Analyse fondée cytométrie Imaging- et circulation de la position de cellule et le cycle cellulaire en 3D mélanome Sphéroïdes

Résumé

We describe two complementary methods using the fluorescence ubiquitination cell cycle indicator (FUCCI) and image analysis or flow cytometry to identify and isolate cells in the inner G1 arrested and outer proliferating regions of 3D spheroids.

Résumé

Three-dimensional (3D) tumor spheroids are utilized in cancer research as a more accurate model of the in vivo tumor microenvironment, compared to traditional two-dimensional (2D) cell culture. The spheroid model is able to mimic the effects of cell-cell interaction, hypoxia and nutrient deprivation, and drug penetration. One characteristic of this model is the development of a necrotic core, surrounded by a ring of G1 arrested cells, with proliferating cells on the outer layers of the spheroid. Of interest in the cancer field is how different regions of the spheroid respond to drug therapies as well as genetic or environmental manipulation. We describe here the use of the fluorescence ubiquitination cell cycle indicator (FUCCI) system along with cytometry and image analysis using commercial software to characterize the cell cycle status of cells with respect to their position inside melanoma spheroids. These methods may be used to track changes in cell cycle status, gene/protein expression or cell viability in different sub-regions of tumor spheroids over time and under different conditions.

Introduction

Sphéroïdes multicellulaires 3D ont été connu comme un modèle de tumeur pendant des décennies, mais il est seulement récemment qu'ils sont venus dans l'usage plus fréquent comme un modèle in vitro pour de nombreux cancers solides. Ils sont de plus en plus utilisés dans les écrans de découverte de médicaments à haut débit comme un intermédiaire entre complexe, coûteux et chronophage de modèles in vivo et le simple, le modèle monocouche faible coût 2D ^1-6. Études en culture 2D sont souvent incapables de répliquer in vivo. Modèles sphéroïde nombreux types de cancer sont capables d'imiter les caractéristiques de croissance, la sensibilité de la drogue, la pénétration du médicament, interactions cellule-cellule, la disponibilité restreinte du oxygène et de nutriments et le développement de la nécrose qui est vu dans vivo dans les tumeurs solides ^6-11. Sphéroïdes développent un coeur nécrotique, une région de repos ou G1 arrêté entourant le noyau, et les cellules en prolifération, à la périphérie de la sphéroïde ^7. Le développement de ces régionspeut varier en fonction de la densité cellulaire, le taux de prolifération et la taille de l'ellipsoïde ^12. Il a été émis l'hypothèse que l'hétérogénéité cellulaire vu dans ces différentes sous-régions peut contribuer au cancer résistance au traitement ^13,14. Par conséquent, la capacité d'analyser les cellules dans ces régions est cruciale séparément réponse aux médicaments compréhension tumorales.

Le système d'indicateurs du cycle cellulaire par fluorescence d'ubiquitination (FUCCI) est basé sur le rouge (Kusabira Orange - KO) et vert (Azami Vert - AG) marquage fluorescent de CDT1 et Geminin, qui sont dégradés dans les différentes phases du cycle cellulaire ^15. Ainsi les noyaux cellulaires apparaissent en rouge dans le G1, jaune au début de S et vert dans S / phase G2 / M. Nous décrivons ici deux méthodes complémentaires à la fois à l'aide FUCCI pour identifier le cycle cellulaire, de même que l'utilisation d'un logiciel d'imagerie ou d'un flux de diffusion de colorant cytométrie essai pour déterminer si les cellules se trouvent dans le centre de la G1 arrêté ou externe proliferating bague, et la distance des cellules individuelles à partir du bord de la sphéroïde. Ces méthodes ont été développées dans notre publication précédente, où nous avons démontré que les cellules de mélanome dans les régions hypoxiques dans le centre du sphéroïde ou / et en présence de thérapies ciblées sont en mesure de rester dans G1 arrestation pendant de longues périodes de temps, et peut re- entrer dans le cycle cellulaire lorsque des conditions plus favorables proviennent ^7.

Protocole

1. FUCCI transduction et culture cellulaire

1. FUCCI transduction
   1. Créer des lignées cellulaires exprimant de manière stable le FUCCI construit mKO2-hCdt1 (30-120) et GAM-hGem (1-100) ¹⁵ en utilisant la co-transduction lentivirus ⁷ comme décrit précédemment.
      Remarque: Le système FUCCI est maintenant disponible dans le commerce.
   2. Générer sous-clones avec une vive fluorescence par tri seule cellule. Trier simples cellules positives pour les deux AG et KO (jaune) par fluorescence tri cellulaire activé dans une plaque de 96 puits tel que décrit précédemment ^7,16.
2. Culture de cellules de mélanome
   1. C8161 Culture des cellules de mélanome humain tels que décrits précédemment ^7,17.

2. Formation 3D Spheroid (comme décrit précédemment ^3,9)

1. La préparation des plaques d'agarose
   1. Dissoudre 1,5% d'agarose (gélose noble ou) dans 100 ml de sel équilibré la solution de Hank (HBSS) ou phosphate Buffèred saline (PBS) par ebullition dans le micro-ondes pendant 3 à 5 min en agitant. Assurez-vous que l'agarose est complètement dissous.
   2. Répartir immédiatement 100 pi de la solution d'agarose par puits à une plaque de 96 puits de culture de tissu à fond plat avec une pipette multi-canal.
      Remarque: Agarose peut se solidifier dans les conseils après une courte période de temps, pour surmonter ce problème conseils doivent être changés entre les plaques se faisant plus d'une plaque d'agarose.
   3. Laissez plaque de 96 puits sur une surface plane à durcir agarose pendant au moins 1 h.
2. La préparation des cellules et la superposition sur agarose
   1. Cultiver les cellules à environ 80% de confluence dans un flacon T75. Laver avec 10 ml de HBSS.
   2. Détacher les cellules en utilisant 1,5 ml de trypsine à 0,05% d'acide / éthylènediaminetétraacétique (EDTA) et remettre en suspension dans 10 ml de milieu normal.
   3. Compter les cellules en utilisant un hémocytomètre ¹⁸ ou une autre méthode de comptage automatisé.
   4. Remettre en suspension les cellules à une concentration finale de 25.000 cellules / ml dans la normemoyen al.
   5. Superposez puits agarose avec 200 pi de la suspension de cellules pour un nombre final de 5000 cellules par puits.
   6. Plaques de retour à l'incubateur de culture cellulaire (5% de CO _{2 et} 37 ° C) pour former des sphéroïdes plus environ 3 jours.
      Remarque: Le temps nécessaire pour former un sphéroïde varie entre différentes lignées cellulaires. Certaines lignées cellulaires ne forment pas des sphéroïdes en utilisant cette méthode à tous.
   7. Image en morphologie sphéroïde avec un microscope inversé en utilisant un objectif de 4X et un filtre à contraste de phase. Une lignée de cellules qui forme avec succès sphéroïdes produiront agrégats cellulaires compacts, plus ou moins sphériques, et il devrait y avoir qu'un seul sphéroïde par puits.
      Note: Facultatif: Une fois sphéroïdes ont formé, ils peuvent être transplantées dans du collagène ou une autre matrice pour une analyse approfondie de la croissance et de l'invasion ^3,7,17. Pour supprimer sphéroïdes à partir de collagène, traiter avec 500 pi de 2 mg / ml de collagénase à 37 ° C jusqu'à ce que le collagène est dissous assez pour le SpherOID à venir librement dans les médias (environ 30 min). Retirez délicatement sphéroïdes utilisant une pipette de 1 ml.
   8. Pour sectionnement / imagerie sphéroïdes fixes (soit isolés à partir de collagène ou cultivées pendant 3-5 jours sur agarose) à 10% du formol tamponné neutre (ATTENTION: formol doit être utilisé dans une sorbonne) pendant au moins 2 heures à la température ambiante (RT) , ou toute la nuit (O / N) à 4 ° C. Sphéroïdes peuvent être stockées dans du HBSS à 4 ° C pendant plusieurs jours.

3. Spheroid Vibratome sectionnement

1. Dissoudre 5 g d'agarose à faible point de fusion dans 100 ml de HBSS dans un flacon en verre de 500 ml dans un four micro-ondes. Utilisez un réglage de feu moyen en remuant. ATTENTION: Gardez le couvercle lâche lors de l'ébullition de la solution ainsi que la pression peut être libérée. Utilisez des gants de protection résistant à la chaleur pour protéger les mains contre les brûlures lors de la manipulation de la bouteille de verre chaud.
2. Attendez jusqu'à ce que l'agarose refroidit légèrement - de sorte que la bouteille peut être touché sans brûler les mains.
3. Verser approximationron 2 ml d'agarose dans le fond d'un compteur Coulter tasse ou un moule plastique analogue. Aspirer immédiatement un sphéroïde fixe (voir section 2.2.8) en utilisant une pipette de 1 ml dans le plus petit volume de liquide possible. Ajouter à la sphéroïde agarose. Quelques sphéroïdes (jusqu'à 10) peuvent être ajoutés par tasse.
4. Couvrir les sphéroïdes avec 2 ml plus d'agarose. Pour ce faire rapidement pour éviter le durcissement agarose avant la deuxième couche est ajouté.
5. Laisser la gélose à durcir à température ambiante dans l'obscurité pendant au moins 3 h. A ce point les tasses peuvent être stockés pendant une courte période à 4 ° C avec 2-3 ml de HBSS superposées pour éviter la déshydratation.
6. Retirer agarose de la tasse. Coupez le agarose contenant les sphéroïdes afin qu'il tienne sur le bloc de métal vibratome et sphéroïdes sont à proximité du sommet de la gélose. Sphéroïdes peuvent être considérés comme de petits objets blancs à l'intérieur de l'agarose. Super Glue l'agarose au bloc.
7. Remplissez le vibratome avec de l'eau distillée et monter le bloc dans la vibratome. Met levibratome pour couper 100 um sections à vitesse lente (réglage 2) et de fortes vibrations (réglage 8). Réglez l'angle de lame de coupe à 16 °. Tournez sur vibratome, allumer la lumière vibratome et couper des sections du haut de l'agarose jusqu'à 100 um sections sphéroïde sont coupés. Placez sections sphéroïde couper en HBSS dans une plaque de 24 puits.
8. Choisissez sections intermédiaires pour l'analyse d'image. Sections de montage sur diapositives en transférant la section à plat sur la diapositive à l'aide des pinces. Remplir une seringue de 10 ml baril avec de la graisse à vide; ajoutez une fine ligne de graisse à vide sur les bords de la section afin d'empêcher les médias de montage de courir sur les bords de la diapositive et aider à sceller la section sous la lamelle. Couvrir la section avec un milieu de montage et une lamelle. Sceller les bords de la lamelle avec du vernis à ongles. Magasin glisse à 4 ° C avant l'imagerie.

4. confocale Image Acquisition

1. Prenez une image z-tranche d'une section de sphéroïde milieu de FUCCI utilisant un 10Xou un objectif 20X comme décrit précédemment ^7. Assurez-vous pas de chevauchement ou de la diaphonie se produit entre les Kusabira Orange2 et Azami vert. Si l'on compare l'analyse d'image entre les sections de sphéroïde multiples, maintenir la puissance du laser et d'autres paramètres de la même entre les échantillons.

5. Hoechst Dye Diffusion Essai de débit Tri

1. Transfert sphéroïdes vivants (3-5 jours après l'ensemencement) d'agarose dans un tube de 15 ml. Soit sphéroïdes gravité se déposent au fond du tube. Plusieurs sphéroïdes peuvent être colorées par tube. Environ 20 sphéroïdes sont nécessaires pour obtenir le nombre de cellules suffisant pour cytométrie de flux.
2. Retirer moyen excès et ajouter 1 ml de 10 um Hoechst diluées dans le milieu normal. Incuber sphéroïdes à 37 ° C pendant environ 1 heure. Utilisez pichenette douce pour remettre en suspension les sphéroïdes une ou deux fois pendant l'incubation.
   Remarque: Le temps d'incubation peut être modifiée pour modifier la façon dont loin le colorant Hoechst pénètre dans les sphéroïdes. Cela varie en fonction dela taille de l'ellipsoïde, de la densité et de la lignée cellulaire. Pour certains grands sphéroïdes denses / il peut y avoir une pénétration de colorant maximale qui est inférieure à 100%.
3. Laver les sphéroïdes doucement avec 5 ml de HBSS utilisant gravité décantation.
   1. Facultatif: Pour l'imagerie de la pénétration de colorant: Fix sphéroïdes avec 10% du formol tamponné neutre pendant au moins 2 heures à température ambiante ou O / N à 4 ° C. Préparer vibratome sections, monter sur des lames et de l'image sur le confocale comme décrit dans les étapes 3 et 4 ci-dessus.
4. Pour préparer les cellules pour cytométrie de flux, Trypsiniser sphéroïdes avec 1 ml de trypsine à 0,05% / EDTA à 37 ° C pendant environ 30 min avec effleurant toutes les 10 min pour briser les sphéroïdes de l'autre.
   Remarque: Sphéroïdes sont difficiles à obtenir en suspension de cellule unique, les conditions peuvent avoir besoin d'être optimisé. Viabilité de C8161 4 jours anciens sphéroïdes après ce processus est d'environ 95%.
5. Cellules tache avec une tache de vivre proche infrarouge / morts selon le protocole des fabricants. Laver avec de l'HBSS puis fixer avec 1ml de 10% de formaline tamponnée neutre pendant environ 30 min. Les cellules peuvent être stockées dans du HBSS à 4 ° C pendant plusieurs jours avant l'analyse de flux.

6. cytométrie de flux de Hoechst Stained FUCCI Sphéroïdes

1. Assurer cellules ne sont pas agglutinés en les faisant passer à travers un tamis cellulaire. Reprendre le Hoechst tachée sphéroïdes FUCCI dans la glace froide lavage de FACS (PBS avec 5% de sérum de veau foetal) à une concentration de 1-5 x 10 ⁶ cellules / ml. Transférer 200 ul d'échantillon de 5 ml rondes tubes inférieurs.
2. Préparer les échantillons uniques de contrôle des couleurs suivantes comme décrit dans 6.1: cellules de mélanome de l'ONU teinté; les cellules de mélanome adhérentes colorées avec 10 uM Hoechst pendant 1 h; Azami Vert exprimant seulement des cellules de mélanome; Kusabira orange et exprimant uniquement des cellules de mélanome.
   Remarque: simples contrôles de couleur peuvent être fixés dans du formol et entreposés dans FACS laver avec 0,1% d'azoture de sodium à 4 ° C pendant des semaines, voire des mois.
3. Suspensions cellulaires seul passage ona cytométrie en flux analyseur avec des lasers appropriés et couleur unique / contrôles non colorées comme décrit précédemment ^7,16.
4. Utilisez un logiciel de cytométrie commercial comme FlowJo d'analyser l'intérieure vs cellules sphéroïdes extérieures comme suit:
   1. Enlever les débris gating sur la principale population de cellules dans l'avenir lumière diffusée (FSC) vs. Side lumière diffusée (SSC).
   2. Retirer doublets par gating des cellules uniques en utilisant FSC (Région) vs. FSC (Hauteur)
   3. Porte pour les cellules vivantes par fenêtrage morts la population en direct / faible.
   4. Définir Hoechst cellules élevés, gated sur la base du signal positif à partir des cellules adhérentes colorés avec Hoechst, que les cellules «extérieur».
   5. Définir Hoechst cellules faibles ou négatifs, gated basé sur le signal de la commande de non souillé, que les cellules «internes».
   6. Après déclenchement pour les populations intérieures et extérieures, les cellules peuvent en outre être déclenchés pour FUCCI rouge (G1), jaune (début S), vert (S / G2 / M) ou négative (G1 début).
      Remarque: CÉMUNÉRATION en utilisant les commandes d'une seule couleur peut être nécessaire de bien définir les populations rouges, jaunes, verts et négatifs FUCCI.
5. Une fois que le test a été optimisé et la pénétration Hoechst validé par microscopie confocale, les cellules de fonctionner sans fixer sur un trieur de cellules de flux comme décrit précédemment ^7,16 pour une analyse approfondie des sous-populations de cellules vivantes.

Analyse 7. Image FUCCI sphéroïdes Sections

1. Ouvrir le logiciel, par exemple. Volocity, choisir la configuration SEULEMENT quantification.
2. Créer une nouvelle bibliothèque. Importez le FUCCI sphéroïde fichier image confocale dans le logiciel en faisant glisser le fichier de données brutes du confocale dans la bibliothèque. Sinon, utilisez la commande Fichier> Importer.
3. Allez à l'onglet des mesures pour construire un protocole d'analyse d'image. Le Protocole est construit en faisant glisser les commandes appropriées dans le bon ordre comme suit dans la fenêtre de protocole.
4. Trouver objECTS dans le canal vert: Faites glisser le trouver des objets commande (trouvé dans "constatation") dans la fenêtre de protocole, sélectionner le canal correct dans les objets de trouvaille protocol.Add une commande d'ouverture (qui se trouve dans le «traitement»), puis un toucher les objets séparés commande (trouvé dans "transformation" - cela va séparer les cellules). Exclure les objets de taille <50 pm (trouvé dans «filtrage» - cela va exclure les petits objets non-cellulaires).
   Remarque: Les variables telles que le seuil trouver des objets, ouvertes nombre d'itérations, la taille des objets à séparer et la taille des objets à exclure doit être optimisé manuellement jusqu'à ce que les masques d'objet correspondant à l'image.
5. Trouvez des objets dans le canal rouge: Répétez trouver des objets comme ci-dessus pour le canal rouge. Peuvent avoir besoin d'être ajustée séparément protocoles verts et rouges.
   Remarque: En raison de noyaux étant en G2, noyaux verts sont souvent légèrement plus grande.
6. Confirmez objets trouvés sont exacts: Confirmation du rouge et objets verts correspondent à lanoyaux rouges et verts dans l'image en éteignant et sur les canaux vert et rouge (en utilisant le masquer ou afficher la commande de canal) tout en affichant les masques rouges et verts trouvés par le protocole. Options de rétroaction (Mesures> options de retour) peuvent être utilisés pour modifier l'apparence des masques d'objets.
7. Trouvez des objets jaunes (cellules en phase S précoce): Pour trouver des cellules jaunes, ajouter une intersection rouge avec cellules vertes commande (dans «La combinaison '). Exclure les objets par taille (<50 um, trouvés dans «filtrage») d'exclure les petits objets non-cellulaires.
8. Trouvez des objets exclusivement rouges (cellules en phase G1): Pour trouver noyaux exclusivement rouges, soustraire les cellules jaunes de globules rouges (trouvés dans 'La combinaison'). Exclure les objets par taille <50 um, (qui se trouve dans «filtrage») pour enlever tous les petits objets non-cellulaires créées.
9. Trouvez des objets exclusivement vertes (cellules en phase S / G2 / M): Répétez l'opération pour le canal vert pour trouver exclusivement verte.
   Nonte: Si il ya encore des objets non-cellulaires restants, une commande de la population de filtre peut être ajouté à des protocoles rouges ou verts Exclusif (trouvés dans «filtrage») pour ne retenir que les objets avec un facteur de forme supérieur à 0,25. Cela permettra d'éliminer les objets non-circulaires.
10. Trouver le contour sphéroïde: Trouver le contour de l'aide d'un sphéroïde trouver des objets commande (trouvé dans "constatation") avec le canal vert ou rouge (selon celui qui a plus de cellules sur le bord du sphéroïde). Un seuil beaucoup plus bas (qui se trouve dans le Trouvez des objets de variables) devra être utilisé pour trouver le contour sphéroïde par rapport à des cellules individuelles.
    1. Utilisez une commande proche de rejoindre objets trouvés dans ('Traitement'), puis remplir les trous dans les objets trouvés dans ('Traitement'), puis utiliser un filtre fin (trouvé dans «filtrage») pour supprimer le bruit à partir d'objets. Enfin, exclure des objets de la taille d'enlever des objets plus petits <30 000 um (en fonction de la taille de sphéroïde).
       Note: Ce protocole devra être optimisée manuellement jusqu'à ce que le contour sphéroïde est exacte. Une image en fond clair peut également être utilisé - mais cela est généralement moins précis avec une section sphéroïde, et une commande Inverser (trouvé dans 'La combinaison') devra être utilisé.
11. Mesurer les distances de noyaux d'esquisser sphéroïde: Mesurer les distances (trouvés dans «relative») des populations jaunes, exclusivement vertes et exclusivement rouges du centre de gravité de la cellule au bord du sphéroïde outline.To visualiser les distances minimales, qui devrait être de la cellule au bord sphéroïde plus proche, activer l'option Afficher les distances dans l'onglet relations dans les options de rétroaction (Mesures> Options> Rapports de rétroaction).
12. Enregistrez le protocole. Ce protocole peut être ré-appliquer à d'autres images en utilisant les mesures> Restaurer commande de protocole.
13. Créer un élément de mesure (Mesures> Faire Mesure Point). Les données peuvent être analysées en utilisant l'analysefonctions.
    1. Allez à l'onglet d'analyse par le produit des mesures. Allez dans le menu Analyse (Analyse> Analyser) et d'analyser la distance minimale entre le centre de gravité de la cellule (rouge, vert ou jaune) au bord sphéroïde, résumée par le comte et organisée par la population.
    2. Pour compter le nombre de cellules qui se trouvent à une certaine distance du bord créer un filtre (Analyse> Filtre). Le filtre de distance minimale à la figure 2 est basé sur la pénétration Hoechst (par exemple, la distance minimale est inférieure à 80 donne la population «externe»). Alternativement, l'exportation des données brutes vers un tableur pour une analyse ultérieure.

Résultats

Il existe plusieurs procédés de production de sphéroïdes de tumeur, ce protocole utilise la méthode de croissance non-adhérente, où les cellules sont mises en culture sur de la gélose ou agarose ^3,7,9. La figure 1 montre un exemple d'un sphéroïde C8161 de mélanome dans les 3 jours sur de la gélose. Sphéroïdes C8161 forment sphéroïdes de taille régulière avec un diamètre de 500 - 600 um (moyenne = 565, SD = 19, n = 3) après 3 jours. D'autres lignée...

Discussion

Semi-automatisé d'analyse d'image identifié la région intérieure sphéroïde G1 arrêté, et la prolifération des couches externes. Ce procédé peut être utilisé sur des sphéroïdes sous tension au moyen d'un article optique, ou dans des sections de sphéroïdes fixes, afin d'identifier des changements dans non seulement du cycle cellulaire, mais l'expression du marqueur (par immunofluorescence), la mort cellulaire, ou la morphologie des cellules dans les différentes régions. Motilité cel...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Hoechst 33342	Life Technologies	H3570
agarose low melting point	Life Technologies	16520-050	For sectioning
noble agar	Sigma	A5431	For making spheroids
agarose for spheroids	Fisher Scientific	BP1356-100	For making spheroids
0.05% trypsin/EDTA	Life Technologies	25300-054
HBSS	Life Technologies	14175-103
10% formalin	Sigma	HT5014-1CS	CAUTION: Harmful, corrosive. Use Personal Protective Equipment, do  not breath fumes (open in a fume cupboard).
live/dead near IR	Life Technologies	L10119
vibratome	Technical Products International, Inc
coulture cup	Thermo-Fisher Scientific	SIE936	Mold for sectioning spheroids
hemocytometer	Sigma	Z359629
96-well tissue culture plate	Invitro	FAL353072
collagenase	Sigma	C5138
confocal microscope	Leica	TCS SP5
Flow cytometer analyser	Becton Dickinson	LSRFortessa
volocity	PerkinElmer		Imaging software
flowjo	Tree Star		Flow cytometry software
Vaccuum grease	Sigma	Z273554
Mounting media	Vector Laboratories	H1000
FUCCI (commercial constructs)	Life Technologies	P36238	Transient transfection only
Cell strainer 70 um	In Vitro	FAL352350
Round bottom 5 mL tubes (sterile)	In Vitro	FAL352003
Round bottom 5 mL tubes (non-sterile)	In Vitro	FAL352008