Glaucoma de inducir en un Procedimiento<em&gt; En Vivo</em&gt; Modelo de rata y Todo el montaje-Retina Preparación

Resumen

Glaucoma is characterized by damage to retinal ganglion cells. Inducing glaucoma in animal models can provide insight into the study of this disease. Here, we outline a procedure that induces loss of RGCs in an in vivo rat model and demonstrates the preparation of whole-mount retinas for analysis.

Resumen

El glaucoma es una enfermedad del sistema nervioso central que afecta a las células ganglionares de la retina (CGR). RGC axones que forman el nervio óptico llevan la información visual al cerebro para su percepción visual. El daño a la CGR y sus axones conduce a la pérdida de la visión y / o ceguera. Aunque la causa específica del glaucoma es desconocido, el principal factor de riesgo para la enfermedad es una presión intraocular elevada. procedimientos de inducción de glaucoma en modelos animales son una herramienta valiosa para los investigadores que estudian el mecanismo de la muerte de CGR. Dicha información puede conducir al desarrollo de tratamientos neuroprotectores eficaces que podrían ayudar en la prevención de la pérdida de la visión. El protocolo en este documento se describe un método para inducir el glaucoma - al igual que las condiciones en un modelo de rata in vivo en 50 l de 2 M de solución salina hipertónica se inyecta en el plexo venoso epiescleral. El blanqueo de los vasos indica inyección con éxito. Este procedimiento provoca la pérdida de la CGR para simular el glaucoma. Un mes siguienteinyección, los animales son sacrificados y los ojos son removidos. A continuación, la córnea, el cristalino y vítreo se retiran para hacer una ojera. La retina se desprende entonces de la parte posterior del ojo y inmovilizó en placas de Sylgard con agujas de cactus. En este punto, las neuronas de la retina se pueden teñir para su análisis. Los resultados de esta práctica de laboratorio muestran que aproximadamente el 25% de la CGR se pierden dentro de un mes del procedimiento en comparación con los controles internos. Este procedimiento permite el análisis cuantitativo de la muerte de células ganglionares de la retina en un modelo de rata in vivo glaucoma.

Introducción

El glaucoma es un grupo de enfermedades oculares que afectan a las neuronas de la retina, en concreto, las células ganglionares de la retina ^1-2. Los axones de estas células convergen para convertirse en el nervio óptico lleva la información visual al cerebro donde se percibe la visión. El daño a la CGR y sus axones, por tanto, causa defectos visuales.

Las características principales asociados con trastornos de glaucoma son RGC degeneración y la muerte, aumento de la presión intraocular (IOP), y cupping disco óptico y atrofia. Estas características conducen a la pérdida del campo visual o completa, la ceguera irreversible. En la actualidad, el glaucoma ha causado la ceguera en 70 millones de personas en el mundo ^3. Como tal, es la tercera mayor causa mundial de ceguera ^4.

Se desconoce el mecanismo exacto de la muerte de CGR en el glaucoma. Muchas investigaciones se han hecho para resolver el misterio. Se sabe, sin embargo, que el principal factor de riesgo de glaucoma es un aumento in de la presión intraocular debido a la circulación irregular de humor acuoso (AH) en la cámara anterior del ojo. AH actúa como reemplazo transparente e incoloro para la sangre en la cámara anterior avascular del ojo. Nutre las células circundantes, elimina los productos de desecho secretados a partir de los procesos metabólicos, transporta los neurotransmisores, y permite la circulación de drogas y células inflamatorias dentro del ojo durante los estados patológicos ^1.

El mantenimiento de la circulación del humor acuoso implica el cuerpo ciliar y la malla trabecular. El humor acuoso es producido por el cuerpo ciliar. A continuación, fluye en la cámara anterior para mantener la salud general del tejido ocular. 75 a 80% de salida de humor acuoso es secretado activamente a través de epitelio ciliar no pigmentario cuando el fluido se filtra a través de tres capas de tejido esponjoso en el músculo ciliar. Las salidas de fluido a través de la malla trabecular y a través del canal de Schlemm, que adelantarseIES en el sistema sanguíneo ⁵ .El restante 20 a 25% del flujo de salida pasa por la malla trabecular y se pasivamente secretadas por ultrafiltración y difusión a través de la vía uveo-escleral. Esta vía parece ser relativamente independiente de la presión intraocular ^1.

Cuando la producción de humor acuoso y la salida están fuera de equilibrio, aumenta la presión dentro del ojo. Como se ha indicado, este aumento de la presión intraocular es el principal factor de riesgo en el desarrollo de glaucoma. Esta presión causa daño a las intrincadas capas de neuronas de la retina en la parte posterior del ojo. El daño a los axones de las células ganglionares de la retina del nervio óptico hace que el cerebro ya no recibe información visual precisa. Como resultado, la percepción de la visión se pierde y se puede producir ceguera completa.

Hasta la fecha, no existe una cura para el glaucoma. Existen diferentes métodos de tratamiento que principalmente tienen como objetivo reducir la presión intraocular. Estos incluyen la administración tópicaclases de medicamentos tales como bloqueadores de los receptores beta1-adrenérgicos, o análogos de las prostaglandinas tópicas. Los bloqueadores beta reducen la presión intraocular al disminuir la producción de humor acuoso ^7. Las prostaglandinas función para reducir la PIO mediante el aumento del flujo de salida de humor acuoso ^8-14. agonistas adrenérgicos alfa y los inhibidores de la anhidrasa carbónica se utilizan también como métodos secundarios de tratamiento. Agonistas alfa adrenérgicos aumentan flujo de salida a través de la vía uveoescleral ^15-17. Inhibidores de la anhidrasa carbónica reducen la producción de AH por la inhibición enzimática ^18. Mucho más procedimientos invasivos también están siendo utilizados para tratar el glaucoma. Trabeculoplastia láser se utiliza para aumentar el flujo de salida del humor acuoso ^19. Otra terapia quirúrgica, llamada trabeculectomía, crea un sitio de drenaje alternativo para filtrar AH cuando la vía trabecular tradicional es bloqueado ^20-21.

Estas opciones de tratamiento han sido conocidos por efcaz reducir la PIO. Sin embargo, hasta el 40% de los pacientes con glaucoma muestran niveles normales de PIO que indican una necesidad de procedimientos terapéuticos más completos. ^22,23 Además, la muerte de células ganglionares de la retina se ve en el glaucoma es irreversible una vez que comienza y los tratamientos actuales no se detienen la progresión de la enfermedad ^24-28. Esto ha puesto de relieve la necesidad de tratamientos neuroprotectores eficaces destinadas a la supervivencia de las neuronas mismas. Desarrollo de modelos de glaucoma es crucial para este desarrollo.

En este estudio estamos demostrando un método de inducir efectos glaucoma-como en ratas Long Evans adultas utilizando un procedimiento modificado descrito originalmente por Morrison ^29. En este procedimiento, las inyecciones de 2 M de solución salina hipertónica en el plexo venoso episcleral induce condiciones glaucoma-como por la cicatrización de tejido para reducir la salida de humor acuoso en la malla trabecular que conduce a un aumento de la presión intraocular y una pérdida significativa de CGR wentro de un mes tras el procedimiento ^30-31. procedimientos de inducción de glaucoma, tales como la descrita aquí, puede ser la clave para desbloquear los nuevos avances en los tratamientos para el glaucoma.

Protocolo

Todos los procedimientos que utilizan los sujetos animales han estado de acuerdo con las normas del Instituto de Cuidado de Animales y el empleo Comisión (IACUC) de la Universidad de Western Michigan.

1. Los animales

1. Usar ratas macho y hembra de 3 meses de edad en este estudio.
2. Mantener a los animales en un ciclo de 12 horas de luz / oscuridad, con acceso libre a comida y agua.

2. Preparación de KAX Cocktail para anestesia animales

1. Disolver 50 mg de xilazina (20 mg / ml) en 5 ml de ketamina (100 mg / ml) con 1 ml de acepromazina (10 mg / ml) y 3 ml de agua destilada. Mezclar bien.
2. Esterilizar con un filtro de jeringa y almacenar esta solución en una botella de suero de 10 ml.

3. Inyección KAX

1. Pesar animales (g) y volver a la jaula hasta que esté listo para la inyección.
2. Inyectar 0,1 ml KAX / 100 g de peso corporal de los animales por vía intraperitoneal, usando una jeringa de 1 ml de insulina con una aguja de 28 G.
3. Permitirpara animales de pérdida de conocimiento. Compruebe reflejos pellizcando los pies y la cola.
4. Mantenga todos los animales de forma segura en el laboratorio para la duración de la cirugía.
5. Después de la cirugía, en lugar de los animales en sus jaulas y se mantiene cómodo en TA hasta que se recupere la conciencia. Sólo los animales regresar a las instalaciones cuando los animales se despiertan y reanudar un comportamiento normal.

4. Preparación para la cirugía y la Asamblea de Microneedle

1. Hacer una solución estéril 2 M NaCl.
2. Al usar un extractor de microelectrodos (Figura 1C) para tirar de un diámetro interior de 0,86 mm estándar de pulido pesado y tubo de borosilicato de pared fina en dos microagujas de vidrio finamente cónicos (Figura 1D, 1E Figura).
3. Rellene una microaguja de la etapa anterior con 2 M de solución salina usando una aguja de jeringa de relleno y una jeringa de 1 ml (Figura 1B). Toque las burbujas de aire de la punta del electrodo.
4. Llene una segunda jeringa de 1 ml con 2 MNaCl. Conectar una aguja de 18 G y luego coloque una longitud (aproximadamente 10 pulgadas) de tubo de polietileno (Figura 1A). Utilice el émbolo de la jeringa para llenar el tubo de polietileno con solución salina a través de la aguja.
5. Cuando tanto la microaguja y el tubo se llena con solución salina, conecte cuidadosamente los dos. Eliminar el aire en la conexión entre ellos (Figura 2).
6. Finamente biselar la punta de la microaguja raspando muy a la ligera a contrapelo de una toalla de papel por supuesto.
7. Comprobar la resistencia de la microaguja empujando suavemente el émbolo de la jeringa hasta que un fino chorro de líquido se puede ver en la toalla de papel. La corriente de líquido no debe ser más ancha que 0,5 mm.

5. Preparación de los Animales

1. Aplicar 1 - 2 gotas de anestesia tópica a la córnea (Proparacaína Solución Oftálmica clorhidrato, USP, 0,5%). Esperar hasta que se produzca ningún reflejo ocular.
2. Recortar los bigotes con unas tijeras.
3. Saturate un aplicador con punta de algodón con solución de betadine y el área hisopo alrededor del ojo experimental.
4. Usando un microscopio, adjuntar una pinza hemostática para sujetar el párpado inferior para sobresalir del ojo, exponer la vena episcleral y restringir el movimiento de los ojos. (Figura 3, punta de flecha)

6. Glaucoma inductor de inyección de solución salina

1. Cuando se preparan el conjunto de microagujas y el animal, comenzar las inyecciones.
2. Cuando el animal se confirmó que no responden a la pizca pies / cola, perforar cuidadosamente la vena epiescleral con la microaguja al venir en un ángulo de entre 10 y 20 grados a la vena (Figura 3, flecha blanca). Una punción éxito en la vena es evidente cuando la sangre entra en la punta de la microaguja (Figura 3, flecha negro).
3. Poco a poco y de forma manual inyectar aproximadamente 50 l de solución salina en la vena. Esto debe tomar aproximadamente 10 seg. Las venas se blanquean blanco como la sal circula excelentes referenciasuf la vasculatura (Figura 4, punta de flecha). Algunas regiones pueden mantener una apariencia de glóbulos rojos (Figura 4, flecha).
   1. Realizar una segunda inyección en la vena, frente al sitio de la primera, para asegurar daño en la retina a fondo para la capa de células ganglionares de la retina completa.
      Nota: En cuestión de minutos, uno debería ver un aspecto turbio distinta a través del iris del ojo como la sal circula a través del sistema vascular.
4. Deje el ojo opuesto no tratada para su uso como un control interno.

7. Recuperación de Animales

1. Retire la pinza hemostática.
2. Use un hisopo de algodón para aplicar el ungüento antibiótico triple (bacitracina de zinc, sulfato de neomicina, sulfato de polymysin B) al sitio sujeta por la pinza hemostática y de los puntos de inyección. daño a los tejidos alrededor del ojo no se produce utilizando la pinza hemostática.
3. > Poner a los animales anestesiados en sus jaulas en una manta de agua caliente que circula a prevla hipotermia ent. Mantener a los animales en observación hasta que la conciencia y el comportamiento normal se recuperaron. El transporte de animales despiertos de nuevo a la colonia de animales. Los animales permanecen en la colonia hasta el momento del sacrificio.

8. El sacrificio de animales y la eliminación de la retina

1. Un mes después del procedimiento para inducir el glaucoma, los animales son sacrificados por asfixia con _CO2 y la punción torácica secundaria.
   1. Colocar el animal en la cámara y poner la tapa en forma segura.
   2. Abrir las de CO ₂ y el regulador de gas válvulas para permitir que el 20% de volumen / min _CO2 desplazamiento de oxígeno en la cámara.
   3. Permitir cuatro a 5 min para el animal a punto de expirar.
   4. Desactivar las dos válvulas.
   5. Eliminar los animales de la cámara y realizar una punción torácica secundaria con un bisturí estéril.
2. Después de la eutanasia, utilizar un bisturí para cortar el tejido conectivo en la cavidad orbital que rodea el ojo, being cuidado de no cortar en el propio globo ocular.
3. Con cuidado, usar tijeras de borde curvado para cortar el nervio óptico y cualquier tejido restante para extraer el globo ocular intacta. Coloque globo ocular extraída en un 60 mm x 15 mm placa de Petri estéril desechable que contiene PBS fresca.
4. Hacer una ojera del globo ocular. Para ello, hacer una pequeña incisión con el bisturí justo posterior a la frontera entre el iris y la esclerótica. Siga esta incisión alrededor de la circunferencia del ojo con pequeñas tijeras de primavera para eliminar el hemisferio corneal del globo ocular. El hemisferio conectado al nervio óptico permanece.
5. Encuentra la retina muy fina de color rosa / amarillento dentro del ocular del animal sacrificado. Mantenga la capa pigmentada de la retina con unas pinzas de punta roma para estabilizar la ojera. Utilice otro par de pinzas cerradas para provocar muy suavemente toda la retina intacta fuera de la parte posterior del ojo. Evitar pellizcar, tirar o tirando de la retina directamente.
6. Utilice pequeñas tijeras para cortar la primaveraárea donde el nervio óptico está todavía unido a la retina.
7. Asegúrese de cortar la basura cualquier epitelio pigmentario residual o tejido de la esclerótica de la retina.
8. Usando una pipeta de transferencia, transferir suavemente la retina aislada a una Sylgard recubierto limpia de 35 mm x 10 mm placa de Petri que contiene PBS fresca.

9. Todo el montaje Retina Preparación

1. Una vez en el plato Sylgard, el uso de fórceps y una aguja de cactus para fijar la retina en su lugar. Mantener la capa de células ganglionares de la retina hacia arriba y hacia abajo del nervio óptico. forma hemisférica de la retina es notable, incluso después de la fijación. La curvatura de la retina se podrán curvar hacia el techo cuando la capa de células ganglionares de la retina está en la orientación deseada.
2. Utilice pequeñas tijeras para cortar la retina en cuatro cuadrantes, haciendo la forma de un trébol de cuatro hojas que irradia de la cabeza del nervio óptico.
3. Pin de los cuadrantes de la retina con agujas de cactus adicionales para que la retina lo más plana posible withoestiramiento ut (Figura 5).
4. Fijar las retinas fijadas en el plato Sylgard con 3 ml de paraformaldehído al 4% O / N a temperatura ambiente.

10. tinción de anticuerpos de la Retina

Nota: retinas manchas fijas con anticuerpos primarios y secundarios para la visualización de las neuronas de la retina (Figura 6).

1. Enjuague fijos, retinas montadas en plano tres veces durante 2 minutos cada uno en PBS.
2. Permeabilizar las retinas con 1% de Triton X-100 con suero bovino fetal al 1% en PBS durante 60 min.
3. Enjuague retinas tres veces, 2 minutos cada uno, en PBS.
4. Enjuague dos veces con 0,1% Triton X-100 en PBS, 5 min por lavado.
5. Enjuague dos veces con PBS, 5 minutos por lavado.
6. Incubar con 1% de Triton X-100 y suero bovino fetal al 1% en PBS a temperatura ambiente durante 45 min.
7. Enjuague dos veces con 0,1% Triton X-100 en PBS, 5 min por lavado.
8. Enjuague dos veces con PBS, 5 minutos por lavado.
9. Incubar cada retina en suero bovino fetal 3 ml 1% en PBScon el ratón purificado anti-CD90 de rata / ratón CD90.1 (dilución 1: 300) O / N a temperatura ambiente.
10. Enjuague retinas una vez con 0,1% Triton X-100 en PBS durante 5 min.
11. Enjuague dos veces con PBS, 5 minutos por lavado.
12. Incubar cada retina en 3 ml de PBS (sin FBS) con secundario Alexa Fluor 594 de cabra anti-IgG de ratón (1: 300) O / N a TA.
13. Lávese las retinas con PBS liberalmente.
14. El uso de un microscopio de disección, retirar con cuidado las agujas de cactus de la retina.
15. transferir suavemente retinas en portaobjetos de microscopio con una pipeta de transferencia. Asegúrese de mantener la orientación con la capa de células ganglionares de la retina frente al techo. forma hemisférica de la retina es notable, incluso después de la fijación. La curvatura de la retina se podrán curvar hacia el techo cuando la capa de células ganglionares de la retina está en la orientación deseada.
16. Absorber cualquier exceso de PBS con KIMWIPE u otro material absorbente. Tenga cuidado de no absorber la retina.
17. Añadir 5 gotas de glicerina y ½ ½ PBS en peso como AMmedios ontaje.
18. Cubrir retina con cubreobjetos, evitando las burbujas de aire.
19. cubreobjetos seguro utilizando esmalte transparente de uñas, pegamento u otro adhesivo.

Resultados

Esta sección ilustra los componentes del aparato y el procedimiento utilizado para inducir condiciones glaucoma-como en una rata modelo de glaucoma in vivo. Mostramos las herramientas individuales y el equipo utilizado para realizar una inyección de solución salina hipertónica que provoca un aumento en la presión intraocular. Mostramos la inyección en el plexo venoso epiescleral con su característico efecto de blanqueo y el aspecto turbio de la cámara anterior que result...

Discusión

Este protocolo describe un método para inducir condiciones de glaucoma-como en un modelo de rata in vivo. Este procedimiento utiliza una inyección de solución salina hipertónica para inducir la formación de cicatrices en la malla trabecular ^{29, 32.} El desarrollo de tejido de cicatriz ocluye el flujo de salida de humor acuoso que aumenta la presión en la cámara anterior. Con una disminución de flujo y la presión se acumulan, la lente está suspendido por ligamentos elásticos empuja de nuevo ...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Xylazine hydrochloride, Minimum 99%	Sigma, Life Science	X1251-1G
Ketamine hydrochloride injection, USP, 100mg/ml	Putney, Inc	NDC 26637-411-01	10 ml bottle
Acepromazine Maleate, 10mg/ml	Phoenix Pharmaceutical, Inc	NDC 57319-447-04, 670008L-03-0408	50 ml bottle
Serum bottle, 10 ml	VWR	16171319	Borosilicate glass
1 ml insulin syringe	VWR	BD329410	28 G needle
Sodium chloride	Sigma	S7653	2 M Solution
Microelectrode Puller	Narishige Group	PP-830
Heavy Polished Standard and Thin Walled Borosilicate Tubing	Sutter Instruments	B150-86-10HP	without filament, 0.86 mm
Microfil syringe needle for filling micropipettes	World Precision Instruments, Inc	MF28G
18 gauge Luer-Lock needle	Fisher Scientific	1130421	Syringe needle
Flexible Polyethylene Tubing	Fisher Scientific	22046941	0.034 inch diameter, approximately 10 inches
Proparacaine Hydrochloride Opthalmic Solution, USP, 0.5%	Akorn, Inc	NDC 17478-263-12	15 ml  sterile bottle
Curved Scissors	Fine Science Tools	14061-11
Microscope	Leica	StereoZoom 4
Hemostat Clamp	Fine Science Tools	1310912	curved edge
Triple Antibiotic Ointment	Fisher Scientific	NC0664481
Scalpel handle	Fine Science Tools	10004-13
Scalpel blade #11	Fine Science Tools	10011-00
60 mm x 15 mm Disposable Petri Dish	VWR	351007
Phosphate Buffered Saline 10x Concentrate	Sigma, Life Science	P7059-1L	1x dilution
Spring Scissors	Fine Science Tools	15009-08
Forceps (2), Dumont # 5	Fine Science Tools	11251-30
3 ml Transfer Pipets, polyethylene, non sterile	BD Biosciences	357524 or 52947-948	1 and 2 ml graduations
35 mm x 10 mm Easy Grip Petri Dish	BD Biosciences	351008
Sylgard 184	VWR	102092-312
Cactus Needles
Paraformaldehyde	EMD Millipore	PX0055-3 or 818715.0100	Made into a 4% solution
Triton X-100	Sigma	T9284-100 ml	Made into both a 1% and 0.1% solution
Fetal Bovine Serum	Atlanta Biological	S11150	500 ml
Purified Mouse Anti-Rat CD90/mouse CD90.1	BD Pharmingen	Cat 554892	1:300 dilution
Alexa Fluor 594 goat anti-mouse	Life Technologies	A11005	1:300 dilution
Microscope Slides	Corning	2948-75x25
Glycerol	Sigma	G5516-100 ml	50% glycerol to 50% PBS, by weight
Coverglass	Corning	2975-225	Thickness 1 22 x 50 mm
Confocal Microscope	Nikon	C2 Eclipse Ti