Análise baseada em Citometria de Fluxo Imaging- e da Posição celular eo ciclo celular em 3D melanoma Spheroids

Resumo

We describe two complementary methods using the fluorescence ubiquitination cell cycle indicator (FUCCI) and image analysis or flow cytometry to identify and isolate cells in the inner G1 arrested and outer proliferating regions of 3D spheroids.

Resumo

Three-dimensional (3D) tumor spheroids are utilized in cancer research as a more accurate model of the in vivo tumor microenvironment, compared to traditional two-dimensional (2D) cell culture. The spheroid model is able to mimic the effects of cell-cell interaction, hypoxia and nutrient deprivation, and drug penetration. One characteristic of this model is the development of a necrotic core, surrounded by a ring of G1 arrested cells, with proliferating cells on the outer layers of the spheroid. Of interest in the cancer field is how different regions of the spheroid respond to drug therapies as well as genetic or environmental manipulation. We describe here the use of the fluorescence ubiquitination cell cycle indicator (FUCCI) system along with cytometry and image analysis using commercial software to characterize the cell cycle status of cells with respect to their position inside melanoma spheroids. These methods may be used to track changes in cell cycle status, gene/protein expression or cell viability in different sub-regions of tumor spheroids over time and under different conditions.

Introdução

Esferóides multicelulares 3D têm sido conhecida como um modelo de tumor durante décadas, no entanto, só recentemente é que eles tenham entrado em uso mais comuns, como um modelo in vitro para muitos cancros sólidos. Eles são cada vez mais utilizados em telas de alto rendimento de descoberta de drogas como um intermediário entre o complexo, caro e em modelos in vivo demorado e o simples, modelo de monocamada 2D baixo custo ^1-6. Estudos em cultura 2D são muitas vezes incapazes de ser replicado in vivo. Modelos esferóides de muitos tipos de cancro são capazes de imitar as características de crescimento, de sensibilidade a drogas, a penetração da droga, as interacções célula-célula, a disponibilidade limitada de nutrientes e de oxigénio e de desenvolvimento de necrose que é visto in vivo em tumores sólidos ^6-11. Os esferóides desenvolver um núcleo necrótico, uma região preso quiescente ou G1 que rodeia o núcleo, em proliferação e células na periferia do esferóide ^7. O desenvolvimento destas regiõespode variar dependendo da densidade celular, a taxa de proliferação e do tamanho do esferóide ^12. Postula-se que a heterogeneidade celular visto nestas sub-regiões diferentes podem contribuir para o câncer resistência terapêutica ^13,14. Portanto, a capacidade de analisar as células nessas regiões é crucial para as respostas separadamente drogas compreensão tumorais.

O sistema indicador de fluorescência ubiquitinação do ciclo celular (FUCCI) baseia-se no vermelho (Kusabira Laranja - KO) e verde (verde Azami - AG) a marcação fluorescente de CDT1 e geminin, que são degradados em diferentes fases do ciclo celular ^15. Assim núcleos celulares aparecem em vermelho no G1, amarelo no início S e verde no S / G2 / M fase. Nós descrevemos aqui dois métodos complementares tanto utilizando FUCCI para identificar o ciclo celular, juntamente com o uso de software de imagem ou de um fluxo de difusão do corante citometria de ensaio para determinar se as células residem no centro da G1 preso ou o exterior proliferatinanel G, e a distância de células individuais a partir da borda do esferóide. Estes métodos foram desenvolvidos na nossa publicação anterior, onde foi demonstrado que as células de melanoma em regiões hipóxicas no centro do esferóide ou / e na presença de terapias específicas são capazes de permanecer em G1 prisão por longos períodos de tempo, e pode re- entrar no ciclo celular quando as condições mais favoráveis ​​surgem ^7.

Protocolo

1. FUCCI Transdução e Cultura de Células

1. Transdução FUCCI
   1. Criar linhas de células que expressam estavelmente o FUCCI constrói mKO2-hCdt1 (30-120) e MAG-hGem (1-100) ^{15 utilizando} co-transdução de lentivírus, como descrito anteriormente ^7.
      Nota: O sistema FUCCI já está disponível comercialmente.
   2. Gerar sub-clones com fluorescência brilhante pela triagem de uma única célula. Ordenar as células individuais positivas tanto para AG e KO (amarelo) por fluorescência de células activadas por triagem em uma placa de 96 poços como anteriormente descrito ^7,16.
2. A cultura de células de melanoma
   1. Células de melanoma humano C8161 cultura como anteriormente descrito ^7,17.

2. Formação esferoidal 3D (como descrito anteriormente ^3,9)

1. Placa preparação de agarose
   1. Dissolve-se 1,5% de agarose (ou ágar nobre) em 100 ml de solução salina equilibrada de Hank (HBSS) ou fosfato Buffered salina (PBS) por ebulição no microondas por 3-5 min com agitação. Certifique-se a agarose é completamente dissolvido.
   2. Dispensar imediatamente 100 uL da solução de agarose por poço para uma placa de 96 poços de cultura de tecidos de fundo plano, utilizando uma pipeta multi-canal.
      Nota: Agarose pode solidificar nas pontas após um curto período de tempo, para ultrapassar este problema pontas deve ser mudado entre as placas, se fazer mais do que uma placa de agarose.
   3. Deixar placa de 96 poços sobre uma superfície plana de agarose a endurecer durante pelo menos 1 h.
2. Preparação de Células e de sobreposição em agarose
   1. Cultivar células de aproximadamente 80% de confluência num frasco T75. Lava-se com 10 ml de HBSS.
   2. Separe as células utilizando 1,5 ml de tripsina a 0,05% / ácido etilenodiaminotetracético (EDTA) e ressuspender em 10 ml de meio normal.
   3. Contagem de células utilizando um hemocitómetro ¹⁸ ou outro método de contagem automatizada.
   4. Ressuspender as células até uma concentração final de 25.000 células / ml em normamédio al.
   5. Overlay poços de agarose com 200 ul da suspensão de células para um número final de 5.000 células por poço.
   6. Placas de retorno para a incubadora de cultura celular (5% de CO ₂ e 37 ° C) para formar esferóides durante aproximadamente 3 dias.
      Nota: O tempo necessário para formar um esferóide varia entre diferentes linhas celulares. Algumas linhas de células de não formar esferóides utilizando este método de todo.
   7. Imagem esferóide morfologia com um microscópio invertido usando uma objetiva de 4X e um filtro de contraste de fase. Uma linha de células que forma com sucesso esferóides irá produzir agregados de células, aproximadamente esféricos compactos, e deve haver apenas um esferóide por poço.
      Nota: Opcional: Uma vez que os esferóides se terem formado, que podem ser transplantadas em colagénio ou outra matriz para análise de crescimento e invasão ^3,7,17. Para remover esferóides de colagénio, trata-se com 500 ul de 2 mg / ml de colagenase, a 37 ° C até que o colagénio é dissolvido suficiente para o spheroids para vir livre no meio (cerca de 30 min). Remova cuidadosamente esferóides utilizando uma pipeta de 1 ml.
   8. Para realizar o corte / imagiologia esferóides fix (quer isolados a partir de colagénio ou cultivadas durante 3-5 dias em agarose) em 10% de formalina tamponada neutra (CUIDADO: Formalina deve ser utilizado em uma câmara de exaustão) durante pelo menos 2 horas à temperatura ambiente (TA) , ou durante a noite (O / N) a 4 ° C. Os esferóides podem ser armazenados em HBSS a 4 ° C durante vários dias.

3. Spheroid Vibratome Seccionamento

1. Dissolve-se 5 g de agarose de baixo ponto de fusão em 100 ml de HBSS em uma garrafa de vidro de 500 ml num forno de microondas. Use uma configuração fogo médio com agitação. CUIDADO: Mantenha a tampa solta quando ferver a solução para que a pressão pode ser liberada. Use luvas heatproof de proteção para proteger as mãos de queimaduras ao manusear a garrafa de vidro quente.
2. Aguarde até que a agarose esfria um pouco - para que a garrafa pode ser tocado sem as mãos em chamas.
3. Despeje approximamadamente 2 ml de agarose para o fundo de um copo de contador de Coulter ou moldes de plástico semelhante. Imediatamente aspirar um esferóide fixo (ver secção 2.2.8) usando uma pipeta de 1 ml em o menor volume de líquido possível. Adicionar esferóide à agarose. Algumas esferóides (até 10) podem ser adicionados por chávena.
4. Cubra os esferóides com 2 ml mais de agarose. Fazê-lo rapidamente para evitar o endurecimento de agarose antes da segunda camada é adicionada.
5. Permitir que a agarose endureça à TA no escuro durante pelo menos 3 horas. Em vista disso, do ponto de copos pode ser armazenada por um curto período de tempo, a 4 ° C com 2-3 ml de HBSS sobrepostos para evitar a desidratação.
6. Remover agarose do copo. Apare a agarose contendo os esferóides para que ele se encaixa no bloco de metal vibratome, e esferóides estão perto do topo da agarose. Esferóides podem ser vistos como pequenos objetos brancos dentro da agarose. Super cola a agarose para o bloco.
7. Encha o vibratome com água destilada e montar o bloco no vibratome. Colocou ovibratome para cortar 100 mm seções usando velocidade baixa (definição 2) e vibração elevada (ajuste 8). Defina o ângulo de lâmina de corte de 16 °. Vire em vibratome, acender a luz vibratome e cortar seções do topo da agarose até 100 mm seções esferóides são cortadas. Coloque seções esferóides cortado em HBSS em uma placa de 24 poços.
8. Escolha seções do meio de análise de imagem. Seções de montagem em lâminas de transferência da seção plana para o slide usando uma pinça. Encha uma seringa de 10 ml com graxa de vácuo; adicionar uma linha fina de pasta de vácuo em torno das extremidades da secção, a fim de impedir que o meio de montagem de funcionar fora das extremidades da lâmina e ajudar a selar à secção sob a lamela. Cubra a seção com a montagem médio e uma lamela. Selar bordas da lamela com unha polonês. Loja desliza a 4 ° C antes de imagem.

4. confocal Image Acquisition

1. Tome uma imagem z-slice de uma seção esferóide meio FUCCI usando um 10Xou objectiva 20X como descrito anteriormente ^7. Certifique-se de qualquer sobreposição ou crosstalk ocorre entre o Kusabira Orange2 e Azami Green. Se comparando análise de imagem entre várias seções esferóide, mantenha potência do laser e outras definições da mesma entre as amostras.

5. Hoechst Dye Difusão Ensaio para Fluxo Seleção

1. Transferir esferóides vivos (3-5 dias após a semeadura agarose) para um tubo de 15 ml. Vamos esferóides gravidade se depositam no fundo do tubo. Vários esferóides pode ser manchado por tubo. Aproximadamente 20 esferóides são necessários para obter números de células suficientes para citometria de fluxo.
2. Remover o excesso de meio e adicionar 1 ml de 10 mM a Hoechst diluídos em meio normal. Incubar esferóides a 37 ° C durante aproximadamente 1 hora. Use flicking suave para voltar a suspender as esferóides uma ou duas vezes durante a incubação.
   Nota: O tempo de incubação pode ser variado para alterar o modo como o corante Hoechst longe penetra nos esferóides. Isto irá variar com base naso tamanho do esferóide, densidade e linha celular. Para algumas esferóides grandes / densas, pode haver uma penetração máxima de corante que é inferior a 100%.
3. Lavar os esferóides suavemente com 5 mL de HBSS, utilizando a gravidade de sedimentação.
   1. Opcional: Para imagiologia de penetração do corante: Fix esferóides com 10% de formalina tamponada neutra para, pelo menos, 2 h à TA ou O / N a 4 ° C. Prepare vibratome seções, montar em slides e imagem no confocal, como descrito nas etapas 3 e 4 acima.
4. Para preparar as células para citometria de fluxo, Trypsinize esferóides com 1 ml de tripsina a 0,05% / EDTA a 37 ° C durante aproximadamente 30 min, com sacudindo a cada 10 min para quebrar os esferóides separados.
   Nota: Os esferóides são difíceis de entrar em suspensão de célula única, as condições podem necessitar de ser optimizado. Viabilidade de C8161 4 dias de idade esferóides após este processo é de aproximadamente 95%.
5. Células mancha com um ao vivo near-infrared / mancha mortos de acordo com o protocolo do fabricante. Lavar com HBSS, em seguida, fixar com umml de 10% de formalina tamponada neutra por aproximadamente 30 min. As células podem ser armazenadas em HBSS a 4 ° C durante vários dias antes da análise de fluxo.

6. Citometria de Fluxo Análise de Hoechst manchados Fucci Spheroids

1. Assegurar que as células não são aglutinados, passando-os através de um filtro de células. Ressuspender o Hoechst coradas esferóides FUCCI em gelo frio de lavagem de FACS (PBS com 5% de soro fetal de vitela) a uma concentração de 1-5 x 10 ⁶ células / ml. Transferir 200 ul de amostra de 5 ml de fundo redondo tubos.
2. Prepare as seguintes amostras de controle de cores individuais, conforme descrito em 6.1: células de melanoma manchado de un; células de melanoma aderentes coradas com 10 mM Hoechst, durante 1 hora; Azami Verde só expressando células de melanoma; e Kusabira Laranja única expressando células de melanoma.
   Nota: os controlos de cor individuais podem ser fixadas em formalina e armazenado em FACS lava-se com 0,1% de azida de sódio a 4 ° C durante semanas ou mesmo meses.
3. Executar suspensões de células únicas de ofluxo na citometria analisador com lasers apropriados e única cor / controles não coradas como descrito anteriormente ^7,16.
4. Use um software de citometria comercial, como FlowJo para analisar o interior vs. células esferóides exteriores da seguinte forma:
   1. Remover detritos por gating na população de células principal em luz dispersa (FSC) vs. Luz Side Espalhados (SSC).
   2. Remover doublets por gating em células individuais usando FSC (Area) vs. FSC (Altura)
   3. Portão de células vivas por gating na população de baixa ao vivo / morto.
   4. Definir a Hoechst células gated elevados, com base no sinal positivo a partir das células aderentes corados com Hoechst, como células "exteriores".
   5. Definir Hoechst células baixas ou negativas, fechado com base no sinal de controlo coradas-un, como células "internos".
   6. Após as populações de gating para interior e exterior, as células podem ainda ser fechado para FUCCI vermelho (G1), amarelo (S precoce), verde (S / G2 / M) ou negativo (G1 precoce).
      Nota: Compensation utilizando os controlos de cor única pode não ser necessária para definir adequadamente as populações vermelho, amarelo, verde e negativos FUCCI.
5. Uma vez que o teste foi otimizado e Hoechst penetração validado via microscopia confocal, as células correr sem fixar em um classificador de célula de fluxo, como descrito anteriormente ^7,16 para posterior análise de sub-populações de células ao vivo.

7. Análise de Imagem de FUCCI Spheroid Secções

1. Abrir software por exemplo. Volocity, escolha a única configuração quantificação.
2. Criar uma nova biblioteca. Importe o arquivo de imagem confocal FUCCI esferóide para o software arrastando o arquivo de dados brutos do confocal para a biblioteca. Como alternativa, use o Arquivo> Importar comando.
3. Vá até a aba medições para construir um protocolo de análise de imagem. O Protocolo é construído, arrastando e soltando os comandos apropriados na ordem correta como se segue na janela de protocolo.
4. Encontre objECTS no canal verde: Arraste comando (encontrado em 'Finding') na janela do protocolo a encontrar objetos, selecione o canal correto nos objetos find protocol.Add um comando de abertura (que se encontra em «tratamento»), então um tocantes objetos separados comando (encontrado em 'Processamento' - o que irá separar as células). Excluir objetos de tamanho <50 mm (encontrado em 'Filtragem' - isso irá excluir os pequenos objetos não celulares).
   Nota: As variáveis ​​tais como a encontrar objetos limiar, o número de iterações aberto, o tamanho dos objectos a serem separadas e o tamanho dos objectos a excluir deve ser optimizado manualmente até que as máscaras de objectos corresponder à imagem.
5. Encontre objetos no canal vermelho: Repetir a encontrar objetos como acima para o canal vermelho. Protocolos de verde e vermelho pode ter de ser ajustada separadamente.
   Nota: Devido a estar em núcleos G2, núcleos verdes são muitas vezes um pouco maior.
6. Confirme objetos encontrados são precisos: Confirmar vermelho e objetos verdes coincidir com onúcleos vermelho e verde na imagem, desligando e nos canais verde e vermelho (usando a ocultar ou mostrar comando canal) ao exibir as máscaras vermelhas e verdes encontrados pelo protocolo. Medições opções de realimentação (feedback)> opções pode ser utilizada para modificar a aparência das máscaras de objectos.
7. Encontre objetos amarelos (células em fase S inicial): Para encontrar células amarelas, adicione uma interseção vermelho com células verdes de comando (encontrado em 'Combinando'). Excluir objetos de tamanho (<50 mm, encontrados em 'Filtragem') para excluir quaisquer objetos pequenos não celulares.
8. Encontre objetos exclusivamente vermelhos (células em fase G1): Para encontrar núcleos exclusivamente vermelhos, subtrair as células amarelas das células vermelhas (encontrados em 'Combinando'). Excluir objetos de tamanho <50 mm, (encontrado em 'Filtragem') para remover quaisquer pequenos objetos não celulares criados.
9. Encontre objetos exclusivamente verdes (células em fase S / G2 / M): Repita o procedimento para o canal verde para encontrar exclusivamente verde.
   Nãote: Se ainda houver objetos não celulares restantes, um comando população filtro pode ser adicionado ao exclusivo protocolos vermelho, verde ou exclusivas (encontrados em 'Filtragem') para reter apenas os objetos com um fator de forma maior do que 0,25. Isto irá remover objetos não-circulares.
10. Encontre o esboço esferóide: Encontre o contorno esferóide usando um achado de comando (encontrado em 'Finding') com o canal verde ou vermelho (o que tem mais células ao redor da borda do esferóide) objetos. Um limiar muito inferior (que se encontra na encontrar objetos variáveis) terá que ser usada para encontrar o contorno esferóide em comparação com as células individuais.
    1. Use um comando de fechamento para se juntar objetos (encontrados em «tratamento»), em seguida, preencher buracos em objetos (encontrados em «tratamento»), em seguida, usar um filtro fino (encontrado em 'Filtragem') para remover o ruído de objetos. Finalmente, excluir objetos por tamanho para remover objectos mais pequenos <30.000 ^ m (dependendo do tamanho do esferóide).
       Nota: Este protocolo terá de ser otimizada manualmente até o contorno esferóide é preciso. Uma imagem de campo claro, também podem ser utilizadas - no entanto, este é geralmente menos preciso com uma secção esferóide, e um comando invertido (encontrada em 'Combinando') terá de ser utilizado.
11. Medir distâncias dos núcleos de esferóide a delinear: Medir distâncias (encontrado no "relativa a") a partir das populações de amarelo, verde e exclusivamente exclusivamente vermelhas do centróide célula para o bordo do esferóide outline.To visualizar as distâncias mínimas, que deve ser a partir da célula para o bordo esferóide mais próximo, ligue mostrar distâncias na guia relações de opções de retorno (Medidas> Opções> Relações Comentário).
12. Guardar o protocolo. Este protocolo pode ser reaplicado para outras imagens, usando as medidas> Restaurar comando de protocolo.
13. Criar um item de medições (Medidas> Faça Medição item). Os dados podem ser analisados ​​utilizando a análisefunções.
    1. Vá até a aba análise no item medições. Vá para o menu Análise (Analysis> Analisar) e analisar a distância mínima entre o baricentro celular (vermelho, verde ou amarelo) para a borda esferóide, resumidos por contagem e organizado pela população.
    2. Para contar o número de células encontradas a uma certa distância da borda criar um filtro (Análise> Filtrar). O filtro para a distância mínima na Figura 2 é baseado em Hoechst penetração (por exemplo a distância mínima é inferior a 80 dá a população "exterior"). Alternativamente, a exportação de dados não processados ​​para uma planilha para análise posterior.

Resultados

Existem vários métodos de produção de esferóides tumorais, este protocolo utiliza o método de crescimento não-aderente, em que as células são cultivadas em agar ou agarose ^3,7,9. A Figura 1 mostra um exemplo de um esferóide melanoma C8161 após 3 dias em agar. Esferóides C8161 formar esferóides de tamanho regular com um diâmetro de 500-600 mm (média = 565, SD = 19, n = 3) após 3 dias. Outras linhas de células de melanoma que irão formar esferóides incluem: WM793, WM983C, WM9...

Discussão

Análise de imagens semi-automatizado identificou a região G1 presos interior esferóide, proliferando e camadas exteriores. Este método pode ser usado em esferóides vivo usando uma secção óptica, ou em secções fixas esferóides, para identificar mudanças na não só o ciclo celular, mas a expressão do marcador (por imunofluorescência), a morte celular, ou a morfologia das células nestas regiões diferentes. Motilidade celular dentro de diferentes regiões esferóides podem também ser quantificada - se as i...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Hoechst 33342	Life Technologies	H3570
agarose low melting point	Life Technologies	16520-050	For sectioning
noble agar	Sigma	A5431	For making spheroids
agarose for spheroids	Fisher Scientific	BP1356-100	For making spheroids
0.05% trypsin/EDTA	Life Technologies	25300-054
HBSS	Life Technologies	14175-103
10% formalin	Sigma	HT5014-1CS	CAUTION: Harmful, corrosive. Use Personal Protective Equipment, do  not breath fumes (open in a fume cupboard).
live/dead near IR	Life Technologies	L10119
vibratome	Technical Products International, Inc
coulture cup	Thermo-Fisher Scientific	SIE936	Mold for sectioning spheroids
hemocytometer	Sigma	Z359629
96-well tissue culture plate	Invitro	FAL353072
collagenase	Sigma	C5138
confocal microscope	Leica	TCS SP5
Flow cytometer analyser	Becton Dickinson	LSRFortessa
volocity	PerkinElmer		Imaging software
flowjo	Tree Star		Flow cytometry software
Vaccuum grease	Sigma	Z273554
Mounting media	Vector Laboratories	H1000
FUCCI (commercial constructs)	Life Technologies	P36238	Transient transfection only
Cell strainer 70 um	In Vitro	FAL352350
Round bottom 5 mL tubes (sterile)	In Vitro	FAL352003
Round bottom 5 mL tubes (non-sterile)	In Vitro	FAL352008