Imaging-とフローサイトメトリーベースのセル位置の解析と3Dメラノーマスフェロイドにおける細胞周期

要約

We describe two complementary methods using the fluorescence ubiquitination cell cycle indicator (FUCCI) and image analysis or flow cytometry to identify and isolate cells in the inner G1 arrested and outer proliferating regions of 3D spheroids.

要約

Three-dimensional (3D) tumor spheroids are utilized in cancer research as a more accurate model of the in vivo tumor microenvironment, compared to traditional two-dimensional (2D) cell culture. The spheroid model is able to mimic the effects of cell-cell interaction, hypoxia and nutrient deprivation, and drug penetration. One characteristic of this model is the development of a necrotic core, surrounded by a ring of G1 arrested cells, with proliferating cells on the outer layers of the spheroid. Of interest in the cancer field is how different regions of the spheroid respond to drug therapies as well as genetic or environmental manipulation. We describe here the use of the fluorescence ubiquitination cell cycle indicator (FUCCI) system along with cytometry and image analysis using commercial software to characterize the cell cycle status of cells with respect to their position inside melanoma spheroids. These methods may be used to track changes in cell cycle status, gene/protein expression or cell viability in different sub-regions of tumor spheroids over time and under different conditions.

概要

多3Dスフェロイドが数十年のための腫瘍モデルとして知られている、しかし、それは彼らが多くの固形癌のためのin vitroモデルとして、より一般的に使用されるようになったことはごく最近です。彼らはますます複雑、高価で時間のかかる生体内モデルで 、シンプルで低コストの2D単層モデル^1-6との間の中間のような高スループットの薬物発見スクリーニングにおいて使用されています。 2D培養における研究は、多くの場合、 生体内で複製することができません。癌の多くの種類の回転楕円体モデルは、増殖特性、薬剤感受性、薬剤の浸透、細胞-細胞相互作用、固形腫瘍^6-11 においてインビボで見られる酸素や栄養素および壊死の開発の制限された利用可能性を模倣することができます。スフェロイドは、回転楕円体⁷の周囲に壊死性コア、コアを取り囲む逮捕静止またはG1領域、および増殖細胞を開発しています。これらの領域の開発細胞密度、増殖速度および回転楕円体¹²の大きさに応じて変えることができます。これらの異なるサブ領域で見られる細胞の異質性は、癌治療抵抗^13,14に寄与し得ると仮定されています。したがって、これらの領域内の細胞を分析する能力は、個別の腫瘍薬物応答を理解するために重要です。

緑（あざみグリーン- AG）は、細胞周期¹⁵の異なる段階に分解されるCDT1とGemininの蛍光タグ付け、 -蛍光ユビキチン化、細胞周期のインジケータ（FUCCI）システムは、赤（KO Kusabiraオレンジ）に基づいています。従って、細胞核は、初期のS内の黄色、G1の赤とS / G2 / M期で緑に表示されます。ここでは二つの相補的な方法を記載している両方の細胞がG1逮捕中央または外側proliferatinに存在するかどうかを決定するために画像処理ソフトウェアまたは染料拡散フローサイトメトリーアッセイの使用に伴って、細胞周期を特定するためにFUCCIを用いグラムリング、及び回転楕円体の端部から個々の細胞の距離。これらの方法は、我々は回転楕円体の中心にあるおよび/または標的療法の存在下での低酸素領域におけるメラノーマ細胞が長期間G1停止のままにすることが可能であり、再できることを実証した我々の以前の出版物、に開発されましたより有利な条件は^7を生じたとき、細胞周期を入力してください。

プロトコル

1. FUCCI伝達および細胞培養

1. FUCCI伝達
   1. 安定以前に^{7に記載されているように}同時形質導入レンチウイルスを使用してFUCCIはmKO2-hCdt1（30〜120）を構築し^{、MAG-hGem（1-100）15を発現する細胞株}を作成します。
      注：FUCCIシステムは、現在市販されています。
   2. 単一細胞選別によって明るい蛍光を有するサブクローンを生成します。以前に^{7,16に記載されているように} 96ウェルプレートに蛍光活性化細胞選別によってAGおよびKO（黄色）の両方に陽性ソート単一細胞。
2. メラノーマ細胞培養
   1. 文化C8161ヒトメラノーマ細胞は、以前に^7,17を説明しました。

2. 3Dスフェロイドの形成（以前に^3,9を説明したように）

1. アガロースプレートの準備
   1. ハンクス平衡塩溶液（HBSS）またはリン酸buffere 100mlの1.5％アガロース（または希寒天）を溶解旋回で3~5分間電子レンジで煮沸することによってDの生理食塩水（PBS）。アガロースが完全に溶解していることを確認します。
   2. すぐにマルチチャンネルピペットを使用して、平底96ウェル組織培養プレートにウェル当たりアガロース溶液100μlを分注します。
      注意：アガロースは、複数のアガロースプレートを作る場合は、この問題のヒントは、プレート間に変更する必要があります克服するために、時間の短い期間の後に先端に固化することができます。
   3. 少なくとも1時間、アガロース強化するために平らな面に96ウェルプレートを残します。
2. アガロースへの細胞調製物とオーバーレイ
   1. T75フラスコ中の約80％の集密度に細胞を増殖させます。 HBSSの10mlで洗浄します。
   2. 0.05％トリプシン/エチレンジアミン四酢酸（EDTA）および正常培地10ml中に再懸濁の1.5ミリリットルを用いて細胞を切り離します。
   3. 血球計数器¹⁸または他の自動計数法を用いて細胞を数えます。
   4. ノルムで25,000細胞/ mlの最終濃度まで細胞を再懸濁アル媒体。
   5. ウェル当たり5,000細胞の最終的な数のための細胞懸濁液の200μlでオーバーレイアガロース井戸。
   6. 約3日間のスフェロイドを形成するために、細胞培養インキュベーター（5％CO _2、37℃）でプレートを返します。
      注意：回転楕円体を形成するのに要する時間は、異なる細胞株の間で変化します。いくつかの細胞株は、すべて、この方法を使用して、スフェロイドを形成しません。
   7. 4X対物レンズと位相差フィルタを使用して、倒立顕微鏡を用いて画像の回転楕円体の形態。成功したスフェロイドを形成する細胞株は、コンパクト、おおよそ球状の細胞凝集体が生成され、よくごとに1つだけのスフェロイドがあるはずです。
      注意：オプション：スフェロイドを形成した後、彼らは成長および浸潤^3,7,17 ​​のさらなる分析のために、コラーゲンまたは他のマトリックスに移植することができます。コラーゲンはspherのために十分に溶解するまで37℃で2 mg / mlのコラゲナーゼの500μlの治療、コラーゲンからスフェロイドを削除するにはOIDは、メディア（約30分）への無料来て。静かに1ミリリットルピペットを用いてスフェロイドを削除してください。
   8. 切片用に/イメージング（コラーゲンから単離されたまたはアガロース3-5日間増殖させたのいずれか）を、10％中性緩衝ホルマリンで固定スフェロイド（注意：ホルマリンは、ドラフトチャンバー内で使用されるべきである）、室温で少なくとも2時間（RT）を4℃で、または一晩（O / N）。スフェロイドは、数日間4℃でHBSSに格納されてもよいです。

3.スフェロイドビブラトームセクショニング

1. 電子レンジで500 mlのガラス瓶にHBSS 100ml中の低融点アガロースを5g溶解します。旋回と中火の設定を使用します。注意：ソリューションを沸騰したときに圧力を放出することができるように、緩い蓋をしてください。ホットガラス瓶を取り扱うときは火傷から手を保護するために、保護耐熱手袋を使用してください。
2. アガロースは少し冷えるまで待ちます - ので、ボトルは手を焼くことなく、触れることができます。
3. approxima注ぎますコー​​ルターカウンターカップまたは類似のプラスチック金型の底部にアガロースのtely 2ミリリットル。直ちに液体可能な最小の体積で1ミリリットルピペットを用いて（セクション2.2.8を参照）の固定回転楕円体を吸引します。アガロースにスフェロイドを追加します。 （10まで）いくつかのスフェロイドは、カップごとに添加してもよいです。
4. アガロースの2ミリリットル以上でスフェロイドをカバー。第2の層が追加される前に、アガロース硬化を避けるために、すぐにこれを行います。
5. アガロースは、少なくとも3時間、暗所で室温で硬化することを許可します。 HBSSの2-3 mlの脱水を防ぐために、オーバーレイと、この時点でカップを4℃で短期間保存することもできます。
6. カップからアガロース削除します。それはビブラトーム金属ブロックの上に合うように、スフェロイドを含むアガロースをトリミングし、スフェロイドは、アガロースの上部に近接しています。スフェロイドは、アガロース中に小さな白い物体として見ることができます。スーパーブロックにアガロースを接着。
7. 蒸留水でビブラトームを記入し、ビブラトームでブロックをマウントします。設定（8の設定）（設定2）低速を使用し、高振動100μmのセクションをカットするビブラトーム。 16°に切断刃の角度を設定します。 、ビブラトームオンにビブラライトをオンにして100μmの回転楕円体のセクションが切断されるまで、アガロースの上からセクションをカット。 24ウェルプレートにHBSSにカット回転楕円体のセクションを配置します。
8. 画像解析のための中央のセクションを選択してください。ピンセットを使用して、スライド上にセクションを平らに転送することで、スライド上のマウントセクション。真空グリースで10mlのシリンジバレルを埋めます。スライドの端をオフに実行してから取り付けメディアを防止し、カバースリップの下部分をシールするのを助けるために部分のエッジの周りに真空グリースの細い線を追加します。封入剤とカバーガラスのセクションをカバー。マニキュアでカバースリップの端をシールします。ストアは、撮影の前に4℃でスライドします。

4.共焦点画像取得

1. 10Xを使用して中間のFUCCIスフェロイドセクションのzスライス画像を取りますまたは20Xの目的は、前に^7を説明しました。重複やクロストークがKusabira Orange2とアザミグリーンとの間で発生していないことを確認してください。複数の回転楕円体の部分の間の画像分析を比較した場合、レーザパワーおよびその他の設定のサンプル間で同じに保ちます。

フローソーティング5.ヘキスト染料拡散アッセイ

1. 15mlチューブにライブスフェロイド（アガロース播種後3〜5日）を転送します。スフェロイドの重力がチューブの底に沈殿してみましょう。いくつかのスフェロイドは、チューブごとに染色することができます。約20スフェロイドを、フローサイトメトリーのために十分な細胞数を得るために必要とされます。
2. 余分な培地を除去し、通常の培地で希釈し、10μMヘキストの1ミリリットルを追加します。約37℃で1時間スフェロイド培養します。インキュベーションの間に一度か二度スフェロイドを再懸濁し、穏やかなフリックを使用してください。
   注意：インキュベーション時間は、ヘキスト色素がスフェロイドに浸透どこまで変えるために変更することができます。これは、によって異なります回転楕円体の大きさ、密度および細胞株。いくつかの大規模な/高密度のスフェロイドについては100％未満である最大染料浸透があってもよいです。
3. 重力沈降を使用して、HBSS 5mlで優しくスフェロイドを洗ってください。
   1. オプション：染料浸透のイメージングのための：4℃でRTまたはO / Nで少なくとも2時間、10％中性緩衝ホルマリンでスフェロイドを修正しました。 、ビブラトーム切片を作製し、上記の手順3と4で説明したように、共焦点のスライドや画像上にマウントします。
4. フローサイトメトリーのための細胞を調製するために、離れたスフェロイドを破壊するために10分ごとにフリックして約30分間37℃で0.05％トリプシン/ EDTAを1 mlのスフェロイドをトリプシン処理。
   注：スフェロイドは、単一細胞懸濁液に入るのが困難である、条件を最適化する必要があるかもしれません。この処理の後C8161 4日齢のスフェロイドの生存率は約95％です。
5. 製造業者のプロトコルに従って、近赤外生/死染色で染色細胞。 1で固定した後、HBSSで洗浄します約30分間、10％中性緩衝ホルマリンミリリットル。細胞は、フロー分析前に数日間4℃でHBSSに格納されてもよいです。

ヘキスト染色FUCCIスフェロイドの6フローサイトメトリー分析

1. 確実細胞を細胞ストレーナーに通して一緒に凝集されていません。ヘキストを再懸濁し、氷冷FACSでFUCCIスフェロイドは1-5×10 ⁶細胞/ mlの濃度で（5％ウシ胎児血清を有するPBS）で洗浄染色。 5ミリリットル丸底チューブにサンプルの200μlのを転送します。
2. 6.1で説明したように、次の単色コントロールサンプルを準備します。未染色メラノーマ細胞を、接着性黒色腫細胞は、1時間10μMヘキストで染色しました。アザミグリーンのみ黒色腫細胞を発現させること;そして、Kusabiraオレンジのみ黒色腫細胞を表します。
   注：単一のカラーコントロールは、数週間または数ヶ月のために4℃で0.1％アジ化ナトリウムで洗浄し、ホルマリンで固定し、FACSに格納されてもよいです。
3. O、単一細胞懸濁液を実行します。以前に^{7,16に記載されているように} 、適切なレーザおよび単一色/染色されていないコントロールとアナライザフローサイトメトリーナ。
4. 次のように外側回転楕円体細胞対内部を分析するために、このようなFlowJoソフトなどの商用サイトメトリーソフトウェアを使用します。
   1. 前方散乱光側方散乱光（SSC）対（FSC）の主な細胞集団にゲートすることによってゴミを取り除きます。
   2. FSC対FSC（エリア）（高さ）を使用して単一細胞にゲートすることによって二重を削除
   3. 生/死低人口にゲーティングすることにより生細胞のための門。
   4. 「外側」細胞として、ヘキストで染色した接着細胞からの正の信号に基づいてゲートさヘキスト高い細胞を、定義します。
   5. 「内側」細胞として、未染色対照からの信号に基づいてゲートされ、ヘキスト低または負のセルを定義します。
   6. 内側と外側の集団についてゲーティングした後、細胞をさらにFUCCI赤（G1）、イエロー（早いS）、緑（S / G2 / M）または負の（初期のG1）のためにゲーティングすることができます。
      注：C単一のカラーコントロールを使用ompensationが適切FUCCI、赤、黄、緑、および負の集団を定義するために必要とされ得ます。
5. アッセイを最適化し、ヘキスト浸透は、共焦点顕微鏡で確認されていたら、以前に生細胞サブ集団のさらなる分析のために^{7,16に記載されているように} 、フローセルソーターに固定せずにセルを実行します。

FUCCIスフェロイドセクションの7画像解析

1. オープンソフトウェアなど 。 Volocityは、定量構成のみを選択します。
2. 新しいライブラリを作成します。ライブラリに共焦点からの生データファイルをドラッグすることで、ソフトウェアにFUCCIスフェロイド共焦点画像ファイルをインポートします。あるいは、[ファイル]> [インポート]コマンドを使用します。
3. 画像解析プロトコルを構築するための測定]タブに移動します。プロトコルは、プロトコル・ウィンドウに次のように正しい順序で適切なコマンドをドラッグ＆ドロップすることによって構築されています。
4. OBJの検索グリーンチャンネルでECTS：検索のオブジェクトに適切なチャンネルを選択し、プロトコルウィンドウに（ '発見'にあります）を見つけるオブジェクトのコマンドをドラッグは、別のオブジェクトに触れた後、（「処理」にあります）openコマンドをprotocol.Addコマンド（「処理」で見つかった - これは、細胞を分離します）。サイズによってオブジェクトを除外する<（ 'フィルタ'にあり - これは小さな非細胞のオブジェクトを除外します）50μmです。
   注意：検索がしきい値、オープン反復回数をオブジェクト変数のような、オブジェクトのサイズを分離するために、オブジェクトマスクは画像と一致するまで除外するオブジェクトのサイズを手動で最適化されなければなりません。
5. 赤チャンネル内のオブジェクトを検索：赤チャネルのための上記のようにオブジェクトを見つける繰り返します。緑と赤のプロトコルを別々に調整する必要があります。
   注意：核はG2であることに起因して、緑色の核は、多くの場合、わずかに大きいです。
6. 確認したオブジェクトが正確である：確認して赤と緑のオブジェクトが一致オフすることにより、プロトコルによって発見さ赤と緑のマスクを表示しながら（表示または非表示channelコマンドを使用して）緑と赤​​チャンネルの画像で赤と緑の核。フィードバックオプション（測定>フィードバックオプション）オブジェクトマスクの外観を変更するために使用することができます。
7. 黄色のオブジェクト（初期のS期細胞）検索：グリーン細胞と赤の交差を追加し、黄色のセルを検索するには（「組み合わせる」で見つかった）コマンドを使用します。どんな小さな非細胞オブジェクトを除外すること（「フィルタリング」で見つかった<50ミクロン）のサイズによってオブジェクトを除外。
8. （G1期細胞）を独占的に赤のオブジェクトを検索します（ '組み合わせる'にあり）赤血球から黄色の細胞を、もっぱら赤核を見つける減算します。作成された小さな非セルラーオブジェクトを削除する（「フィルタリング」にあります）サイズ<50ミクロンでオブジェクトを除外します。
9. 排他的に緑のオブジェクト（S / G2 / M期の細胞）を探す：もっぱら緑見つけるのグリーンチャンネルのために繰り返します。
   ノーTE：残りの非細胞オブジェクトがまだ存在する場合、フィルタ群コマンドは、0.25よりも大きい形状係数を有するオブジェクトのみを保持する（「フィルタリング」にある）排他緑色または赤色排他プロトコルに加えてもよいです。これは、非円形のオブジェクトを削除します。
10. 回転楕円体の輪郭を探す：（回転楕円体のエッジの周りに複数のセルを持っている方）緑または赤チャンネルで（ '検索」で見つかった）のオブジェクトの検索コマンドを使用して、回転楕円体の輪郭を検索します。はるかに低いしきい値（検索で見つかった変数をオブジェクト）は、個々の細胞に比べてスフェロイドアウトラインを見つけるために使用する必要があります。
    1. その後、オブジェクトからノイズを除去するために（「フィルタリング」にあります）細かいフィルターを使用した後、（「処理」にあります）のオブジェクトの穴を埋め、（「処理」にあります）のオブジェクトを結合するためにcloseコマンドを使用します。最後に、小さなオブジェクト（回転楕円体の大きさに応じて）<3万ミクロンを除去するために、サイズによってオブジェクトを除外。
       注意：このプロトコルは、回転楕円体の輪郭が正確であるまで、手動で最適化する必要があります。明視野画像を使用することもできる - ただし、これは、通常、球状部とあまり正確であり、かつ（「組み合わせ」にある）反転コマンドを使用する必要があります。
11. 回転楕円体の輪郭に核の距離を測定します、最小距離を視覚化outline.To回転楕円体の端にセル重心から黄色、排他的に緑と赤の排他的集団から（ 'に関する'で見つかった）距離を測定するからであるべきです最寄りのスフェロイドエッジのセルには、フィードバックのオプション（測定>フィードバックオプション>関係）における関係タブでshow距離をオンにします。
12. プロトコルを保存します。このプロトコルは、測定値を使用して他の画像に再適用することができる> protocolコマンドを復元します。
13. 測定項目（測定>測定項目を作成します）を作成します。データ分析を用いて分析することができます機能。
    1. 測定項目で分析]タブに移動します。 Analysisメニューに移動します（分析>分析）とcountでまとめ、人口が主催する、（緑や黄色、赤、）セル重心から回転楕円体のエッジに最小距離を分析します。
    2. エッジから一定の距離で見られる細胞の数をカウントするには、フィルタ（分析>フィルタ）を作成します。 図2の最小距離のためのフィルタは、ヘキストの浸透に基づいている（例えば、最小距離は「外側」の人口を与える80未満です）。また、さらなる分析のためにスプレッドシートに生データをエクスポートします。

結果

腫瘍スフェロイドを生成するいくつかの方法は、このプロトコルは、細胞は、寒天またはアガロース^3,7,9上で培養された非接着性成長法を使用して、存在する。 図1は、寒天上の3日後、C8161メラノーマ回転楕円体の一例を示す図です。 C8161スフェロイドは500の直径との定期的なサイズのスフェロイド形成 - 600μmで3日後（= 565、SD = 19、n = 3の平均値）。スフェロイドを形成?...

ディスカッション

半自動画像解析は、回転楕円体の内側G1逮捕領域を同定し、そして外層の増殖。この方法は、これらの異なる領域で（免疫蛍光により）、細胞周期が、マーカー発現しないだけの変化を識別するために、光学部を使用して、ライブスフェロイドに、または一定の回転楕円体のセクションで使用され、細胞死、または細胞の形態であってもよいです。異なる回転楕円体領域内の細胞の運動性も?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Hoechst 33342	Life Technologies	H3570
agarose low melting point	Life Technologies	16520-050	For sectioning
noble agar	Sigma	A5431	For making spheroids
agarose for spheroids	Fisher Scientific	BP1356-100	For making spheroids
0.05% trypsin/EDTA	Life Technologies	25300-054
HBSS	Life Technologies	14175-103
10% formalin	Sigma	HT5014-1CS	CAUTION: Harmful, corrosive. Use Personal Protective Equipment, do  not breath fumes (open in a fume cupboard).
live/dead near IR	Life Technologies	L10119
vibratome	Technical Products International, Inc
coulture cup	Thermo-Fisher Scientific	SIE936	Mold for sectioning spheroids
hemocytometer	Sigma	Z359629
96-well tissue culture plate	Invitro	FAL353072
collagenase	Sigma	C5138
confocal microscope	Leica	TCS SP5
Flow cytometer analyser	Becton Dickinson	LSRFortessa
volocity	PerkinElmer		Imaging software
flowjo	Tree Star		Flow cytometry software
Vaccuum grease	Sigma	Z273554
Mounting media	Vector Laboratories	H1000
FUCCI (commercial constructs)	Life Technologies	P36238	Transient transfection only
Cell strainer 70 μm	In Vitro	FAL352350
Round bottom 5 ml tubes (sterile)	In Vitro	FAL352003
Round bottom 5 ml tubes (non-sterile)	In Vitro	FAL352008