Imaging- ve Sitometrisi tabanlı Hücre Pozisyonu Analizi ve 3D Melanom küresellerde Hücre Döngüsü

Özet

We describe two complementary methods using the fluorescence ubiquitination cell cycle indicator (FUCCI) and image analysis or flow cytometry to identify and isolate cells in the inner G1 arrested and outer proliferating regions of 3D spheroids.

Özet

Three-dimensional (3D) tumor spheroids are utilized in cancer research as a more accurate model of the in vivo tumor microenvironment, compared to traditional two-dimensional (2D) cell culture. The spheroid model is able to mimic the effects of cell-cell interaction, hypoxia and nutrient deprivation, and drug penetration. One characteristic of this model is the development of a necrotic core, surrounded by a ring of G1 arrested cells, with proliferating cells on the outer layers of the spheroid. Of interest in the cancer field is how different regions of the spheroid respond to drug therapies as well as genetic or environmental manipulation. We describe here the use of the fluorescence ubiquitination cell cycle indicator (FUCCI) system along with cytometry and image analysis using commercial software to characterize the cell cycle status of cells with respect to their position inside melanoma spheroids. These methods may be used to track changes in cell cycle status, gene/protein expression or cell viability in different sub-regions of tumor spheroids over time and under different conditions.

Giriş

Çok hücreli 3D sferoidler ancak birçok katı kanser için bir in vitro model olarak daha yaygın hale gelmiş ancak son zamanlarda, on bir tümör modeli olarak bilinmektedir. Bunlar giderek daha karmaşık, pahalı ve zaman alıcı in vivo modellerde ve basit, düşük maliyetli 2D tek tabakalı modeli ^1-6 arasında bir ara ürün olarak yüksek verimli ilaç keşif ekranlarında kullanılmaktadır. 2B kültüründe çalışmalar genellikle in vivo olarak çoğaltılması mümkün değildir. Birçok kanser tiplerinin Sferoid modelleri büyüme karakteristiklerine, ilaç duyarlılığı, ilaç nüfuzu, hücre-hücre etkileşimi, katı tümörler ^6-11, in vivo görülür oksijen ve besin maddeleri ve nekroz gelişiminin kısıtlı durumu taklit etmek mümkündür. Sferoidler sfero ⁷ periferisinde bir nekrotik çekirdeği, bu çekirdeği soran sakin ya da G1 tutuklandı bölge ve çoğalan hücreleri geliştirme. Bu bölgelerin gelişimiHücre yoğunluğu, proliferasyon hızı ve küremsi ¹² boyutuna bağlı olarak değişebilir. Bu farklı alt bölgelerde görülen hücresel heterojenite kanser tedavisi direnci ^13,14 katkıda bulunabileceği öne sürülmüştür. Bu nedenle, bu bölgelerdeki hücrelerin analiz yeteneği ayrı anlayış tümör ilaç yanıtları için çok önemlidir.

Hücre döngüsünün ¹⁵ farklı aşamalarında bozulmuş olan Cdt1 ve geminin floresan etiketleme, - ve yeşil (AG Azami Green) - floresan ubikitinasyon hücre döngüsü göstergesi (Fucci) sistemi kırmızı (KO Kusabira Turuncu) dayanmaktadır. Böylece hücre çekirdekleri erken S sarı, G1 kırmızı ve S / G2 / M fazında yeşil görünür. Biz burada iki tamamlayıcı yöntemler tarif hem hücreler G1 tutuklandı merkezi veya dış proliferatin ikamet olup olmadığını belirlemek için görüntüleme yazılımı veya tahlil sitometri bir boya difüzyon akışı kullanımı ile birlikte, hücre döngüsünü belirlemek için Fucci kullanarakg halkası ve sfero kenarından tek tek hücrelerin mesafe. Ve / veya hedeflenen terapilerin mevcudiyetinde uzun bir süre için durması G1 kalması mümkün ve yeniden olabilir Bu yöntemler, biz sfero merkezinde hipoksik bölgelerinde bu melanoma hücreleri göstermiştir önceki yayında, geliştirilmiştir daha elverişli şartlar ortaya çıktığında ⁷ hücre döngüsü girin.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protokol

1. Fucci Transdüksiyonu ve Hücre Kültürü

1. Fucci iletimi
   1. Stabil Fucci ifade eden hücre hatları oluşturmak, daha önce ⁷ açıklandığı gibi lentivirüs ko-transdüksiyonunun kullanarak mKO2-hCdt1 (30-120) ve MAG-hGem (1-100) ¹⁵ oluşturur.
      Not: Fucci sistemi şimdi ticari olarak elde edilebilir.
   2. Tek hücreli sıralama ile parlak floresan ile alt klonları oluşturun. Bir 96-yuvalı plaka içine flüoresan aktifleşmiş hücre sıralaması ile AG ve KO (sarı) hem pozitif Sıralama, tek hücreler, daha önce tarif edildiği ^7,16.
2. Melanom hücre kültürü
   1. Kültür C8161 insan melanoma hücresi, daha önce tarif edildiği ^7,17.

2. 3B küre formasyonu (daha önce tarif edilen ^3,9)

1. Agaroz plaka hazırlığı
   1. Hank dengeli tuz çözeltisi (HBSS) veya fosfat Buffere, 100 ml% 1.5 agaroz (ya da asal agar) çözündürünGirdap şeklinde karıştırarak 3-5 dakika süreyle mikrodalgada kaynatılarak d salin (PBS). Agaroz tamamen çözülmüş olduğundan emin olun.
   2. Derhal bir çok kanallı pipet kullanarak, düz tabanlı 96 oyuklu doku kültürü plakası oyuk başına agaroz çözeltisi 100 ul dağıtmak.
      Not: Agaroz, kısa bir süre sonra ipuçları katılaşabilir birden fazla agaroz levhası yapmak, bu sorun, uçları plakalar arasında değiştirilmelidir üstesinden gelmek için.
   3. En az 1 saat süre ile agaroz sertleşmeye düz bir yüzeye 96 oyuklu plaka bırakın.
2. Agaroz üzerine Hücre hazırlanması ve bindirme
   1. T75 şişesi içinde% 80 karışacak hücreleri büyütün. HBSS, 10 ml ile yıkayınız.
   2. Normal ortam, 10 ml% 0.05 tripsin / etilendiamintetraasetik asit (EDTA) ve tekrar süspansiyon 1.5 ml kullanarak hücreleri ayırın.
   3. Hemasitometre ¹⁸ veya diğer otomatik sayım yöntemi kullanılarak hücre sayımı.
   4. Normunda 25.000 hücre / ml'lik nihai bir konsantrasyona kadar yeniden süspanse hücrelerinal ortamı.
   5. Oyuk başına 5000 hücre nihai sayıda hücre süspansiyonu 200 ul agaroz kuyu Yerleşimi.
   6. Hücre kültürü inkübatöründe (% 5 _CO2 ve 37 ° C) geri plakaları üzerinde yaklaşık olarak 3 gün küreler oluşturma.
      Not: bir küremsi oluşturulması için geçen zaman, farklı hücre hatları arasında değişir. Bazı hücre çizgileri de bu yöntemi kullanarak sferoidler oluşturmazlar.
   7. 4x objektif ve bir faz kontrast filtresi kullanılarak bir inverted mikroskop ile görüntü sfero morfolojisi. Başarılı bir şekilde sferoidler, kompakt, kabaca küre şeklindeki hücre agrega üretecek ve oyuk başına sadece bir küremsi olmalıdır oluşturan bir hücre çizgisi.
      Not: İsteğe bağlı: sferoidler oluşturmuşlardır sonra, bu büyüme ve invazyon ^3,7,17 ​​ve daha fazla analiz için kolajen ya da diğer matris içine transplante edilebilir. Kollajen spher için yeterli çözünene kadar 37 ° C 'de 2 mg / ml kollajenaz 500 ul ile tedavi, kollajen sferoidler kaldırmak içinOID'ler medya (yaklaşık 30 dakika) içine serbest gelmek. Yavaşça 1 ml pipet kullanarak parçacıklarının kaldırın.
   8. Kesit için / görüntüleme (kollajen izole edilmiş ya da agaroz üzerinde 3-5 gün için büyütülmüştür olarak)% 10 nötr tamponlu formalin içinde düzeltme sferoidler (DİKKAT: Formol bir çeker ocak kullanılmalıdır), oda sıcaklığında en az 2 saat boyunca (RT) 4 ° C'de ya da gece (O / N). Sferoidler birkaç gün 4 ° C'de HBSS depolanabilir.

3. Sfero Vibratome Kesit

1. Mikrodalgada 500 ml'lik bir cam şişeye HBSS 100 ml düşük erime noktasına sahip agaroz 5 g çözündürülür. Dönen bir orta ısı ayarını kullanın. DİKKAT: Basınç serbest böylece çözüm kaynar zaman gevşek kapağı tutun. Sıcak cam şişe tutarken yanık elleri korumak için koruyucu ısıya dayanıklı eldiven kullanın.
2. Agaroz hafifçe soğuyana kadar bekleyin - bu yüzden şişe elleri yakmadan dokundu edilebilir.
3. Approxima dökünbir Coulter sayacı fincan ya da benzeri plastik kalıp tabanına agaroz tely 2 mi. Hemen sıvı mümkün olan en küçük hacimde 1 ml pipet kullanılarak (bakınız bölüm 2.2.8) sabit sfero aspire. Agaroza sfero ekleyin. (10'a kadar) bir kaç sferoidler fincan başına eklenebilir.
4. Agaroz 2 mi daha fazla parçacıklarının örtün. İkinci katman eklenmeden önce agaroz sertleşmesini önlemek için hızlı bir şekilde yapın.
5. Agaroz, en az 3 saat süreyle karanlıkta oda sıcaklığında sertleşmeye izin verin. Bu noktada bardak 2-3 4 ° C'de kısa bir süre için muhafaza edilebilir HBSS ml su kaybını önlemek için üst üste.
6. Bardaktan agaroz çıkarın. O Vibratome metal blok üzerine oturur ve sferoidler agaroz üstüne yakın şekilde parçacıklarının içeren agaroz Trim. Sferoidler agaroz içindeki küçük beyaz nesneler olarak görülebilir. Süper blok agaroz tutkal.
7. Damıtılmış su ile doldurun ve Vibratome vibratome blok monte edin. Yı kurVibratome düşük hızda (ayar 2) ve yüksek titreşim (8 ayar) kullanarak 100 mikron bölümleri kesmek için. 16 ° kesme bıçağı açısını ayarlayın. , Vibratome aç vibratome ışığını açmak ve 100 mikron sfero kesitler kesilir kadar agaroz üst bölümleri kesmek. 24 oyuklu bir plaka içerisinde HBSS kesilmiş sferoid bölümleri yerleştirin.
8. Görüntü analizi için orta bölümleri seçin. Cımbız kullanarak slayt üzerine bölüm düz transfer ederek slaytlar Mount bölümleri. Vakum yağ ile bir 10 ml'lik bir şırınga gövdesi içinde doldurmak; slayt kenarları kapalı çalışan montaj medya önlemek ve lamel altında bölümüne mühür yardımcı olmak amacıyla bölümünün kenarlarında vakum gres ince bir çizgi ekleyin. Montaj orta ve bir lamel ile bölüm örtün. Oje ile lamel kenarları mühür. Mağaza görüntüleme önce 4 ° C'de slaytlar.

4. Konfokal Resim Alma

1. Bir 10X kullanarak bir orta Fucci küremsi bölümünün z-dilim görüntü almakveya 20X objektif olarak önceden ⁷ nitelendirdi. Çakışma ya da karışma Kusabira ORANGE2 ve Azami Green arasında meydana emin olun. Birden sfero bölümleri arasındaki görüntü analizi karşılaştırarak ise, lazer gücü ve diğer ayarları örnekler arasında aynı tutmak.

Akış Sıralama için 5. Hoechst Dye Difüzyon Deneyi

1. 15 ml tüp canlı parçacıklarının (agaroz tohumlama sonrası 3-5 gün) aktarın. Sferoidler yerçekimi tüpün dibine dinlendiriniz. Birkaç sferoidler tüp başına lekeli olabilir. Yaklaşık 20 sferoidler akış sitometrisi için yeterli hücre sayıları elde etmek için ihtiyaç duyulmaktadır.
2. Aşırı orta çıkarın ve normal ortam içinde seyreltilmiş 10 uM Hoechst 1 ml. Yaklaşık 1 saat boyunca 37 ° C'de inkübe edin parçacıklarının. Inkübasyon sırasında bir veya iki kez parçacıklarının tekrar süspansiyon hafif iterek kullanın.
   Not: Kuluçka süresi Hoechst boya küremsi nüfuz ne kadar değiştirilmesi için değiştirilebilir. Bu göre değişirküremsi boyutu, yoğunluğu ve hücre çizgisi. Bazı büyük / yoğun küremsiler için% 100'den daha az olan maksimum bir boya penetrasyonu olabilir.
3. Gravite çökelmesi ile 5 ml HBSS ile hafifçe sferoidler yıkayın.
   1. İsteğe bağlı: boya penetrasyonu görüntüleme için: 4 ° C'de oda sıcaklığında veya O / N, en az 2 saat boyunca% 10 nötr tamponlu formalin ile parçacıklarının sabitleyin. , Vibratome bölümleri hazırlayın Yukarıdaki adımlarda 3 ve 4'te açıklandığı gibi konfokal slaytlar ve görüntü üzerinde monte edin.
4. Birbirinden sferoidler kırmak için her 10 dakikada bir iterek yaklaşık 30 dakika boyunca 37 ° C'de% 0.05 tripsin / EDTA, 1 ml sitometrisi trypsinize sferoidler akışı için hücreleri hazırlamak için.
   Not: sferoitlerin tek bir hücre süspansiyonu içine almak zor koşullar optimize edilmesi gerekebilir. Bu işlemden sonra C8161 4 günlük küremsi Canlılık yaklaşık 95% 'dir.
5. Üreticilerin protokole göre bir yakın kızıl ötesi canlı / ölü boyası ile Leke hücreleri. Daha sonra, 1 ile düzeltmek HBSS ile yıkayınyaklaşık 30 dakika boyunca% 10 nötr tamponlu formalin mi. Hücreler akış analizden önce birkaç gün süreyle 4 ° C'de HBSS depolanabilir.

Hoechst Lekeli Fucci sferoidlerin 6. Akım Sitometri Analizi

1. Sağlamak hücreler, bir hücre süzgecinden geçirilmesiyle clumped değildir. Hoechst 1-5 x 10 ⁶ hücre / ml'lik bir konsantrasyonda (% 5 fetal dana serumu ile PBS) buz gibi soğuk FACS yıkama Fucci sferoidler lekeli yeniden süspanse edin. Yuvarlak 5 ml alt tüpler numune 200 ul aktarın.
2. 6.1 açıklandığı gibi aşağıdaki tek renk kontrol örnekleri hazırlayın: un lekeli melanoma hücreleri; Yapışkan melanom hücrelerinin 1 saat boyunca 10 uM Hoechst ile boyandı; Azami Green, sadece melanoma hücreleri ifade edilmesi; ve Kusabira Turuncu yalnızca melanoma hücreleri sentezleyen.
   Not: Tek renkli kontrol haftalar ya da aylar boyunca 4 ° C 'de,% 0.1 sodyum azid ile yıkama formalin içinde sabitlenmiş ve FACS depolanabilir.
3. Run tek hücre süspansiyonları oDaha önce olduğu gibi uygun lazerler ve tek renkli / boyanmamış denetimleri ile analizör sitometri na akışı ^7,16 nitelendirdi.
4. Aşağıdaki gibi dış sfero hücreleri vs iç analiz etmek gibi FlowJo gibi ticari sitometri yazılımını kullanın:
   1. İleri Dağınık Işık Yan Dağınık Işık (SSC) karşı (FSC) ana hücre popülasyonu üzerinde yolluk pislikleri temizleyin.
   2. FSC vs FSC (Alan) (Yükseklik) kullanan tek hücreler üzerinde yolluk çiftleri kaldır
   3. Canlı / ölü düşük nüfus yolluk canlı hücreler için Kapısı.
   4. Hoechst "dış" hücreleri olarak Hoechst ile boyanmış yapışık hücrelere olumlu sinyale göre kapılı yüksek hücreler, tanımlayın.
   5. "Iç" hücreleri gibi, un-boyanmış kumanda sinyaline dayalı kapılı Hoechst düşük ya da negatif hücreler, tanımlayın.
   6. Iç ve dış nüfusta geçildikten sonra, hücreler daha da Fucci yeşil kırmızı (G1), sarı (erken S), (S / G2 / M) veya negatif (erken G1) için kapı olabilir.
      Not: Ctek renk kontrollerini kullanarak ompensation düzgün Fucci, kırmızı, sarı, yeşil ve negatif popülasyonları tanımlamak için gerekli olabilir.
5. Deney optimize edilmiş ve Hoechst penetrasyon konfokal mikroskopi ile doğrulandıktan sonra, daha önce canlı hücre alt-popülasyonlarının daha fazla analiz için ^7,16 tarif edildiği gibi bir akış hücre sıralayıcı üzerine sabitlenmesi hücrelere çalıştırın.

Fucci Sfero Bölüm 7. Görüntü Analizi

1. Açık yazılım, örneğin. Volocity, miktar tayini SADECE yapılandırmayı seçin.
2. Yeni bir kitaplık oluşturun. Kütüphaneye konfokal ham veri dosyası sürükleyerek yazılımı içine Fucci sfero konfokal görüntü dosyasını içe aktarın. Alternatif olarak, Dosya> İçe Aktar komutunu kullanın.
3. Bir görüntü analizi protokolü oluşturmak için ölçümler sekmesine gidin. Protokol sürükleyip protokol penceresinde aşağıdaki gibi doğru sırayla uygun komutları bırakarak inşa edilmiştir.
4. Obj bulECTS yeşil kanal: find protokol penceresine ('Bulma' bulundu) komutu nesneleri sürükleyin ('Processing' bulunan) bir açık komutu protocol.Add bulmak nesneleri doğru kanal, daha sonra ayrı bir dokunaklı nesneleri seçmek Komut ('Processing' bulundu - Bu hücreleri ayıracak). Boyutu <50 um Nesneleri Hariç Tut ('Filtreleme' bulundu - bu küçük hücresel olmayan nesneleri hariç tutar).
   Not: find eşiği, açık yineleme sayısını nesneleri değişkenler gibi, nesnelerin büyüklüğü ayrılacak ve nesne maskeleri görüntüyü eşleştirmek kadar dışlamak için nesnelerin büyüklüğü elle optimize edilmelidir.
5. Kırmızı kanal nesneleri bulun: Kırmızı kanal için yukarıdaki gibi nesneleri bulmak Tekrar. Yeşil ve kırmızı protokoller ayrı ayrı ayarlanması gerekebilir.
   Not: çekirdekler G2 olmak nedeniyle, yeşil çekirdekler genellikle biraz daha büyüktür.
6. Bulunan nesneleri doğru onaylayın: Kırmızı onaylayın ve yeşil nesneleri maçkapatarak ve protokol tarafından bulundu kırmızı ve yeşil maskeleri görüntülerken (hide veya göstermek kanal komutunu kullanarak) yeşil ve kırmızı kanallarda görüntüde kırmızı ve yeşil çekirdekler. Görüşleri seçenekleri (Ölçümler> Geri Bildirim seçenekleri) nesne maskelerine görünümünü değiştirmek için kullanılabilir.
7. Sarı nesneleri (erken S fazı hücreleri) bul: sarı hücreleri bulmak ('birleştiren' bulundu) komutu yeşil hücreler kırmızı bir Bilgisayar'ı ekleyin. Herhangi bir küçük olmayan hücreli nesneler dışlamak için ('Filtreleme' bulundu <50 mikron) boyutuna göre nesneleri hariç.
8. (G1 faz hücreleri) münhasıran kırmızı nesneleri bulun: ('birleştiren' bulunan) kırmızı hücrelerin sarı hücreler, sadece kırmızı çekirdekleri bulmak çıkartmak için. Oluşturulan küçük hücresel olmayan nesneleri kaldırmak için ('Filtreleme' bulundu) boyutu <50 um, nesneleri hariç tut.
9. Münhasıran yeşil nesneleri (S / G2 / M faz hücreleri) bulun: sadece yeşil bulmak yeşil kanal için tekrarlayın.
   Hayırte: hala kalan hücresel olmayan nesneler varsa, bir filtre nüfus komutu sadece korumak için ('Filtreleme' bulundu) Özel yeşil veya özel kırmızı protokollere eklenebilir 0.25 daha büyük bir şekil faktörü ile nesneleri. Bu dairesel olmayan nesneleri kaldırır.
10. Sfero anahat bul: Bir bulmak kullanarak sfero anahat bulun (sfero kenarında daha hücreleri vardır hangisi) yeşil veya kırmızı kanalı ('Bulma' bulundu) komutu nesneleri. Bir çok alt eşik (find bulunan değişkenleri nesneleri) bireysel hücrelere kıyasla sfero anahat bulmak için kullanılan gerekecektir.
    1. Daha sonra nesneleri gürültü çıkarmak ('Filtreleme' bulunan) ince bir filtre kullanmak, daha sonra ('Processing' bulundu) nesneler delikleri doldurmak ('Processing' bulundu) nesneler katılmak için close komutunu kullanın. Son olarak, küçük nesneleri (sfero boyutuna bağlı olarak) <30,000 um kaldırmak için boyutuna göre nesneleri dahil değildir.
       Not: Bu protokol sfero anahat doğru dek elle optimize edilmesi gerekecektir. Kullanılacak gerekecektir ancak bu genellikle daha az hassas bir sfero bölüm ve ('birleştiren' bulunan) bir ters komutu ile bir - bir aydınlık görüntü de kullanılabilir.
11. Dan olması gereken asgari mesafeler görselleştirmek outline.To sfero kenarına hücre sentroidinden, sarı münhasıran yeşil ve münhasıran kırmızı toplumlarından ('İlişkin' bulundu) Tedbir mesafeleri: sfero anahat çekirdeklerin mesafeleri ölçmek En yakın sfero kenarına hücre, geribildirim seçenekleri (Ölçümler> Geri Bildirim seçenekleri> İlişkiler) 'de ilişkileri sekmesinde gösteri mesafelerde açın.
12. Protokolü kaydedin. Bu protokol Ölçümleri kullanılarak diğer görüntülere yeniden uygulanabilir> protokol komutunu geri yükleyin.
13. Bir ölçümler öğe oluşturun (Ölçümler> Ölçüm Item). Veri analizi kullanılarak analiz edilebilirfonksiyonlar.
    1. Ölçümler kalemindeki analiz sekmesine gidin. Analiz menüsüne gidin (Analiz> Analiz) ve sfero kenarına (yeşil veya sarı kırmızı) hücre sentroidinden, sayı ile özetlenmiş ve nüfus tarafından düzenlenen minimum mesafeyi analiz.
    2. Kenarından belirli bir mesafede bulunan hücrelerin sayısını saymak için bir filtre (Analiz> Filtre) oluşturmak. Şekil 2'de asgari mesafe için filtre (örn asgari mesafe 80 "dış" nüfus verir az olduğu) Hoechst penetrasyon dayanmaktadır. Alternatif olarak, daha fazla analiz için bir elektronik tabloya ihracat ham veri.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Sonuçlar

Tümör parçacıklarının üretilmesi için çeşitli yöntemler bu protokol hücreleri agar veya agaroz ^3,7,9 kültürlenir yapışmayan bir büyüme yöntemi kullanır vardır. 1 agar üzerinde 3 gün sonra, bir C8161 melanoma sfero bir örneğini göstermektedir. C8161 sferoidler 500 çaplı normal büyüklükte sferoidler oluştururlar - 600 mikron 3 gün sonra (= 565, SD = 19, n = 3 ortalama). Sferoidler oluşturacak diğer melanoma hücre hatları şunlardır: WM793, ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Tartışmalar

Yarı otomatik bir görüntü analiz sferoid iç G1 tutuklandı bölgeyi tanımladık ve dış tabakalar çoğalan. Bu yöntem, bir optik bölümünde kullanılarak canlı küremsiler de kullanılabilir, ya da sabit küremsi bölümlerde, bu farklı bölgelerde hücre döngüsü, ancak (immünofloresan ile) belirteç ekspresyonu, hücre ölümü veya hücre morfolojisi, sadece değişiklikleri tespit etmek. Farklı sfero bölgeler içinde hücre motilitesi de sayısal olabilir - hücre izleme görüntü analizi aşamas?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Hoechst 33342	Life Technologies	H3570
agarose low melting point	Life Technologies	16520-050	For sectioning
noble agar	Sigma	A5431	For making spheroids
agarose for spheroids	Fisher Scientific	BP1356-100	For making spheroids
0.05% trypsin/EDTA	Life Technologies	25300-054
HBSS	Life Technologies	14175-103
10% formalin	Sigma	HT5014-1CS	CAUTION: Harmful, corrosive. Use Personal Protective Equipment, do  not breath fumes (open in a fume cupboard).
live/dead near IR	Life Technologies	L10119
vibratome	Technical Products International, Inc
coulture cup	Thermo-Fisher Scientific	SIE936	Mold for sectioning spheroids
hemocytometer	Sigma	Z359629
96-well tissue culture plate	Invitro	FAL353072
collagenase	Sigma	C5138
confocal microscope	Leica	TCS SP5
Flow cytometer analyser	Becton Dickinson	LSRFortessa
volocity	PerkinElmer		Imaging software
flowjo	Tree Star		Flow cytometry software
Vaccuum grease	Sigma	Z273554
Mounting media	Vector Laboratories	H1000
FUCCI (commercial constructs)	Life Technologies	P36238	Transient transfection only
Cell strainer 70 μm	In Vitro	FAL352350
Round bottom 5 ml tubes (sterile)	In Vitro	FAL352003
Round bottom 5 ml tubes (non-sterile)	In Vitro	FAL352008