per ogni canale di colore.
3. Microscopia convenzionale
   1. Eseguire epifluorescenza con un microscopio dotato di filtri standard per isotiocianato di fluorescina (FITC, verde), rodamina (rosso) e DAPI (blu) emissioni, × 20 × 63 (-immersione in olio, NA 1.3) obiettivi e una telecamera ad DP50.
4. Microscopia confocale
5. Eseguire la microscopia confocale con un micropiviale equipaggiata con il software ZEN, utilizzando × 20 × 63 a (-immersione in olio, NA 1.4) gli obiettivi e le 488- e 568 nm di eccitazione lunghezze d'onda del laser.

Trattamento 5. Immagine

Nota: Tutte le immagini post-trattamenti vengono eseguiti utilizzando il software gratuito ImageJ (http://imagej.nih.gov/ij/).

1. Sovrapporre immagine (merge)
   1. Aprire le immagini acquisite in ogni canale che verrà combinato (File / Apri). Se si lavora con 8 bit in scala di grigi, attribuire colore artificiale per ciascun canale utilizzando la tabella di ricerca (tabelle di immagine / di ricerca).
   2. Generare il quadro composito da immagini in scala di grigi o colorati utilizzando il comando "Unisci i canali" (Immagine / colori / Merge Canali) e poi attribuire un colore per ogni canale.
   3. Eseguire immagine pile sovrapposizione nello stesso modo, aprendo pile acquisite in ogni canale che verrà combinato (File / Apri) e utilizzando il comando "Unisci canali &# 8221; (Immagine / colori / Merge Canali) per attribuire un colore per ogni canale. Salvare lo stack composita come una sequenza di immagini o come un film (vedi paragrafo 5.4).
2. Immagine pila Z proiezione
   1. Utilizzare la funzione Z di proiezione (Immagine / Pila / Zproject, intensità massima) per fornire una visione a due dimensioni di tutte le immagini di una serie di immagini da proiettandole lungo l'asse perpendicolare al piano dell'immagine (asse z). L'opzione "Maximum Intensity" crea un'immagine in cui ogni pixel contiene il valore massimo su tutte le immagini della pila. Ciò genera una singola immagine che permette la visualizzazione di tutti i colorazione osservata attraverso l'intera serie di immagini per un particolare canale o dopo la sovrapposizione di più canali.
3. Immagine proiezione abbinata 3D
   1. Utilizzare il comando di proiezione 3D (progetto Immagine / Pila / 3D, più luminoso Point, asse y) per generare una sequenza di proiezioni di un volume rotante su un piano. La resa visiva di surfaces e le strutture interne dipende sia il metodo di proiezione (più vicino punto, punto più luminoso (usato qui), o valore medio-) ed i parametri di visualizzazione selezionati. Ogni frame della sequenza animata è il risultato di sbalzo da un diverso angolo di visualizzazione.
   2. Ruotare l'immagine creata in 3D intorno a ciascuno dei tre assi ortogonali (l'asse y è stato qui selezionato). Salvare la sequenza di prodotto come una singola immagine o un filmato.
4. Serie di immagini per la conversione di film
   1. Aprire una serie di immagini (File / Apri) e salvarlo come un film in formato .AVI utilizzando il comando "AVI" (File / Salva con nome / AVI).

Risultati

La ghiandola mammaria è una ghiandola sottocutanea situato lungo la struttura ventrale sia del torace e dell'addome nei roditori. La posizione dei cinque coppie di ghiandole del mouse durante la gestazione è mostrata in Figura 4. La morfologia della ghiandola mammaria cambia drasticamente durante il suo sviluppo, riflettendo modifiche funzionali richieste per prepararsi alla piena lattazione (Figura 1B). Negli animali vergini o nullipare, la ghiandola...

Discussione

IHC è un metodo relativamente semplice e diretto sperimentale di localizzare l'antigene in sezioni di tessuto, che dipende principalmente sulle specifiche interazioni epitopi-anticorpo. Anche se un gran numero di protocolli sono utilizzati per localizzare una proteina IIF, il nucleo di queste procedure è quasi sempre la stessa. Tuttavia, vi sono alcuni aspetti critici che possono influenzare fortemente il risultato e deve quindi essere ottimizzati per ciascuno studio individuale IHC. L'aspetto più impegnativo...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dissection	Company	Catalog Number	Comments/Description
Pins
Ethanol
Scissors
Scalpel and adapted blades
Ice
Towel paper
Tissue sample preparation	Company	Catalog Number	Comments/Description
Phosphate Buffered Saline (pH7.4)	Sigma	P-3813
Paraformaldehyde (PFA, 32% EM grade, 100 ml)	Electron Microscopy Sciences	15714-S	personnal protection equipment required WARNING: this product will expose you to Formaldehyde Gas, a chemical known to cause cancer
OCT compound/Tissue Tek	Sakura	4583
Sucrose (D-saccharose)	VWR	27480.294
Plastic molds	Dominique Dutscher	39910
Liquid nitrogen
Cryostat/sample support	Leica	CM3050S
Razor blades (SEC35)	Thermo Scientific	152200
Slide box
Glass slides Superfrost/Superfrost Ultra Plus	Thermo Scientific	10143560W90/1014356190
Brushes
IHC	Company	Catalog Number	Comments/Description
Super Pap Pen	Sigma	Z377821-1EA
Permanent marker (black)
50 mM NH4Cl in PBS	Sigma	A-0171
0.1 M glycine in PBS	VWR	24403.367
Antigen Retrieval solution: Tris 100 mM 5% urea pH9.6
Heater (up to 100°C)
Bovine Serum Albumin (BSA)	Sigma	A7906-100G
Vectashield (anti-fading mounting medium) without DAPI/with DAPI	Vector Laboratories	H-1000/H-1200
Glass coverslips 22x50mm (microscopy grade)	VWR	CORN2980-225
Nail polish
Primary antibodies	Company	Catalog Number	Comments/Description
Rabbit anti-mouse caseins (#7781; 1:50 dilution)	generously gifted by M.C. Neville (University of Colorado Health Sciences Center, USA)
Mouse anti-cytokeratin 8 (CK8, clone 1E8, 1:50 dilution)	Biolegend (Covance)	MMS-162P
Mouse anti-cytokeratin 14 (CK14, cloneLL002, 1:50 dilution)	Thermo Scientific	MS-115-P0/P1
Rabbit anti-butyrophilin (1:300 dilution)	generously gifted by I.H. Mather (Department of Animal and Avian Sciences University of Maryland College Park, USA)
Rabbit anti-Stx6 (1:50 dilution)	generously gifted S. Tooze (Cancer Research UK, London Research Institute, London, UK)
Rabbit anti-VAMP4 (1:50 dilution)	Abcam	ab3348
Secondary antibodies	Company	Catalog Number	Comments/Description
Rhodamine-conjugated goat anti-rabbit IgG (H + L) (1:300 dilution)	Jackson ImmunoResearch Laboratories	111-025-003
Counterstains	Company	Catalog Number	Comments/Description
Bodipy 493/503	Life Technologies (Molecular Probes)	D-3922
DAPI (4-6-diamidino-2-phenylindole)	Life Technologies (Molecular Probes)	D-1306
Observation/Image capture	Company	Catalog Number	Comments/Description
conventional fluorescence microscope	Leica Leitz DMRB microscope		Standard filters for FITC, Rhodamine and DAPI emissions,                     ×63 oil-immersion objective (NA 1.3), DP50 imaging camera (Olympus), CellˆF software (Olympus)
Laser Scanning Microscope (confocal microscopy)	Zeiss LSM 510 microscope		Plan-Apochromat ×63 oil-immersion objective (NA 1.4),                  CLSM 510 software,               Confocal facilities, MIMA2 Platform, INRA Jouy-en-Josas, France, http://mima2.jouy.inra.fr/mima2)
Image treatment	Company	Catalog Number	Comments/Description
ImageJ 1.49k software			Free software