Analisi basata su Citometria Imaging- e di flusso della posizione cellulare e ciclo cellulare in 3D Melanoma Spheroids

Riepilogo

We describe two complementary methods using the fluorescence ubiquitination cell cycle indicator (FUCCI) and image analysis or flow cytometry to identify and isolate cells in the inner G1 arrested and outer proliferating regions of 3D spheroids.

Abstract

Three-dimensional (3D) tumor spheroids are utilized in cancer research as a more accurate model of the in vivo tumor microenvironment, compared to traditional two-dimensional (2D) cell culture. The spheroid model is able to mimic the effects of cell-cell interaction, hypoxia and nutrient deprivation, and drug penetration. One characteristic of this model is the development of a necrotic core, surrounded by a ring of G1 arrested cells, with proliferating cells on the outer layers of the spheroid. Of interest in the cancer field is how different regions of the spheroid respond to drug therapies as well as genetic or environmental manipulation. We describe here the use of the fluorescence ubiquitination cell cycle indicator (FUCCI) system along with cytometry and image analysis using commercial software to characterize the cell cycle status of cells with respect to their position inside melanoma spheroids. These methods may be used to track changes in cell cycle status, gene/protein expression or cell viability in different sub-regions of tumor spheroids over time and under different conditions.

Introduzione

Sferoidi multicellulare 3D sono stati conosciuti come un modello di tumore per decenni, ma è solo di recente che sono venuti in uso più comune come un modello in vitro per molti tumori solidi. Essi sono sempre più utilizzati in high-throughput schermi scoperta di nuovi farmaci come intermedio tra complessi, costosi e in modelli in vivo che richiede tempo e il semplice, il modello 2D monostrato basso costo ^1-6. Gli studi in coltura 2D sono spesso incapaci di replicare in vivo. Modelli sferoidali di molti tipi di cancro sono in grado di imitare le caratteristiche di crescita, la sensibilità ai farmaci, di penetrazione della droga, interazioni cellula-cellula, disponibilità limitata di ossigeno e nutrienti e lo sviluppo di necrosi che si vede in vivo nei tumori solidi ^6-11. Spheroids sviluppano un nucleo necrotico, una regione arrestato quiescente o G1 che circonda il nucleo, e le cellule proliferanti alla periferia dello sferoide ^7. Lo sviluppo di queste regionipuò variare a seconda della densità cellulare, tasso di proliferazione e la dimensione dello sferoide ^12. E 'stato ipotizzato che l'eterogeneità cellulare visto in queste diverse sotto-regioni può contribuire a cancro resistenza alla terapia ^13,14. Pertanto, la capacità di analizzare le cellule in queste regioni è parte fondamentale per la comprensione risposta ai farmaci tumorali.

Il sistema di indicatori del ciclo cellulare fluorescenza ubiquitination (FUCCI) si basa sul rosso (Kusabira Orange - KO) e verde (Azami verde - AG) il tagging fluorescente CDT1 e Geminin, che vengono degradati nelle diverse fasi del ciclo cellulare ^15. Così nuclei delle cellule appaiono di colore rosso in G1, gialli in S e verde in S / G2 / M di fase. Descriviamo qui due metodi complementari sia con FUCCI per identificare il ciclo cellulare, insieme con l'uso di software di imaging o di un flusso di colorante diffusione citometria test per determinare se le cellule risiedono nel centro G1 arrestato o proliferatin esternog anello, e la distanza delle singole cellule dal bordo dello sferoide. Questi metodi sono stati sviluppati nella nostra pubblicazione precedente, dove abbiamo dimostrato che le cellule di melanoma nelle regioni ipossiche nel centro dello sferoide e / o in presenza di terapie mirate sono in grado di rimanere in G1 arresto per lunghi periodi di tempo, e può ri- entrare nel ciclo cellulare in cui condizioni più favorevoli emergono ^7.

Protocollo

1. FUCCI trasduzione e colture cellulari

1. FUCCI trasduzione
   1. Creare linee cellulari che esprimono stabilmente la FUCCI costruisce mKO2-hCdt1 (30-120) e MAG-hGem (1-100) ^{15 usando} lentivirus co-trasduzione come descritto in precedenza ^7.
      Nota: il sistema FUCCI è ora disponibile in commercio.
   2. Generare sub-cloni con fluorescenza mediante selezione singola cellula. Ordina cellule singole positive sia per AG e KO (giallo) per la fluorescenza delle cellule attivate l'ordinamento in una piastra a 96 pozzetti come in precedenza descritto ^7,16.
2. Coltura cellulare Melanoma
   1. Cellule di melanoma umano Cultura C8161 come precedentemente descritto ^7,17.

2. 3D Spheroid Formazione (come descritto in precedenza ^3,9)

1. Piatto preparazione Agarosio
   1. Sciogliere 1,5% agarosio (o nobile agar) in 100 ml di soluzione di Hank salina bilanciata (HBSS) o Buffere fosfatod (PBS), facendo bollire nel microonde per 3-5 minuti, rimestando. Assicurarsi che l'agarosio sia completamente dissolto.
   2. Immediatamente dispensare 100 microlitri della soluzione di agarosio per bene ad una piastra a 96 pozzetti di coltura tissutale a fondo piatto con una pipetta multicanale.
      Nota: Agarosio può solidificare nelle punte dopo un breve periodo di tempo, per superare questo consigli problema deve essere cambiato tra piastre se effettuare più di una piastra di agarosio.
   3. Lasciare piastra a 96 pozzetti su una superficie piana per indurire agarosio per almeno 1 ora.
2. La preparazione delle cellule e di sovrapposizione su agarosio
   1. Crescere le cellule a circa l'80% di confluenza in un pallone T75. Lavare con 10 ml di HBSS.
   2. Staccare le cellule con 1,5 ml di 0,05% tripsina / acido etilendiamminotetraacetico (EDTA) e risospendere in 10 ml di terreno normale.
   3. Contare le cellule utilizzando un emocitometro ¹⁸ o un altro metodo di conteggio automatizzato.
   4. Risospendere le cellule a una concentrazione finale di 25.000 cellule / ml a normaal medio.
   5. Overlay pozzi agarosio con 200 microlitri della sospensione cellulare per un numero finale di 5000 cellule per pozzetto.
   6. Piastre ritorno alla incubatore di coltura cellulare (5% di CO ₂ e 37 ° C) per formare sferoidi oltre circa 3 giorni.
      Nota: Il tempo impiegato per formare uno sferoide varia tra diverse linee cellulari. Alcune linee cellulari non formano sferoidi utilizzando questo metodo a tutti.
   7. Immagine sferoide morfologia con un microscopio invertito con obiettivo 4X e un filtro a contrasto di fase. Una linea di cellule che si forma con successo sferoidi produrranno compatti, aggregati di cellule più o meno sferiche, e non ci dovrebbero essere solo uno sferoide per pozzetto.
      Nota: Opzionale: Una volta sferoidi si sono formate, possono essere trapiantate in collagene o altro matrice per ulteriori analisi di crescita e l'invasione ^3,7,17. Per rimuovere sferoidi da collagene, trattare con 500 ml di 2 mg / ml di collagenasi a 37 ° C fino a quando il collagene è sciolto abbastanza per il spherOID di entrare gratis nei media (circa 30 minuti). Rimuovere delicatamente sferoidi con una pipetta 1 ml.
   8. Per il sezionamento / immagini sferoidi fix (o isolati da collagene o coltivate per 3-5 giorni in agarosio) nel 10% formalina tamponata neutra (ATTENZIONE: formalina deve essere usato sotto cappa) per almeno 2 ore a temperatura ambiente (RT) , o per una notte (O / N) a 4 ° C. Sferoidi possono essere conservati in HBSS a 4 ° C per diversi giorni.

3. Spheroid Vibratome sezionamento

1. Sciogliere 5 g di agarosio a basso punto di fusione in 100 ml di HBSS in una bottiglia di vetro da 500 ml in un forno a microonde. Utilizzare un calore medio, rimestando. ATTENZIONE: Tenere il coperchio sciolto quando bolle la soluzione in modo che la pressione può essere rilasciata. Usare guanti protettivi resistenti al calore per proteggere le mani da ustioni quando si maneggia la bottiglia di vetro caldo.
2. Attendere che l'agarosio si raffredda un po '- quindi la bottiglia può essere toccato senza bruciare le mani.
3. Pour approssiTely 2 ml di agarosio nella parte inferiore di un contatore Coulter tazza o simile plastica stampo. Aspirare immediatamente un sferoide fisso (vedi paragrafo 2.2.8) con una pipetta 1 ml nel più piccolo volume di liquido possibile. Aggiungere sferoide alla agarosio. Alcuni sferoidi (fino a 10) possono essere aggiunti per tazza.
4. Coprire i sferoidi con 2 ml più agarosio. Fare questo rapidamente per evitare l'indurimento agarosio prima di aggiungere il secondo strato.
5. Lasciare che il agarosio indurire a temperatura ambiente al buio per almeno 3 ore. A questo punto tazze possono essere conservati per un breve periodo a 4 ° C con 2-3 ml di HBSS sovrapposti per evitare la disidratazione.
6. Rimuovere agarosio dalla tazza. Tagliare l'agarosio contenente sferoidi modo che si inserisca sul blocco di metallo vibratome, e sferoidi sono vicino alla parte superiore della agarosio. Sferoidi possono essere visti come piccoli oggetti bianchi dentro il agarosio. Super Glue l'agarosio al blocco.
7. Riempire il vibratome con acqua distillata e montare il blocco nel vibratome. Impostare ilvibratome per tagliare 100 micron sezioni utilizzando bassa velocità (impostazione 2) e ad alta vibrazione (impostazione 8). Impostare l'angolo lama di taglio a 16 °. Accendere vibratome su, accendere la luce vibratomo e tagliare sezioni dalla cima della agarosio fino a 100 micron sezioni sferoidali sono tagliati. Posizionare tagliate sezioni sferoidali in HBSS in una piastra da 24 pozzetti.
8. Scegli sezioni centrali per l'analisi delle immagini. Montare sezioni su vetrini mediante il trasferimento della sezione piatta sul vetrino con una pinzetta. Riempire una siringa da 10 ml con grasso per vuoto; aggiungere una linea sottile di grasso per vuoto intorno ai bordi della sezione per evitare che il supporto di montaggio di scappare bordi della diapositiva e contribuire a sigillare la sezione sotto il coprioggetto. Coprire la sezione con mezzo di montaggio e un vetrino. Sigillare i bordi del coprioggetto con smalto. Conservare scivola a 4 ° C prima di imaging.

4. confocale Image Acquisition

1. Prendete una immagine z fetta di una sezione centrale sferoide FUCCI utilizzando un 10Xo obiettivo 20X come descritto in precedenza ^7. Assicurarsi che non si sovrappongono o diafonia si verifica tra il Kusabira Orange2 e Azami Verde. Se si confrontano analisi delle immagini tra più sezioni sferoidali, mantenere potenza del laser e altre impostazioni dello stesso tra i campioni.

5. Hoechst Dye Diffusion Assay for Flow Ordinamento

1. Trasferire sferoidi vivi (3-5 giorni dopo la semina agarosio) ad un tubo da 15 ml. Sia sferoidi gravità si depositano sul fondo della provetta. Diversi sferoidi possono essere colorati per provetta. Circa 20 sferoidi sono necessari per ottenere il numero di cellule sufficiente per citometria a flusso.
2. Rimuovere eccesso di terreno e aggiungere 1 ml di 10 micron Hoechst diluiti in mezzo normale. Incubare sferoidi a 37 ° C per circa 1 ora. Utilizzare dolce rapido passaggio per risospendere sferoidi una o due volte durante l'incubazione.
   Nota: Il tempo di incubazione può essere variata di modificare fino a che punto il colorante Hoechst penetra nei sferoidi. Questo varia in basela dimensione sferoide, densità e linea cellulare. Per alcuni grandi / sferoidi densi ci può essere una massima penetrazione colorante che è inferiore al 100%.
3. Lavare i sferoidi delicatamente con 5 ml di HBSS con gravità sedimentazione.
   1. Opzionale: Per l'imaging di penetrazione del colorante: Fix sferoidi con il 10% formalina tamponata neutra per almeno 2 ore a temperatura ambiente o O / N a 4 ° C. Preparare vibratome sezioni, montare sulle diapositive e immagini sul confocale come descritto ai punti 3 e 4 di cui sopra.
4. Per preparare le cellule per citometria a flusso, trypsinize sferoidi con 1 ml di 0,05% tripsina / EDTA a 37 ° C per circa 30 minuti con sfogliando ogni 10 min per rompere sferoidi parte.
   Nota: Spheroids sono difficili da ottenere in sospensione singola cella, le condizioni possono avere bisogno di essere ottimizzato. Viabilità di C8161 4 giorni di età sferoidi dopo questo processo è di circa il 95%.
5. Cellule macchia con un live nel vicino infrarosso / macchia morti secondo il protocollo produttori. Lavare con HBSS quindi fissare con 1ml di 10% formalina tamponata neutra per circa 30 min. Le cellule possono essere conservate in HBSS a 4 ° C per diversi giorni prima analisi del flusso.

6. Citometria a flusso Analisi di Hoechst Stained Fucci Spheroids

1. Assicurarsi che le cellule non sono raggruppate insieme facendoli passare attraverso un colino cella. Risospendere il Hoechst macchiato sferoidi Fucci in ghiaccio freddo FACS lavaggio (PBS con 5% Fetal Calf Serum) ad una concentrazione di 1-5 x 10 ⁶ cellule / ml. Trasferire 200 ml di campione in 5 ml provette rotonde di fondo.
2. Preparare i seguenti singoli campioni di controllo del colore, come indicato al paragrafo 6.1: cellule di melanoma non-macchiato; cellule di melanoma aderenti colorate con 10 mM Hoechst per 1 ora; Azami verde solo esprimendo cellule di melanoma; e Kusabira arancione solo esprimendo cellule di melanoma.
   Nota: controlli monocromatici possono essere fissati in formalina e conservati in FACS lavare con 0,1% sodio azide a 4 ° C per settimane o mesi.
3. Sospensioni di cellule singole o Runna citometria a flusso analizzatore con i laser appropriati e singolo colore / controlli non colorati come descritto in precedenza ^7,16.
4. Utilizzare il software citometria commerciale come FlowJo per analizzare l'interno contro cellule sferoidali esterne come segue:
   1. Rimuovere i detriti dal gating sulla popolazione di cellule principale in Light Forward Scattered (FSC) vs. Luce sparsi laterale (SSC).
   2. Rimuovere doppiette da gating su singole cellule utilizzando FSC (Regione) vs. FSC (altezza)
   3. Porta per le cellule dal vivo di gating sulla popolazione dal vivo / morto basso.
   4. Definire Hoechst cellule di alta gated, in base al segnale positivo dalle cellule aderenti colorate con Hoechst, come cellule "esterni".
   5. Definire Hoechst cellule bassi o negativi, gated sulla base del segnale dal controllo non-tinto, come cellule "interni".
   6. Dopo gating per le popolazioni interne ed esterne, le cellule possono essere ulteriormente gated per FUCCI rosso (G1), giallo (inizio S), verde (S / G2 / M) o negativo (G1 precoce).
      Nota: Cn aiuto compensativo utilizzando i comandi a singolo colore può essere richiesto di definire in modo adeguato le popolazioni rosso, giallo, verde e negativi Fucci.
5. Una volta che il test è stato ottimizzato e la penetrazione Hoechst convalidato tramite microscopia confocale, eseguire cellule senza fissaggio su un cell sorter di flusso come descritto in precedenza ^7,16 per ulteriori analisi di cellule vive sotto-popolazioni.

Analisi 7. Immagine di FUCCI sferoide Sezioni

1. Aprire il software ad es. Volocity, scegliere l'unica configurazione quantificazione.
2. Creare una nuova libreria. Importare il FUCCI sferoide file immagine confocale nel software trascinando il file di dati grezzi dal confocale nella libreria. In alternativa, utilizzare il comando File> Importa.
3. Vai alla scheda misure per costruire un protocollo di analisi delle immagini. Il protocollo è costruito trascinando i comandi appropriati nell'ordine corretto come segue nella finestra del protocollo.
4. Trova objette nel canale verde: Trascinare il comando (che si trova in 'Finding') nella finestra del protocollo il ritrovamento di oggetti, selezionare il canale corretto negli oggetti find protocol.Add un comando di apertura (che si trova in 'Processing'), poi un toccare oggetti separati il comando (che si trova in 'trattamento' - questo sarà separare le cellule). Escludere gli oggetti di dimensioni <50 micron (che si trova in 'filtraggio' - questo esclude piccoli oggetti non cellulari).
   Nota: Le variabili quali oggetti il ​​ritrovamento di soglia, il numero di iterazioni aperte, le dimensioni degli oggetti da separare e le dimensioni degli oggetti da escludere deve essere ottimizzata manualmente fino maschere oggetto corrispondenza dell'immagine.
5. Trova gli oggetti nel canale rosso: Ripetere trovare oggetti come sopra per il canale rosso. Potrebbe essere necessario modificare separatamente protocolli verde e rosso.
   Nota: A causa di nuclei essere in G2, nuclei verdi sono spesso leggermente più grandi.
6. Confermare oggetti ritrovati sono accurate Confermare rosso e oggetti verdi corrispondono allanuclei rosso e verde nell'immagine spegnendo e sui canali verde e rosso (con la pelle o mostrare comando canale) durante la visualizzazione delle maschere rosso e verde, trovate da protocollo. Le opzioni di retroazione (Misurazioni> opzioni di retroazione) possono essere utilizzati per modificare l'aspetto delle maschere oggetto.
7. Trova gli oggetti gialli (cellule in fase precoce S): Per trovare celle gialle, aggiungere un intersecano rosso con le cellule verdi di comando (si trovano in 'combinazione'). Escludere gli oggetti per dimensione (<50 micron, si trovano in 'filtraggio') di escludere i piccoli oggetti non cellulari.
8. Trova gli oggetti esclusivamente rossi (cellule in fase G1): Per trovare i nuclei esclusivamente rossi, sottrarre le cellule gialle dai globuli rossi (che si trova in 'combinazione'). Escludere gli oggetti in base alle dimensioni <50 micron, (che si trova in 'filtraggio') per eliminare eventuali piccoli oggetti non cellulari creati.
9. Trova gli oggetti esclusivamente verdi (S / G2 / M celle di fase): Ripetere la procedura per il canale verde di trovare esclusivamente verde.
   Note: Se ci sono ancora oggetti non cellulari restanti, un comando popolazione filtro può essere aggiunta ai protocolli di rosso verde o esclusive Exclusive (che si trova in 'filtraggio') di mantenere solo gli oggetti con un fattore di forma maggiore di 0,25. Questo eliminerà gli oggetti non circolari.
10. Trova il contorno sferoide: Trova il contorno sferoide utilizzando un ritrovamento di comando (che si trova in 'Finding') con il canale verde o rosso (a seconda di quale ha più celle intorno al bordo dello sferoide) oggetti. Una soglia molto più bassa (che si trova nel trovare gli oggetti variabili) dovrà essere usato per trovare il contorno sferoide rispetto alle singole celle.
    1. Utilizzare un comando di chiusura per unire gli oggetti (che si trova in 'Processing'), poi riempire i fori negli oggetti (che si trova in 'Processing'), quindi utilizzare un filtro fine (che si trova in 'filtraggio') per rimuovere il rumore da oggetti. Infine, escludere gli oggetti in base alle dimensioni per rimuovere gli oggetti più piccoli <30.000 micron (a seconda delle dimensioni sferoide).
       Nota: Questo protocollo dovrà essere ottimizzato manualmente finché il contorno sferoide è accurato. Un'immagine brightfield può essere utilizzato anche - ma questo è generalmente meno accurato con una sezione sferoide, e un comando di inversione (trovato in 'Combinando') dovrà essere utilizzato.
11. Misurare le distanze di nuclei a contorno sferoide: Misurare le distanze (che si trova in 'Relative') dalle popolazioni di colore giallo, esclusivamente verde e rosso esclusivamente dal baricentro cella a bordo della sferoide outline.To visualizzare le distanze minime, che dovrebbe essere dal cella a bordo sferoide più vicino, attivare Mostra distanze nella scheda relazioni di opzioni di feedback (Misure> Le opzioni di retroazione> Relazioni).
12. Salvare il protocollo. Questo protocollo può essere ri-applicato ad altre immagini utilizzando le misurazioni> Comando Restore protocollo.
13. Creare un elemento di misure (Misure> Fai Misura articolo). I dati possono essere analizzati utilizzando l'analisifunzioni.
    1. Passare alla scheda analisi della voce misurazioni. Vai al menu Analysis (Analisi> Analisi) e analizzare la minima distanza dal baricentro delle cellule (rosso, verde o giallo) al bordo sferoide, riassunta dal conte e organizzato per popolazione.
    2. Per contare il numero di cellule che si trovano ad una certa distanza dal bordo creare un filtro (Analisi> Filter). Il filtro per la distanza minima in figura 2 si basa sulla penetrazione Hoechst (es distanza minima è inferiore a 80 dà popolazione "esterna"). In alternativa, esportare i dati grezzi di un foglio di calcolo per ulteriori analisi.

Risultati

Esistono diversi metodi per produrre sferoidi tumorali, questo protocollo utilizza il metodo di crescita non aderente, in cui le cellule sono coltivate su agar o ^3,7,9 agarosio. La Figura 1 mostra un esempio di uno sferoide C8161 melanoma dopo 3 giorni su agar. Sferoidi C8161 formano sferoidi di dimensioni regolari con un diametro di 500 - 600 micron (media = 565, DS = 19, n = 3) dopo 3 giorni. Altre linee di cellule di melanoma che formeranno sferoidi includono: WM793, WM983C, WM983B, WM164,...

Discussione

Analisi delle immagini semi-automatica ha identificato la G1 arrestato regione interna sferoide, e proliferare strati esterni. Questo metodo può essere utilizzato su sferoidi vivi utilizzando una sezione ottica, o in sezioni sferoidali fissi, per identificare variazioni non solo il ciclo cellulare ma espressione marcatore (via immunofluorescenza), morte cellulare, o morfologia cellulare in queste regioni diverse. Motilità cellulare in diverse regioni sferoidali può anche essere quantificato - se si aggiunge dal vivo ...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Hoechst 33342	Life Technologies	H3570
agarose low melting point	Life Technologies	16520-050	For sectioning
noble agar	Sigma	A5431	For making spheroids
agarose for spheroids	Fisher Scientific	BP1356-100	For making spheroids
0.05% trypsin/EDTA	Life Technologies	25300-054
HBSS	Life Technologies	14175-103
10% formalin	Sigma	HT5014-1CS	CAUTION: Harmful, corrosive. Use Personal Protective Equipment, do  not breath fumes (open in a fume cupboard).
live/dead near IR	Life Technologies	L10119
vibratome	Technical Products International, Inc
coulture cup	Thermo-Fisher Scientific	SIE936	Mold for sectioning spheroids
hemocytometer	Sigma	Z359629
96-well tissue culture plate	Invitro	FAL353072
collagenase	Sigma	C5138
confocal microscope	Leica	TCS SP5
Flow cytometer analyser	Becton Dickinson	LSRFortessa
volocity	PerkinElmer		Imaging software
flowjo	Tree Star		Flow cytometry software
Vaccuum grease	Sigma	Z273554
Mounting media	Vector Laboratories	H1000
FUCCI (commercial constructs)	Life Technologies	P36238	Transient transfection only
Cell strainer 70 um	In Vitro	FAL352350
Round bottom 5 mL tubes (sterile)	In Vitro	FAL352003
Round bottom 5 mL tubes (non-sterile)	In Vitro	FAL352008