ניתוח מבוסס Cytometry Imaging- והזרימה של עמדת תא ומחזור התא בSpheroids מלנומה 3D

Summary

We describe two complementary methods using the fluorescence ubiquitination cell cycle indicator (FUCCI) and image analysis or flow cytometry to identify and isolate cells in the inner G1 arrested and outer proliferating regions of 3D spheroids.

Abstract

Three-dimensional (3D) tumor spheroids are utilized in cancer research as a more accurate model of the in vivo tumor microenvironment, compared to traditional two-dimensional (2D) cell culture. The spheroid model is able to mimic the effects of cell-cell interaction, hypoxia and nutrient deprivation, and drug penetration. One characteristic of this model is the development of a necrotic core, surrounded by a ring of G1 arrested cells, with proliferating cells on the outer layers of the spheroid. Of interest in the cancer field is how different regions of the spheroid respond to drug therapies as well as genetic or environmental manipulation. We describe here the use of the fluorescence ubiquitination cell cycle indicator (FUCCI) system along with cytometry and image analysis using commercial software to characterize the cell cycle status of cells with respect to their position inside melanoma spheroids. These methods may be used to track changes in cell cycle status, gene/protein expression or cell viability in different sub-regions of tumor spheroids over time and under different conditions.

Introduction

spheroids תאיים 3D כבר ידוע כמודל גידול במשך עשרות שנים, אולם זה רק לאחרונה כי הם באים בשימוש נפוץ יותר כמודל במבחנה עבור רבים סרטן מוצק. הם משמשים יותר ויותר במסכי גילוי תרופות תפוקה גבוהה כביניים בין מורכב, יקר ובמודלי vivo זמן רב ופשוט, מודל monolayer 2D העלות הנמוך ^1-6. מחקרים בתרבות 2D לעתים קרובות אינם יכולים להיות משוכפל in vivo. מודלים אליפטית של סוגים רבים של הסרטן יכולים לחקות את מאפייני הצמיחה, רגישות לסמים, חדירת תרופה, אינטראקציות תא-תא, זמינות מוגבלת של חמצן וחומרים מזינים ופיתוח של נמק שראה in vivo בגידולים מוצקים ^6-11. Spheroids לפתח ליבת נמקים, אזור שקט או G1 נעצר מקיף את הליבה, ותאים מתרבים בפריפריה של אליפטית ^7. הפיתוח של אזורים אלהעשוי להשתנות בהתאם לצפיפות התא, שיעור ריבוי והגודל של ¹² אליפטית. זה כבר שיערו כי ההטרוגניות הסלולרית ראתה בתת-אזורים השונים אלה עשויה לתרום לטיפול בסרטן ההתנגדות ^13,14. לכן היכולת לנתח תאים באזורים אלה בנפרד היא קריטית לתגובות סמים גידול הבנה.

מחוון מחזור תא ubiquitination הקרינה המערכת (FUCCI) מבוססת על אדום (Kusabira אורנג '- KO) וירוק (Azami הירוקה - AG) תיוג ניאון של Cdt1 וgeminin, אשר מפורקים בשלבים שונים של מחזור התא ^15. כך גרעין תא מופיע אדום בG1, צהוב בתחילת S וירוק ב/ G2 / M שלב S. אנו מתארים כאן שתי שיטות משלימות הן באמצעות FUCCI לזהות מחזור התא, יחד עם השימוש בתוכנות הדמיה או זרימת דיפוזיה צבע cytometry assay כדי לקבוע אם תאים מתגוררים במרכז G1 נעצר או proliferatin החיצוניטבעת G, והמרחק של תאים בודדים מקצה אליפטית. שיטות אלו פותחו בפרסום הקודם שלנו, שבו הראו כי תאים מלנומה באזורי חוסר חמצן במרכז אליפטית או / ובנוכחות של טיפולים ממוקדים יכול להישאר במעצר G1 לפרקי זמן ארוכים, ויכול מחדש הזן את מחזור התא כאשר תנאים נוחים יותר להתעורר ^7.

Protocol

1. FUCCI התמרה ותרבית תאים

1. התמרה FUCCI
   1. צור שורות תאי יציבות להביע FUCCI בונה mKO2-hCdt1 (30-120) וMAG-hGem (1-100) ¹⁵ באמצעות שיתוף התמרה lentivirus כפי שתואר בעבר ^7.
      הערה: מערכת FUCCI זמינה כעת מסחרי.
   2. צור תת-שיבוטים עם הקרינה בהירה על ידי מיון תא בודד. תאים מיין אחת חיובי עבור שתי AG וKO (צהוב) על ידי תאים מופעלים הקרינה מיון לתוך צלחת 96-היטב כפי שתוארו קודם לכן ^7,16.
2. תרבית תאים מלנומה
   1. תאים מלנומה אנושי תרבות C8161 כפי שתוארו קודם לכן ^7,17.

2. גיבוש 3D ספרואיד (כפי שתואר קודם לכן ^3,9)

1. הכנת צלחת agarose
   1. לפזר agarose 1.5% (או אגר אצילי) בפתרון של האנק מלח מאוזן (HBSS) או buffere פוספט 100 מיליליטרמלוח ד (PBS) על ידי רתחה במיקרוגל במשך 3-5 דקות עם מתערבל. ודא agarose נמס לגמרי.
   2. מייד לוותר על פתרון agarose לכל גם 100 μl לצלחת תרבית רקמת 96-גם-תחתית שטוחה בעזרת פיפטה רבת-ערוצית.
      הערה: Agarose עשוי לחזק בטיפים לאחר תקופה קצרה של זמן, כדי להתגבר על בעיה זו טיפים יש לשנות בין לוחות אם עושה צלחת יותר מאחד agarose.
   3. השאר צלחת 96-היטב על משטח שטוח להקשיח agarose במשך שעה לפחות 1.
2. הכנת תא ושכבה על גבי agarose
   1. לגדל תאים לconfluency כ -80% בבקבוק T75. לשטוף עם 10 מיליליטר של HBSS.
   2. לנתק את התאים באמצעות 1.5 מיליליטר של 0.05% טריפסין / חומצת ethylenediaminetetraacetic (EDTA) וגלול ב 10 מיליליטר של מדיום רגיל.
   3. ספירת תאים באמצעות hemocytometer ¹⁸ או שיטת ספירה אוטומטית אחרת.
   4. Resuspend תאים לריכוז סופי של 25,000 תאים / מיליליטר בנורמהבינוני אל.
   5. כיסוי בארות agarose עם 200 μl של ההשעיה התא למספר סופי של 5,000 תאים לכל טוב.
   6. צלחות חזור לתרבית תאי החממה (5% CO ₂ ו -37 ג) כדי ליצור spheroids על כ 3 ימים.
      הערה: הזמן שלוקח כדי ליצור אליפטית משתנה בין שורות תאים שונות. שורות תאים מסוימים לא יוצרות spheroids שימוש בשיטה זו בכל.
   7. מורפולוגיה אליפטית תמונה עם מיקרוסקופ הפוך באמצעות מטרת 4X וסינון לעומת שלב. שורת תאים שיוצרת הצלחה spheroids יפיק אגרגטים קומפקטיים, בערך כדוריים תא, ולא צריך להיות רק אחד אליפטית בכל טוב.
      הערה: אופציונאלי: ברגע שspheroids יצר, הם יכולים להיות מושתלים לקולגן או מטריצה ​​אחרת לניתוח נוסף של צמיחה ופלישה ^3,7,17. כדי להסיר spheroids מקולגן, טיפול עם 500 μl של 2 מ"ג / מיליליטר collagenase על 37 מעלות צלזיוס עד קולגן הוא מומס מספיק לspherOIDs לבוא בחינם לתקשורת (כ -30 דקות). להסיר בעדינות spheroids בעזרת פיפטה 1 מיליליטר.
   8. עבור חתך / הדמיה spheroids התיקון (או מבודד מקולגן או גדל במשך 3-5 ימים בagarose) ב 10% ניטראלי שנאגרו פורמלין (זהירות: יש להשתמש בפורמלין במנדף) לפחות 2 שעות בטמפרטורת חדר (RT) , או הלילה (O / N) ב 4 מעלות צלזיוס. Spheroids עשוי להיות מאוחסן בHBSS על 4 מעלות צלזיוס במשך כמה ימים.

3. ספרואיד חתך vibratome

1. לפזר 5 גרם של נקודת התכה הנמוכה agarose בשל HBSS 100 מיליליטר בבקבוק זכוכית 500 מיליליטר במיקרוגל. השתמש בהגדרת חום בינונית עם מסתחרר. זהירות: שמור את המכסה רופפת כשרותחים הפתרון כך שניתן לשחרר את הלחץ. השתמש בכפפות חסינות חומות מגן כדי להגן על ידיים מכוויות בעת הטיפול בבקבוק הזכוכית החמה.
2. חכה עד agarose מתקרר מעט - כך את הבקבוק ניתן נגע בלי לשרוף את הידיים.
3. יוצקים approximately 2 מיליליטר של agarose לתחתית כוס דלפק קולטר או תבנית פלסטיק דומה. מייד לשאוב אליפטית קבועה (ראה סעיף 2.2.8) בעזרת פיפטה 1 מיליליטר בנפח הקטן ביותר של נוזל אפשרי. להוסיף אליפטית לagarose. כמה spheroids (עד 10) ניתן להוסיף לכל כוס.
4. מכסה את spheroids עם 2 מיליליטר יותר של agarose. לעשות את זה מהר, כדי למנוע את התקשות agarose לפני השכבה השנייה הוא הוסיפה.
5. אפשר agarose להקשיח ב RT בחושך במשך לפחות 3 שעות. בכוסות שלב זה עשויה להיות מאוחסן לזמן קצר על 4 מעלות צלזיוס עם 2-3 מיליליטר של HBSS מעולף על מנת למנוע התייבשות.
6. הסר agarose מהכוס. חתוך את agarose המכיל את spheroids כך שיתאים אל גוש מתכת vibratome, וspheroids קרוב לחלק העליון של agarose. ניתן לראות spheroids כאובייקטים לבנים קטנים בתוך agarose. סופר דבק agarose לבלוק.
7. מלא את vibratome עם מים מזוקקים והר הבלוק בvibratome. הגדר אתvibratome לחתוך 100 מיקרומטר סעיפים באמצעות מהירות נמוכה (הגדרה 2) ורטט גבוה (הגדרה 8). הגדר את זווית להב חיתוך עד 16 מעלות. הפעל vibratome ב, להדליק את אור vibratome ולחתוך חלקים מהחלק העליון של agarose עד 100 מיקרומטר סעיפי אליפטית נחתכים. הנח סעיפי אליפטית לחתוך לHBSS בצלחת 24 גם.
8. בחר סעיפי אמצע לניתוח תמונה. חלקי הר בשקופיות על ידי העברה השטוחה סעיף לשקופית באמצעות פינצטה. מלא חבית מזרק 10 מיליליטר עם גריז ואקום; להוסיף קו דק של שומן ואקום מסביב לקצוות של הסעיף כדי למנוע תקשורת ההרכבה מהריצה את הקצוות של השקופית ולעזור לאטום את הסעיף תחת coverslip. מכסה את החלק עם הרכבה בינונית וcoverslip. לאטום קצוות של coverslip עם לק. חנות מחליקה על 4 מעלות צלזיוס לפני ההדמיה.

תמונת Confocal 4. רכישה

1. קח תמונת Z-פרוסת סעיף אליפטית FUCCI אמצע באמצעות 10Xאו אובייקטיבי 20X כפי שתואר בעבר ^7. ודא שאין חפיפה או crosstalk מתרחש בין כתום 2 color Kusabira וAzami הירוק. אם משווה ניתוח תמונה בין חלקי אליפטית מרובים, לשמור על כוח הלייזר והגדרות אחרות באותו בין דגימות.

Assay דיפוזיה Hoechst צבע 5. לזרימת מיון

1. העבר את spheroids החי (3-5 ימים לאחר זריעת agarose) לצינור 15 מיליליטר. בואו הכבידה spheroids ליישב לתחתית של התחתית. כמה spheroids עלול להיות מוכתם לכל צינור. יש צורך בכ 20 spheroids כדי לקבל מספרים סלולריים מספיקים לcytometry זרימה.
2. הסר בינוני עודף ולהוסיף 1 מיליליטר של 10 מיקרומטר Hoechst מדוללים במדיום רגיל. דגירה spheroids על 37 מעלות צלזיוס למשך כ 1 שעה. השתמש מצליף עדין לresuspend spheroids פעם או פעמיים במהלך דגירה.
   הערה: זמן הדגירה יכול להיות מגוון לשנות כמה רחוק צבע Hoechst חודר לתוך spheroids. זה ישתנה בהתאם לגודל אליפטית, צפיפות וקו סלולארי. עבור חלק גדול spheroids / צפוף ייתכנו חדירת צבע מרבי שהיא פחות מ -100%.
3. שטוף את spheroids בעדינות עם 5 מיליליטר של HBSS באמצעות שיקוע כובד.
   1. אופציונאלי: עבור הדמיה של חדירת צבע: תקן spheroids עם 10% ניטראלי שנאגרו פורמלין לפחות שעה 2 ב RT או O / N ב 4 ° C. הכן חלקי vibratome, הר בשקופיות ותמונה על confocal כפי שתואר בשלבים 3 ו -4 לעיל.
4. כדי להכין תאים לcytometry זרימה, trypsinize spheroids עם 1 מיליליטר של 0.05% טריפסין / EDTA על 37 מעלות צלזיוס למשך כ 30 דקות עם מצליף כל 10 דקות כדי לשבור את spheroids בנפרד.
   הערה: Spheroids קשה להיכנס להשעית תא בודדת, תנאים עשויים צריכים להיות מותאמים. כדאיות של C8161 הישן spheroids 4 יום לאחר תהליך זה היא כ -95%.
5. תאי כתם עם חיות קרובה אינפרא אדום / כתם מת על פי פרוטוקול היצרנים. לשטוף עם HBSS לאחר מכן לתקן עם 1מיליליטר של 10% ניטראלי שנאגרו פורמלין לכ 30 דקות. תאים עשויים להיות מאוחסנים בHBSS על 4 מעלות צלזיוס במשך כמה ימים לפני ניתוח תזרים.

6. ניתוח תזרים Cytometry של Hoechst Spheroids FUCCI יטראז

1. תאים להבטיח לא בכבדות יחד על ידי עובר אותם דרך מסננת תא. Resuspend Hoechst המוכתם spheroids FUCCI בשטיפת קרח קר FACS (PBS עם 5% עגל סרום עוברי) בריכוז של 1-5 x 10 ⁶ תאים / מיליליטר. העבר את 200 μl של מדגם 5 מיליליטר עגול צינורות תחתון.
2. הכן את דגימות בקרת צבע אחד הבאה כמתואר ב6.1: תאים מלנומה מוכתם האו"ם; תאים מלנומה חסיד מוכתמים עם מיקרומטר Hoechst 10 עבור שעה 1; Azami הירוק מביע רק תאים מלנומה; וKusabira אורנג להביע רק תאים מלנומה.
   הערה: בקרות צבע יחידה עשויות להיות קבועות בפורמלין ומאוחסנות בFACS לשטוף עם 0.1% נתרן יזיד ב 4 מעלות צלזיוס במשך שבועות או אפילו חודשים.
3. השעיות תא בודדות לרוץ oזרימת na cytometry מנתח עם לייזרים מתאימים וצבע אחד / בקרה בלא כתם כמו בעבר תיארה ^7,16.
4. השתמש בתוכנת cytometry מסחרית כגון FlowJo לנתח הפנימי לעומת תאי אליפטית חיצוניים כדלקמן:
   1. להסיר פסולת על ידי gating על אוכלוסיית התאים העיקרית באור קדימה פזורים (FSC) לעומת אור צד פזורים (SSC).
   2. הסר כפילויות על ידי gating על תאים בודדים באמצעות FSC (אזור) לעומת FSC (גובה)
   3. שער לתאי חיים על ידי gating על האוכלוסייה החי / המתה הנמוכה.
   4. הגדר Hoechst תאים גבוהים, מגודר המבוסס על האיתות החיובית מהתאים חסיד מוכתמים בHoechst, כמו תאים "חיצוניים".
   5. להגדיר תאים נמוכים או שליליים Hoechst, מגודר המבוסס על האות מהשליטה מוכתמת האו"ם, כמו תאים "פנימיים".
   6. לאחר gating לאוכלוסיות הפנימיות וחיצוניות, תאים עשויים להיות מגודר נוסף לאדום FUCCI (G1), (S המוקדם) הצהוב, ירוק (S / G2 / M) או (G1 המוקדם) השלילי.
      הערה: Compensation באמצעות פקדי צבע אחד עשוי להידרש להגדיר כראוי האוכלוסיות אדומות, צהובות, ירוקות ושליליות FUCCI.
5. ברגע שassay כבר מותאם וחדירת Hoechst תוקף באמצעות מיקרוסקופיה confocal, לרוץ תאים ללא תיקון על סדרן תא זרימה כפי שתואר לעיל ^7,16 לניתוח נוסף של תת-אוכלוסיות תאים חיים.

ניתוח 7. תמונה של סעיפים FUCCI ספרואיד

1. למשל תוכנה פתוחה. Volocity, לבחור את התצורה רק Quantitation.
2. יצירת ספרייה חדשה. לייבא את קובץ תמונת confocal אליפטית FUCCI לתוך התוכנה על ידי גרירת קובץ נתונים הגולמי מconfocal לספרייה. לחלופין, השתמש בפקודת File> Import.
3. עבור לכרטיסיית המדידות לבנות פרוטוקול ניתוח תמונה. הפרוטוקול נבנה על ידי גרירה ושחרור את הפקודות המתאימות בסדר הנכון כדלקמן בחלון הפרוטוקול.
4. מצא objרישומם בערוץ הירוק: גרור את הפקודה למצוא החפצים (שנמצאה ב'מציאת ') לתוך חלון הפרוטוקול, בחר את הערוץ הנכון באובייקטים למצוא protocol.Add הפקודה פתוחה (שנמצאה ב'עיבוד'), ואז אובייקטים נוגעים ללב נפרד הפקודה (נמצאה ב'עיבוד '- זה יהיה להפריד תאים). תכלול אובייקטים לפי גודל <50 מיקרומטר (נמצא ב'סינון '- זו לא תכלול אובייקטים בלתי תאיים קטנים).
   הערה: משתנה כמו למצוא חפצי סף, מספר החזרות פתוחות, בגודל של אובייקטים להיות מופרד והגודל של אובייקטים שלא לכלול חייב להיות מותאם באופן ידני עד מסכות האובייקט להתאים את התמונה.
5. מצא את האובייקטים במסלול האדום: חזור למצוא חפצים כאמור לעיל למסלול האדום. פרוטוקולים ירוקים ואדומים ייתכן שיצטרכו להיות מותאמים בנפרד.
   הערה: בשל גרעינים להיות בG2, גרעינים ירוקים הם לעתים קרובות מעט גדולים יותר.
6. לאשר אובייקטים מצאו מדויקים: לאשר אדום ואובייקטים ירוקים להתאיםגרעינים אדומים וירוקים בתמונה על-ידי כיבוי ועל הערוצים הירוקים ואדום (באמצעות להסתיר או להציג פקודת הערוץ) תוך הצגת המסכות האדומות וירוקות שנמצאו על ידי הפרוטוקול. אפשרויות משוב (מדידות> אפשרויות משוב) ניתן להשתמש כדי לשנות את המראה של מסכות האובייקט.
7. מצא את האובייקטים צהובים (תאי שלב S המוקדם): כדי למצוא תאים צהובים, להוסיף מצטלבים אדום עם התאים ירוקים פקודה (נמצא ב'שילוב '). תכלול אובייקטים לפי גודל (<50 מיקרומטר, שנמצאו ב'סינון ') שלא לכלול את כל אובייקטים בלתי תאיים קטנים.
8. מצא את האובייקטים באופן בלעדי אדומים (תאי שלב G1): כדי למצוא גרעינים באופן בלעדי אדומים, להפחית את התאים הצהובים מהתאים האדומים (שנמצאו ב'שילוב '). תכלול אובייקטים לפי גודל <50 מיקרומטר, (נמצא ב'סינון ') כדי להסיר כל חפצים בלתי תאיים קטנים שנוצרו.
9. מצא את האובייקטים באופן בלעדי ירוקים (תאי שלב S / G2 / M): חזור למסלול הירוק למצוא באופן בלעדי ירוק.
   לאטה: אם יש עדיין אובייקטים בלתי תאיים שנותרו, פקודת אוכלוסיית מסנן ניתן להוסיף לפרוטוקולים בלעדיים הירוקים או האדומים בלעדיים (שנמצאו ב'סינון ') כדי לשמור רק אובייקטים עם גורם צורה גדול יותר מאשר 0.25. הפעולה זו תסיר את האובייקטים שאינם מעגליים.
10. מצא את המתווה אליפטית: מצא את המתווה אליפטית באמצעות למצוא חפצי הפקודה (נמצאה ב'מציאת ') עם המסלול הירוק או אדום (לפיה יש יותר תאים מסביב לקצה של אליפטית). סף נמוך בהרבה (שנמצא בלמצוא חפצים משתנה) יצטרך להשתמש בהם כדי למצוא את המתווה אליפטית בהשוואה לתאים בודדים.
    1. השתמש בפקודה קרובה להצטרף לאובייקטים (שנמצאו ב'עיבוד '), ולאחר מכן למלא חורים בחפצים (שנמצאו ב'עיבוד'), ולאחר מכן להשתמש במסנן עדין (שנמצא ב'סינון ') להסיר רעש מאובייקטים. לבסוף, להוציא חפצים לפי גודל כדי להסיר אובייקטים קטנים <30,000 מיקרומטר (תלוי בגודל אליפטית).
       הערה: פרוטוקול זה צריך להיות מותאם באופן ידני עד המתווה אליפטית היא מדויקת. ניתן להשתמש גם בתמונה brightfield - אולם זה הוא בדרך כלל פחות מדויק עם סעיף אליפטית, ופקודת היפוך (שנמצאה ב'שילוב ') צריך להיות בשימוש.
11. למדוד מרחקים של גרעינים למתווית אליפטית: מרחקים מדוד (שנמצאו ב'בדבר ') מהאוכלוסיות הצהובות, באופן בלעדי ירוקות ואדומות באופן בלעדי מcentroid התא לקצה אליפטית outline.To לדמיין את המרחקים המינימליים, שאמורה להיות מ תא לקצה אליפטית הקרוב, להפעיל מרחקי מופע בכרטיסיית מערכות יחסים באפשרויות משוב (מדידות> אפשרויות משוב> יחסים).
12. שמור את הפרוטוקול. פרוטוקול זה עשוי להיות מחדש מיושם לתמונות אחרות באמצעות המדידות> שחזור פקודת הפרוטוקול.
13. ליצור פריט מדידות (מדידות> הפוך פריט מדידה). הנתונים ניתן לנתח באמצעות הניתוחפונקציות.
    1. עבור לכרטיסיית הניתוח בפריט המדידות. לכו לתפריט ניתוח (ניתוח> ניתוח) ולנתח את המרחק המינימאלי מcentroid התא (האדום, ירוק או צהוב) עד לקצה אליפטית, סיכם על ידי ספירה ומאורגנת על ידי אוכלוסייה.
    2. לספור את מספר התאים הנמצאים במרחק מסוים מהקצה ליצור מסנן (ניתוח> סינון). המסנן למרחק מינימאלי באיור 2 מבוסס על חדירת Hoechst (למשל מרחק מינימאלי הוא פחות מ -80 נותן אוכלוסייה "החיצונית"). לחלופין, יצוא נתונים גולמיים לגיליון אלקטרוני לניתוח נוסף.

תוצאות

ישנן מספר שיטות של ייצור spheroids גידול, פרוטוקול זה משתמש בשיטת הגידול שאינו חסיד, שבו תאים בתרבית על אגר או ^3,7,9 agarose. איור 1 מציג דוגמא של מלנומה אליפטית C8161 לאחר 3 ימים על אגר. spheroids C8161 יוצר spheroids בגודל רגיל בקוטר של 500-600 מיקרומטר (ממוצע = 565, SD = 19, n = 3) לאחר 3 ימי...

Discussion

ניתוח תמונה חצי-אוטומטי זיהה את אזור G1 נעצר הפנימי אליפטית, ומתרבה שכבות חיצוניות. שיטה זו עשויה לשמש בspheroids החי באמצעות סעיף אופטי, או בסעיפים אליפטית קבועים, לזהות שינויים בלא רק מחזור התא אבל ביטוי סמן (באמצעות immunofluorescence), מוות של תאים, או מורפולוגיה של תאים באזורים ...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Hoechst 33342	Life Technologies	H3570
agarose low melting point	Life Technologies	16520-050	For sectioning
noble agar	Sigma	A5431	For making spheroids
agarose for spheroids	Fisher Scientific	BP1356-100	For making spheroids
0.05% trypsin/EDTA	Life Technologies	25300-054
HBSS	Life Technologies	14175-103
10% formalin	Sigma	HT5014-1CS	CAUTION: Harmful, corrosive. Use Personal Protective Equipment, do  not breath fumes (open in a fume cupboard).
live/dead near IR	Life Technologies	L10119
vibratome	Technical Products International, Inc
coulture cup	Thermo-Fisher Scientific	SIE936	Mold for sectioning spheroids
hemocytometer	Sigma	Z359629
96-well tissue culture plate	Invitro	FAL353072
collagenase	Sigma	C5138
confocal microscope	Leica	TCS SP5
Flow cytometer analyser	Becton Dickinson	LSRFortessa
volocity	PerkinElmer		Imaging software
flowjo	Tree Star		Flow cytometry software
Vaccuum grease	Sigma	Z273554
Mounting media	Vector Laboratories	H1000
FUCCI (commercial constructs)	Life Technologies	P36238	Transient transfection only
Cell strainer 70 um	In Vitro	FAL352350
Round bottom 5 mL tubes (sterile)	In Vitro	FAL352003
Round bottom 5 mL tubes (non-sterile)	In Vitro	FAL352008