Análisis basado en Citometría Imaging- y flujo de Cell posición y el ciclo celular en 3D melanoma esferoides

Resumen

We describe two complementary methods using the fluorescence ubiquitination cell cycle indicator (FUCCI) and image analysis or flow cytometry to identify and isolate cells in the inner G1 arrested and outer proliferating regions of 3D spheroids.

Resumen

Three-dimensional (3D) tumor spheroids are utilized in cancer research as a more accurate model of the in vivo tumor microenvironment, compared to traditional two-dimensional (2D) cell culture. The spheroid model is able to mimic the effects of cell-cell interaction, hypoxia and nutrient deprivation, and drug penetration. One characteristic of this model is the development of a necrotic core, surrounded by a ring of G1 arrested cells, with proliferating cells on the outer layers of the spheroid. Of interest in the cancer field is how different regions of the spheroid respond to drug therapies as well as genetic or environmental manipulation. We describe here the use of the fluorescence ubiquitination cell cycle indicator (FUCCI) system along with cytometry and image analysis using commercial software to characterize the cell cycle status of cells with respect to their position inside melanoma spheroids. These methods may be used to track changes in cell cycle status, gene/protein expression or cell viability in different sub-regions of tumor spheroids over time and under different conditions.

Introducción

Esferoides multicelulares 3D se han conocido como un modelo de tumor durante décadas, sin embargo, es sólo recientemente que han llegado a ser de uso más común a medida un modelo in vitro para muchos cánceres sólidos. Ellos se utilizan cada vez en las pantallas de descubrimiento de fármacos de alto rendimiento como un intermediario entre el complejo, costoso y lento en modelos in vivo y el simple, el modelo de monocapa 2D bajo coste ^6.1. Los estudios realizados en la cultura 2D a menudo no pueden ser replicados en vivo. Modelos Esferoide de muchos tipos de cáncer son capaces de imitar las características de crecimiento, sensibilidad a los fármacos, la penetración del fármaco, las interacciones célula-célula, la disponibilidad restringida de oxígeno y nutrientes y el desarrollo de la necrosis que se observa in vivo en tumores sólidos ^6-11. Esferoides desarrollan un núcleo necrótico, una región de reposo detenido o G1 que rodea el núcleo, y las células que proliferan en la periferia del esferoide ^7. El desarrollo de estas regionespuede variar dependiendo de la densidad celular, la tasa de proliferación y el tamaño del esferoide ^12. Se ha planteado la hipótesis de que la heterogeneidad celular visto en estos diferentes sub-regiones puede contribuir a la resistencia a la terapia del cáncer ^13,14. Por lo tanto la capacidad de analizar las células en estas regiones por separado es crucial para las respuestas de drogas comprensión tumorales.

El sistema indicador de ciclo celular ubiquitinación de fluorescencia (FUCCI) se basa en el rojo (Kusabira Orange - KO) y verde (verde Azami - AG) marcación fluorescente de Cdt1 y geminin, que se degrada en diferentes fases del ciclo celular ^15. Así núcleos celulares aparecen rojos en G1, amarillo a principios de S y verde en S / G2 / M fase. Se describe aquí dos métodos complementarios tanto usando FUCCI para identificar el ciclo celular, junto con el uso de software de formación de imágenes o un flujo de difusión de colorante ensayo de citometría para determinar si las células residen en el centro G1 detenida o el exterior proliferating anillo, y la distancia de las células individuales desde el borde del esferoide. Estos métodos se desarrollaron en nuestra publicación anterior, en el que demostraron que las células de melanoma en regiones hipóxicas en el centro del esferoide o / y en presencia de terapias dirigidas son capaces de permanecer en arresto G1 durante largos períodos de tiempo, y pueden re- entrar en el ciclo celular cuando se presentan condiciones más favorables ^7.

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Protocolo

1. FUCCI Transducción y Cultivo Celular

1. FUCCI transducción
   1. Crear líneas celulares que expresan establemente el FUCCI construye mKO2-hCdt1 (30-120) y MAG-hGem (1-100) ¹⁵ utilizando lentivirus co-transducción de lo descrito previamente ^7.
      Nota: El sistema FUCCI ya está disponible comercialmente.
   2. Generar sub-clones con fluorescencia brillante por la clasificación de una sola célula. Ordenar células individuales positivas tanto para AG y KO (amarillo) por fluorescencia de células activadas por la clasificación en una placa de 96 pocillos como se describió previamente ^7,16.
2. Cultivo de células de melanoma
   1. Células de melanoma humano Cultura C8161 previamente descritos ^7,17.

2. Esferoide Formación 3D (como se describió previamente ^3,9)

1. Preparación de la placa de agarosa
   1. Disolver 1,5% de agarosa (o agar noble) en 100 ml de solución de Hank salina equilibrada (HBSS) o Buffere fosfatod salino (PBS) por ebullición en el microondas durante 3-5 min con agitación. Asegúrese de que la agarosa se haya disuelto completamente.
   2. Inmediatamente prescindir de 100 l de la solución de agarosa por pocillo a una placa de 96 pocillos de cultivo de tejidos de fondo plano usando una pipeta multicanal.
      Nota: La agarosa puede solidificarse en la punta después de un corto período de tiempo, para superar este problema consejos deben ser cambiados entre las placas si toma más de una placa de agarosa.
   3. Deja placa de 96 pocillos sobre una superficie plana para endurecer agarosa durante al menos 1 hr.
2. Preparación de células y superposición en agarosa
   1. Cultivan las células a aproximadamente el 80% de confluencia en un matraz T75. Lavar con 10 ml de HBSS.
   2. Separar las células usando 1,5 ml de 0,05% de tripsina / ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) y resuspender en 10 ml de medio normal.
   3. Contar las células utilizando un hemocitómetro ¹⁸ u otro método de conteo automatizado.
   4. Resuspender las células a una concentración final de 25.000 células / ml en normaal medio.
   5. Superposición de pozos de agarosa con 200 l de la suspensión de células para un número final de 5.000 células por pocillo.
   6. Placas de retorno a la incubadora de cultivo celular (5% de CO ₂ y 37 C) para formar esferoides más de aproximadamente 3 días.
      Nota: El tiempo necesario para formar un esferoide varía entre las diferentes líneas celulares. Algunas líneas de células no forman esferoides utilizando este método en absoluto.
   7. Image morfología esferoidal con un microscopio invertido usando un objetivo 4X y un filtro de contraste de fase. Una línea celular que se forma con éxito esferoides se producen compactos, agregados de células más o menos esféricas, y no debe haber sólo un esferoide por pocillo.
      Nota: Opcional: Una vez esferoides se han formado, se pueden trasplantar en colágeno u otra matriz para su posterior análisis del crecimiento y la invasión ^3,7,17. Para eliminar esferoides a partir de colágeno, se trata con 500 l de 2 mg / ml de colagenasa a 37 ° C hasta que el colágeno se disuelve suficiente para que el spheroids que vienen gratis en los medios de comunicación (aproximadamente 30 minutos). Retire con cuidado esferoides utilizando una pipeta de 1 ml.
   8. Para seccionar / formación de imágenes esferoides FIX (ya sea aisladas a partir de colágeno o cultivados durante 3-5 días en agarosa) en 10% de formalina tamponada neutra (PRECAUCIÓN: La formalina se debe utilizar en una campana de humos) durante al menos 2 horas a temperatura ambiente (RT) , o durante la noche (O / N) a 4 ° C. Esferoides pueden ser almacenados en HBSS a 4 ° C durante varios días.

3. esferoide Vibratome Seccionamiento

1. Disolver 5 g de agarosa de bajo punto de fusión en 100 ml de HBSS en una botella de vidrio de 500 ml en un microondas. Utilice un ajuste fuego medio con turbulencia. PRECAUCIÓN: Mantenga la tapa suelta al hervir la solución para que la presión se puede liberar. Utilice guantes protectores resistentes al calor para protegerse las manos de quemaduras al manipular la botella de vidrio caliente.
2. Espere hasta que la agarosa se enfría un poco - por lo que la botella se puede tocar sin quemarse las manos.
3. Vierta approximamadamente 2 ml de agarosa en el fondo de una taza contador Coulter o molde plástico similar. Aspirar inmediatamente a un esferoide fijo (véase la sección 2.2.8) utilizando una pipeta de 1 ml en el menor volumen de líquido posible. Añadir esferoide a la agarosa. A pocos esferoides (hasta 10) se pueden añadir por taza.
4. Cubrir los esferoides con 2 ml más de agarosa. Haga esto rápidamente para evitar el endurecimiento de agarosa antes de añadir la segunda capa.
5. Permitir que la agarosa se endurezca a temperatura ambiente en la oscuridad durante al menos 3 h. En este punto copas pueden ser almacenados durante un corto tiempo a 4 ° C con 2-3 ml de HBSS cubrió para evitar la deshidratación.
6. Retire agarosa de la copa. Recorte la agarosa que contiene los esferoides de forma que encaje en el bloque de metal vibratome, y esferoides están cerca de la parte superior de la agarosa. Los esferoides pueden ser vistos como pequeños objetos blancos dentro de la agarosa. Super Glue la agarosa al bloque.
7. Llene el vibratome con agua destilada y montar el bloque en el vibratome. Ajuste elvibratome para cortar 100 micras secciones usando baja velocidad (ajuste 2) y alta vibración (ajuste 8). Ajuste el ángulo de la hoja de corte a 16 °. Gire vibratome encendido, encender la luz vibratome y cortar secciones de la parte superior de la agarosa hasta 100 micras secciones esferoide se cortan. Coloque secciones esferoide cortadas en HBSS en una placa de 24 pocillos.
8. Elija secciones centrales para el análisis de imágenes. Mount secciones en las diapositivas mediante la transferencia de la sección plana sobre el portaobjetos con unas pinzas. Llene un cilindro de la jeringa de 10 ml con grasa de vacío; añadir una línea fina de grasa de vacío alrededor de los bordes de la sección con el fin de impedir que los medios de montaje se escurra de los bordes de la diapositiva y ayudar a sellar la sección bajo el cubreobjetos. Cubra la sección con medio de montaje y un cubreobjetos. Selle los bordes del cubreobjetos con esmalte de uñas. Tienda desliza a 4 ° C antes de la imagen.

4. confocal de adquisición de imágenes

1. Tome una imagen z-rebanada de una sección esferoide FUCCI medio usando un 10Xu objetivo 20X a lo descrito previamente ^7. Asegúrese de que no se solapan o diafonía se produce entre el Kusabira Orange2 y Azami Verde. Si la comparación de análisis de imagen entre varias secciones esferoide, mantenga la potencia del láser y otros ajustes de la misma entre las muestras.

5. Hoechst tinte ensayo de difusión para el flujo de Clasificación

1. Transferencia esferoides vivos (3-5 días después de la siembra de agarosa) a un tubo de 15 ml. Deje esferoides gravedad depositan en el fondo del tubo. Varios esferoides pueden teñirse por tubo. Se necesitan aproximadamente 20 esferoides para obtener el número de células suficientes para citometría de flujo.
2. Retire el exceso de medio y agregar 1 ml de 10 mM Hoechst diluidas en medio normal. Incubar esferoides a 37 ° C durante aproximadamente 1 hr. Utilice parpadeo suave para resuspender las esferoides una o dos veces durante la incubación.
   Nota: El tiempo de incubación puede variarse para alterar hasta qué punto el colorante Hoechst penetra en los esferoides. Esto puede variar en funciónel tamaño esferoide, la densidad y la línea celular. Para algunas grandes esferoides / densos puede haber una máxima penetración de tinte que es menor que 100%.
3. Lavar los esferoides suavemente con 5 ml de HBSS utilizando sedimentación por gravedad.
   1. Opcional: Para imágenes de penetración del colorante: Fix esferoides con 10% de formalina tamponada neutra por lo menos durante 2 horas a temperatura ambiente o O / N a 4 ° C. Preparar vibratome secciones, montar en portaobjetos y la imagen en la confocal como se describe en los pasos 3 y 4 anteriores.
4. Para preparar células para la citometría de flujo, trypsinize esferoides con 1 ml de 0,05% de tripsina / EDTA a 37 ° C durante aproximadamente 30 min con parpadeo cada 10 min para romper los esferoides aparte.
   Nota: esferoides son difíciles de conseguir en suspensión de células individuales, pueden necesitar ser optimizado condiciones. Viabilidad de C8161 4 días de edad esferoides después de este proceso es de aproximadamente 95%.
5. Células mancha con un vivo en el infrarrojo cercano / mancha muertos según el protocolo de los fabricantes. Lavar con HBSS luego fijar con 1ml de 10% de formalina tamponada neutra durante aproximadamente 30 min. Las células pueden ser almacenados en HBSS a 4 ° C durante varios días antes del análisis de flujo.

6. Citometría de Flujo Análisis de Hoechst manchadas Fucci esferoides

1. Asegurar que las células no están agrupadas haciéndolas pasar a través de un colador celular. Resuspender el Hoechst manchada esferoides Fucci en hielo frío de lavado FACS (PBS con 5% suero de ternero fetal) a una concentración de 1-5 x 10 ⁶ células / ml. Transferir 200 l de muestra de 5 ml a tubos de fondo redondo.
2. Preparar las siguientes muestras individuales de control de color según se describe en 6.1: las células del melanoma un-manchado; las células del melanoma adherentes se tiñeron con 10 M Hoechst durante 1 hora; Azami verde solamente expresan las células de melanoma; y Kusabira Naranja solamente expresan las células de melanoma.
   Nota: Los controles individuales de color pueden ser fijados en formalina y se almacenan en FACS lavar con 0,1% azida sódica a 4 ° C durante semanas o incluso meses.
3. Suspensiones de células individuales Ejecutar oflujo na citometría analizador con láseres adecuados y de un solo color / controles no teñidas como anteriormente descrito ^7,16.
4. Utilice software de citometría comercial como FlowJo para analizar el interior frente a las células esferoides exteriores de la siguiente manera:
   1. Retire los residuos por gating en la población de células principal de luz dispersada hacia adelante (FSC) vs. Light Side Dispersos (SSC).
   2. Retire dobletes por gating en células individuales utilizando FSC (Zona) vs. FSC (Altura)
   3. Puerta de células vivas por gating en la población de bajos vivo / muerto.
   4. Definir Hoechst pilas de gran, Recinto base a la señal positiva por parte de las células adherentes se tiñeron con Hoechst, como células "exteriores".
   5. Definir las células bajas o negativas Hoechst, cerradas en base a la señal del mando a un-manchado, como células "internos".
   6. Después de compuerta para las poblaciones interiores y exteriores, las células pueden urbanización cerrada más para el rojo FUCCI (G1), amarillo (a principios de S), verde (S / G2 / M) o negativo (a principios de G1).
      Nota: COMPENSACIÓN utilizando los controles de un solo color puede ser necesario para definir adecuadamente las poblaciones de color rojo, amarillo, verde y negativos Fucci.
5. Una vez que el ensayo ha sido optimizado y validado a través de la penetración de Hoechst microscopía confocal, las células funcionar sin la colocación sobre un clasificador de células de flujo como se describió previamente ^7,16 para su posterior análisis de las sub-poblaciones de células en vivo.

Análisis 7. Imagen de FUCCI Esferoide Secciones

1. Software por ejemplo, en Abrir. Volocity, elija la configuración SÓLO cuantificación.
2. Crear una nueva biblioteca. Importe el archivo de imagen confocal FUCCI esferoide en el software arrastrando el archivo de datos brutos de la confocal en la biblioteca. También puede utilizar el comando Archivo> Importar.
3. Ve a la pestaña mediciones para construir un protocolo de análisis de imágenes. El Protocolo se construye arrastrando y soltando los comandos apropiados en el orden correcto de la siguiente en la ventana de protocolo.
4. Encuentra objeja en el canal verde: Arrastre el hallazgo de comandos (que se encuentra en 'Buscando') en la ventana del protocolo de objetos, seleccione el canal correcto en los objetos hallazgo protocol.Add un comando abierto (que se encuentra en el «tratamiento»), entonces A tocar objetos separados comando (que se encuentra en 'Procesamiento' - esto separar las células). Excluir objetos por tamaño <50 micras (que se encuentra en el 'filtrado' - esto va a excluir a los pequeños objetos no celulares).
   Nota: Variables como el umbral de encontrar objetos, el número de iteraciones abiertos, el tamaño de los objetos a separar y el tamaño de los objetos para excluir debe ser optimizado manualmente hasta que las máscaras de objeto coincide con la imagen.
5. Encuentra objetos en el canal rojo: Repetir encontrar los objetos que el anterior para el canal rojo. Protocolos verdes y rojas pueden necesitar ser ajustados por separado.
   Nota: Debido a los núcleos estar en G2, núcleos verdes son a menudo ligeramente más grande.
6. Confirme objetos encontrados son exactos Confirmar rojo y objetos verdes coinciden con elnúcleos rojos y verdes en la imagen apagando y en los canales verde y rojo (con la piel o mostrar comandos canal) mientras muestra las máscaras rojas y verdes que se encuentran por el protocolo. Opciones de comentarios (Medidas> Opciones de comentarios) se pueden utilizar para modificar el aspecto de las máscaras de objetos.
7. Encuentra objetos amarillos (células en fase S temprana): Para encontrar celdas amarillas, añadir una intersección rojo con células verdes de comandos (que se encuentra en "Combinar"). Excluir objetos por tamaño (<50 micras, que se encuentran en 'filtrado') para excluir a los pequeños objetos no celulares.
8. Encuentra objetos exclusivamente rojos (células en fase G1): Para encontrar núcleos exclusivamente rojos, restar las celdas amarillas de los glóbulos rojos (que se encuentran en el 'Combinando'). Excluir objetos por tamaño <50 m, (que se encuentra en el 'filtrado') para eliminar cualquier objeto pequeño no celulares creadas.
9. Encuentra objetos exclusivamente verdes (células en fase S / G2 / M): Repita el procedimiento para el canal verde para encontrar exclusivamente verde.
   Note: Si todavía hay objetos no celulares restantes, un comando población filtro puede ser añadido a los protocolos de rojo, verde o exclusivos exclusivos (que se encuentran en 'Filtrado') para retener sólo los objetos con un factor de forma mayor que 0,25. Esto eliminará los objetos no circulares.
10. Encuentra el contorno esferoide: Encuentra el contorno esferoide utilizando un hallazgo de comandos (que se encuentra en 'Buscando') con el canal verde o rojo (el que tiene más células alrededor del borde del esferoide) objetos. Un umbral mucho más bajo (que se encuentra en el hallazgo de objetos de variables) tendrá que ser utilizado para determinar el contorno esferoide comparación con las células individuales.
    1. Utilice un comando cerca de unirse a objetos (que se encuentran en «tratamiento»), luego rellenar agujeros en objetos (que se encuentran en «tratamiento»), a continuación, utilizar un filtro fino (que se encuentra en el 'filtrado') para eliminar el ruido de los objetos. Finalmente, excluir objetos por tamaño para eliminar los objetos más pequeños <30,000 m (dependiendo del tamaño esferoide).
       Nota: Tendrá que ser optimizado manualmente hasta que el contorno esferoide es exacta Este protocolo. Una imagen de campo claro también se puede utilizar - sin embargo esto es generalmente menos preciso con una sección esferoide, y un comando invertido (que se encuentra en 'combinación') tendrá que ser utilizado.
11. Mida las distancias de los núcleos de contorno esferoide: Medir distancias (que se encuentra en 'relativa') de las poblaciones de color amarillo, verde y exclusivamente exclusivamente rojos desde el centroide celular hasta el borde del esferoide outline.To visualizar las distancias mínimas, que debe ser de la celular al borde esferoide más cercano, encender muestran distancias en la pestaña de relaciones en las opciones de retroalimentación (Medidas> Opciones> Relaciones de votos).
12. Guarde el protocolo. Este protocolo se puede volver a aplicar a otras imágenes mediante las mediciones> Restaurar comando de protocolo.
13. Crear un elemento de medición (Medidas> Crear Medición de artículos). Los datos pueden ser analizados mediante el análisisfunciones.
    1. Ir a la ficha de análisis en el tema mediciones. Ir al menú Analysis (Análisis> Analizar) y analizar la distancia mínima desde el centroide celular (rojo, verde o amarillo) al borde esferoide, resumida por el conde y organizada por la población.
    2. Para contar el número de células que se encuentran a una cierta distancia desde el borde crear un filtro (Análisis> Filter). El filtro para la distancia mínima en la Figura 2 se basa en la penetración de Hoechst (por ejemplo, la distancia mínima es de menos de 80 da la población "externa"). Por otra parte, la exportación de datos en bruto a una hoja de cálculo para su posterior análisis.

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Resultados

Hay varios métodos de producción de esferoides tumorales, este protocolo utiliza el método de crecimiento no adherente, donde las células se cultivan en agar o agarosa ^3,7,9. La figura 1 muestra un ejemplo de un esferoide melanoma C8161 después de 3 días en agar. Esferoides C8161 forman esferoides de tamaño regular con un diámetro de 500 a 600 m (media = 565, SD = 19, n = 3) después de 3 días. Otras líneas celulares de melanoma que formarán esferoides incluyen: WM793, WM983C, WM98...

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Discusión

Análisis de imágenes semi-automatizado identifica la región G1 arrestado interior esferoide, y la proliferación de las capas exteriores. Este método puede ser utilizado en esferoides en vivo usando una sección óptica, o en secciones esferoide fijos, para identificar los cambios en no sólo el ciclo celular, pero la expresión del marcador (a través de inmunofluorescencia), la muerte celular, o la morfología celular en estas diferentes regiones. Motilidad celular dentro de las diferentes regiones esferoide tambi...

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Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Hoechst 33342	Life Technologies	H3570
agarose low melting point	Life Technologies	16520-050	For sectioning
noble agar	Sigma	A5431	For making spheroids
agarose for spheroids	Fisher Scientific	BP1356-100	For making spheroids
0.05% trypsin/EDTA	Life Technologies	25300-054
HBSS	Life Technologies	14175-103
10% formalin	Sigma	HT5014-1CS	CAUTION: Harmful, corrosive. Use Personal Protective Equipment, do  not breath fumes (open in a fume cupboard).
live/dead near IR	Life Technologies	L10119
vibratome	Technical Products International, Inc
coulture cup	Thermo-Fisher Scientific	SIE936	Mold for sectioning spheroids
hemocytometer	Sigma	Z359629
96-well tissue culture plate	Invitro	FAL353072
collagenase	Sigma	C5138
confocal microscope	Leica	TCS SP5
Flow cytometer analyser	Becton Dickinson	LSRFortessa
volocity	PerkinElmer		Imaging software
flowjo	Tree Star		Flow cytometry software
Vaccuum grease	Sigma	Z273554
Mounting media	Vector Laboratories	H1000
FUCCI (commercial constructs)	Life Technologies	P36238	Transient transfection only
Cell strainer 70 μm	In Vitro	FAL352350
Round bottom 5 ml tubes (sterile)	In Vitro	FAL352003
Round bottom 5 ml tubes (non-sterile)	In Vitro	FAL352008