Glaucoma inducono Procedura in un<em&gt; In Vivo</em&gt; Modello di ratto e tutto il montaggio Retina Preparazione

Riepilogo

Glaucoma is characterized by damage to retinal ganglion cells. Inducing glaucoma in animal models can provide insight into the study of this disease. Here, we outline a procedure that induces loss of RGCs in an in vivo rat model and demonstrates the preparation of whole-mount retinas for analysis.

Abstract

Il glaucoma è una malattia del sistema nervoso centrale che colpisce le cellule gangliari retiniche (RGC). assoni RGC che costituiscono il nervo ottico portano input visivo al cervello per la percezione visiva. Danni alle RGCs e ai loro assoni porta alla perdita della vista e / o cecità. Anche se la causa specifica del glaucoma è sconosciuto, il fattore di rischio per la malattia è una pressione intraoculare. procedure di glaucoma che inducono in modelli animali sono uno strumento prezioso per i ricercatori che studiano il meccanismo della morte RGC. Tali informazioni possono portare allo sviluppo di trattamenti neuroprotettivi efficaci che potrebbero essere di aiuto nella prevenzione della perdita della vista. Il protocollo in questo documento descrive un metodo per indurre glaucoma - come condizioni in un modello di ratto in vivo dove 50 ml di 2 M salina ipertonica viene iniettato nel plesso venoso episclerale. Sbiancamento dei vasi indica iniezione di successo. Questa procedura provoca la perdita di RGCs per simulare il glaucoma. Un mese dopoiniezione, animali vengono sacrificati e gli occhi vengono rimossi. Successivamente, la cornea, lenti, e vitreo vengono rimossi per fare un oculare. La retina è poi sfogliato dalla parte posteriore dell'occhio e appuntato su piatti Sylgard utilizzando aghi di cactus. A questo punto, i neuroni della retina possono essere colorati per l'analisi. I risultati di questo laboratorio mostrano che circa il 25% dei RGCs sono persi entro un mese della procedura rispetto ai controlli interni. Questa procedura consente di analisi quantitativa di morte delle cellule gangliari della retina in un modello di topo di glaucoma in vivo.

Introduzione

Il glaucoma è un gruppo di malattie oculari che colpiscono i neuroni nella retina, in particolare, le cellule gangliari retiniche ^1-2. Gli assoni di queste cellule convergono per diventare il nervo ottico che trasportano informazioni visive al cervello in cui viene percepita la visione. Danni alle RGCs e le loro assoni provoca quindi difetti visivi.

Le caratteristiche principali associati a disturbi glaucoma sono RGC degenerazione e la morte, aumento della pressione intraoculare (IOP), e coppettazione disco ottico e atrofia. Queste caratteristiche portano alla perdita del campo visivo o totale, la cecità irreversibile. Attualmente, il glaucoma ha causato la cecità in 70 milioni di persone in tutto il mondo ^3. Come tale, essa è la terza causa mondiale di cecità ^4.

Il meccanismo esatto della morte RGC nel glaucoma rimane sconosciuto. Gran parte della ricerca è stato fatto per svelare il mistero. È noto, tuttavia, che il principale fattore di rischio di glaucoma è un aumento in pressione intraoculare dovuta alla circolazione irregolare di umore acqueo (AH) nella camera anteriore dell'occhio. AH agisce come alternativa trasparente e incolore di sangue nella camera anteriore dell'occhio avascolare. Si nutre le cellule circostanti, rimuove i residui secreti dai processi metabolici, trasporti neurotrasmettitori, e permette la circolazione di farmaci e cellule infiammatorie all'interno dell'occhio durante gli stati patologici ^1.

Il mantenimento della circolazione di umore acqueo coinvolge il corpo ciliare e trabecolato. umor acqueo è prodotto dal corpo ciliare. Esso fluisce poi nella camera anteriore per mantenere la salute generale del tessuto oculare. 75 - 80% del deflusso dell'umor acqueo viene secreto attivamente attraverso la non-pigmentazione dell'epitelio ciliare quando il fluido viene filtrato attraverso tre strati di tessuto spugnoso nel muscolo ciliare. Le uscite fluido attraverso il trabecolato e attraverso canale di Schlemm che empti nel sistema sanguigno ⁵ .Il restante 20 - 25% del deflusso bypassa trabecolare che è passivamente secreti da ultrafiltrazione e diffusione attraverso la via uveo-sclerale. Questo percorso sembra essere relativamente indipendente dalla pressione intraoculare ^1.

Quando la produzione umore acqueo e deflusso sono in equilibrio, la pressione aumenta all'interno dell'occhio. Come detto, questo aumento della pressione intraoculare è il principale fattore di rischio per lo sviluppo di glaucoma. Tale pressione provoca danni agli strati intricate neuroni della retina nella parte posteriore dell'occhio. Danni ai assoni delle cellule gangliari della retina del nervo ottico fa sì che il cervello a non ricevere più accurate informazioni visive. Come risultato, la percezione di visione è persa e può verificarsi completa cecità.

Fino ad oggi, non esiste una cura per il glaucoma. Diversi metodi di trattamento esistenti che in primo luogo lo scopo di ridurre la pressione intraoculare. Questi includono attualitàclassi di farmaci come i bloccanti dei recettori beta1-adrenergici, o analoghi delle prostaglandine per uso topico. I beta-bloccanti riducono la pressione intraoculare riducendo la produzione di umore acqueo ^7. Le prostaglandine funzione per ridurre la PIO aumentando il deflusso dell'umore acqueo ^8-14. Alfa agonisti adrenergici e inibitori dell'anidrasi carbonica sono utilizzati anche come metodi secondari di trattamento. Alpha agonisti adrenergici aumentano deflusso attraverso la via uveosclerale ^15-17. Inibitori dell'anidrasi carbonica riducono la produzione di AH per inibizione enzimatica ^18. Molto procedure più invasive vengono utilizzati anche per il trattamento del glaucoma. Trabeculoplastica laser è usato per aumentare il deflusso dell'umore acqueo ^19. Un'altra terapia chirurgica, chiamata trabeculectomia, crea un sito di drenaggio alternativo per filtrare AH quando il percorso trabecolare tradizionale è bloccato ^20-21.

Queste opzioni di trattamento sono stati conosciuti per effettivamente ridurre la IOP. Tuttavia, fino al 40% dei pazienti affetti da glaucoma mostrano normali livelli di IOP suggerendo la necessità di metodi terapeutici più completi. ^22,23 Inoltre, la morte delle cellule gangliari della retina visto nel glaucoma è irreversibile, una volta che inizia e trattamenti attuali non si fermano la progressione della malattia ^24-28. Ciò ha evidenziato la necessità di efficaci terapie neuroprotettive che colpiscono la sopravvivenza dei neuroni stessi. Sviluppo di modelli glaucoma è fondamentale per questo sviluppo.

In questo studio stiamo dimostrando un metodo di indurre effetti glaucoma simili nei ratti adulti lungo Evans utilizzando una procedura modificata originariamente delineato da Morrison ^29. In questa procedura, iniezioni di 2 M soluzione salina ipertonica nel plesso venoso episclerale induce condizioni di glaucoma, come da cicatrici di tessuto per ridurre deflusso dell'umore acqueo nel trabecolato che porta a un aumento della pressione intraoculare e una significativa perdita di RGCs wntro un mese dalla procedura di ^30-31. procedure di glaucoma che inducono, come quella descritta qui, può essere la chiave per sbloccare nuovi sviluppi nel trattamento del glaucoma.

Protocollo

Tutte le procedure che utilizzano soggetti animali sono stati in conformità con gli standard dell'Istituto di cura degli animali e del Comitato uso (IACUC) alla Western Michigan University.

1. Gli animali

1. Utilizzare i ratti maschi e femmine 3 mesi di età in questo studio.
2. Mantenere gli animali in un ciclo di 12 ore luce / buio con libero accesso a cibo e acqua.

2. Preparazione di KAX Cocktail per anestesia degli animali

1. Sciogliere 50 mg di xilazina (20 mg / ml) in 5 ml di ketamina (100 mg / ml) con 1 ml acepromazine (10 mg / ml) e 3 ml di acqua distillata. Mescolare accuratamente.
2. Sterilizzazione con un filtro a siringa e conservare questa soluzione in un flacone di siero 10 ml.

3. KAX Iniezione

1. Pesare animale (g) e ritornare alla gabbia fino pronta per l'iniezione.
2. Iniettare 0,1 ml KAX / 100 g di peso corporeo degli animali per via intraperitoneale, utilizzando una siringa da insulina da 1 ml con un ago 28 G.
3. consentireper animali a perdere conoscenza. Controllare riflessi pizzicare i piedi e la coda.
4. Mantenere tutti gli animali in modo sicuro in laboratorio per la durata dell'intervento.
5. Post-operatorio, sostituire gli animali nelle loro gabbie e mantenere confortevole a RT finché non viene ripreso conoscenza. Solo tornare animali per l'impianto degli animali quando gli animali si svegliano e riprendere un comportamento normale.

4. preparazione per la chirurgia e montaggio Microneedle

1. Fare uno sterile 2 soluzione M NaCl.
2. Utilizzare un estrattore microelettrodo (Figura 1C) per tirare uno 0,86 millimetri di diametro interno pesante standard di lucido e tubo borosilicato a parete sottile in due microaghi di vetro finemente conici (Figura 1D, 1E Figura).
3. Backfill un microago dal passaggio precedente con 2 M soluzione salina con un ago riempimento siringa e una siringa da 1 ml (Figura 1B). Toccare le bolle d'aria dalla punta dell'elettrodo.
4. Riempire una seconda siringa da 1 ml con 2 MNaCl. Collegare un ago G 18 e quindi collegare una lunghezza (circa 10 pollici) di tubo in polietilene (Figura 1A). Utilizzare lo stantuffo della siringa per riempire il tubo di polietilene con soluzione fisiologica attraverso l'ago.
5. Quando sia il microago e tubetti sono riempite con soluzione salina, collegare accuratamente i due. Eliminare eventuale aria nella connessione tra loro (figura 2).
6. Finemente smussare la punta del microago raschiandola molto leggermente contro il grano di un tovagliolo di carta corso.
7. Controllare la resistenza del microago spingendo delicatamente lo stantuffo della siringa fino a quando un bel flusso di liquido può essere visto sul tovagliolo di carta. Il flusso di liquido deve essere più largo 0,5 mm.

5. Preparazione di Animal

1. Applicare 1 - 2 gocce di anestetico topico per cornea (proparacaina cloridrato soluzione oftalmica, USP, 0,5%). Attendere fino a quando non si verifica alcun riflesso oculare.
2. Trim baffi con le forbici.
3. Saturate un cotton-fioc con la soluzione betadine e zona tampone intorno all'occhio sperimentale.
4. Utilizzando un microscopio, allegare un emostatico per bloccare la palpebra inferiore a gonfiarsi l'occhio, esporre la vena episclerale e limitare il movimento degli occhi. (Figura 3, punta di freccia)

6. Saline iniezione glaucoma che inducono

1. Quando l'assemblea microneedle e l'animale sono preparati, iniziare le iniezioni.
2. Quando l'animale si conferma essere insensibile a piedi / coda pizzico, perforare con attenzione la vena episclerale con il microago, venendo ad un angolo basso tra i 10 ei 20 gradi alla vena (Figura 3, freccia bianca). Una puntura successo nella vena è evidente quando il sangue entra nella punta del microago (Figura 3, freccia nera).
3. Lentamente e manualmente iniettare circa 50 microlitri di soluzione salina nella vena. Questo dovrebbe prendere circa 10 sec. Le vene saranno sbollentare bianca come il sale circola through del sistema vascolare (figura 4, punta di freccia). Alcune regioni possono mantenere un aspetto rosso sangue (figura 4, freccia).
   1. Eseguire una seconda iniezione nella vena, opposto al sito del primo, per garantire completa danno retinico allo strato completo di cellule gangliari retiniche.
      Nota: In pochi minuti, si dovrebbe vedere un aspetto torbido distinta attraverso l'iride dell'occhio come sali circola attraverso il sistema vascolare.
4. Lasciare l'occhio opposto greggia per uso come controllo interno.

7. il recupero degli animali

1. Rimuovere la pinza emostatica.
2. Utilizzare un applicatore di cotone per applicare tripla pomata antibiotica (Bacitracin di zinco, solfato di neomicina, polymysin B solfato) al sito bloccato dalla pinza emostatica e ai siti di iniezione. Il danno tissutale intorno all'occhio non si verifica utilizzando la pinza emostatica.
3. > Luogo anestetizzato animali nelle loro gabbie su un circolante coperta di acqua calda per previpotermia ent. Mantenere gli animali sotto osservazione fino a quando la coscienza e il comportamento normale sono riacquistato. Trasportare animali svegli di nuovo alla colonia degli animali. Animali rimangono nella colonia fino al momento del sacrificio.

8. sacrificio animale e rimozione Retina

1. Un mese dopo la procedura per indurre il glaucoma, gli animali sono eutanasia da CO ₂ asfissia e la puntura toracica secondaria.
   1. Posto l'animale nella camera e mettere il coperchio saldamente.
   2. Aprire le valvole di CO ₂ e regolatore del gas per permettere al 20% del volume / min CO ₂ spostamento ossigeno nella camera.
   3. Lasciare quattro a 5 minuti per l'animale a scadenza.
   4. Spegnere entrambe le valvole.
   5. Rimuovere animale dalla camera ed eseguire una puntura toracico secondario con un bisturi sterile.
2. Dopo l'eutanasia, usare un bisturi per tagliare il tessuto connettivo nella cavità orbitale che circonda l'occhio, being attenzione a non tagliare nel bulbo oculare stesso.
3. usare cautela forbici bordo curvo per tagliare il nervo ottico e qualsiasi tessuto rimanente per estrarre il bulbo oculare intatta. Mettere bulbo oculare estratto in una sterile 60 millimetri x 15 mm piastra di Petri monouso contenente PBS fresco.
4. Fare un oculare dal bulbo oculare. Per fare questo, fare una piccola incisione con il bisturi appena posteriore al confine tra l'iride e la sclera. Seguire questa incisione intorno alla circonferenza dell'occhio con piccole forbici a molla per rimuovere dell'emisfero corneale dal bulbo oculare. L'emisfero collegato al nervo ottico rimane.
5. Trova la retina molto sottile di colore rosa / beige all'interno della conchiglia oculare dall'animale eutanasia. Tenere lo strato pigmentato della retina con una pinza smussati per stabilizzare il paraocchi. Utilizzare un altro paio di pinze chiuse per prendere in giro molto delicatamente tutta la retina intatto al largo della parte posteriore dell'occhio. Evitare di pizzicare, tirare, o tirando direttamente la retina.
6. Utilizzare piccole forbici per tagliare la primaveraarea in cui il nervo ottico è ancora attaccato alla retina.
7. Assicuratevi di tagliare via ogni residuo di epitelio pigmentato o tessuto sclerale dalla retina.
8. Usando una pipetta di trasferimento, trasferire molto delicatamente la retina isolata ad un Sylgard pulito rivestito 35 millimetri x 10 mm piastra di Petri contenente PBS fresco.

9. tutto il montaggio Retina Preparazione

1. Una volta nel piatto Sylgard, usare una pinza e un ago cactus al pin della retina in posizione. Mantenere lo strato di cellule gangliari della retina rivolto verso l'alto e verso il basso del nervo ottico. forma emisferica della retina è notevole, anche dopo la fissazione. La curvatura della retina si arricciano verso il soffitto quando lo strato di cellule gangliari retiniche è nell'orientamento desiderato.
2. Utilizzare piccole forbici per tagliare la retina in quattro quadranti, rendendo la forma di un quadrifoglio irradia dalla testa del nervo ottico.
3. Pin i quadranti della retina con aghi di cactus aggiuntive per rendere la retina più piatta possibile without allungamento (Figura 5).
4. Fissare le retine riposte nel piatto Sylgard con 3 ml di paraformaldeide al 4% O / N a temperatura ambiente.

10. Anticorpo colorazione di Retina

Nota: retine Stain fissi con anticorpi primari e secondari per la visualizzazione neuroni della retina (Figura 6).

1. Risciacquare, retine piatto montato fisso tre volte per 2 minuti ciascuno in PBS.
2. Permeabilize le retine con 1% Triton X-100 con 1% di siero fetale bovino in PBS per 60 min.
3. Sciacquare retine per tre volte, 2 min ciascuna, in PBS.
4. Risciacquare due volte con 0,1% Triton X-100 in PBS, 5 min a lavaggio.
5. Sciacquare due volte con PBS, 5 minuti a lavaggio.
6. Incubare con 1% Triton X-100 e 1% di siero bovino fetale in PBS a temperatura ambiente per 45 min.
7. Risciacquare due volte con 0,1% Triton X-100 in PBS, 5 min a lavaggio.
8. Sciacquare due volte con PBS, 5 minuti a lavaggio.
9. Incubare ciascuna retina in 3 ml 1% di siero fetale bovino in PBScon il mouse purificato anti-topo CD90 / mouse CD90.1 (1: 300 diluizione) O / N a RT.
10. Risciacquare retine volta con 0,1% Triton X-100 in PBS per 5 min.
11. Sciacquare due volte con PBS, 5 minuti a lavaggio.
12. Incubare ciascuna retina in 3 ml di PBS (senza FBS) con secondario Alexa Fluor 594 capra anti-IgG di topo (1: 300) O / N a RT.
13. Lavare retine con PBS liberamente.
14. Utilizzando un microscopio da dissezione, rimuovere con attenzione gli aghi di cactus dalla retina.
15. trasferire delicatamente retine su vetrini da microscopio con una pipetta di trasferimento. Assicurarsi di mantenere l'orientamento con strato di cellule gangliari della retina di fronte al soffitto. forma emisferica della retina è notevole, anche dopo la fissazione. La curvatura della retina si arricciano verso il soffitto quando lo strato di cellule gangliari retiniche è nell'orientamento desiderato.
16. Assorbire ogni eccesso di PBS con KimWipe o altro materiale assorbente. Fare attenzione a non assorbire la retina.
17. Aggiungere 5 gocce di ½ glicerolo e ½ PBS in peso per la mattinamezzi ontaggio.
18. Coprire retina con vetrino, evitando bolle d'aria.
19. coprioggetto protetta tramite smalto trasparente, colla o altro adesivo.

Risultati

Questa sezione illustra i componenti apparecchiature e procedure utilizzate per indurre condizioni di glaucoma, come in un topo modello di glaucoma in vivo. Mostriamo i singoli strumenti e delle attrezzature utilizzate per eseguire una iniezione salina ipertonica che provoca un aumento della pressione intraoculare. Mostriamo l'iniezione nel plesso venoso episclerale con il suo effetto scottatura caratteristico e l'aspetto torbido della camera anteriore risultante. Abbiam...

Discussione

Questo protocollo descrive un metodo per indurre condizioni glaucoma simile in un modello in vivo di ratto in. Questa procedura utilizza una iniezione di soluzione salina ipertonica per indurre cicatrici nel trabecolato ^{29, 32.} Sviluppare tessuto cicatriziale occlude il deflusso dell'umore acqueo che aumenta la pressione nella camera anteriore. Con diminuito deflusso e la pressione si accumulano, la lente sospesa da legamenti elastici spinge indietro nella camera vitrea. vitreo poi appli...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Xylazine hydrochloride, Minimum 99%	Sigma, Life Science	X1251-1G
Ketamine hydrochloride injection, USP, 100mg/mL	Putney, Inc	NDC 26637-411-01	10 mL bottle
Acepromazine Maleate, 10mg/mL	Phoenix Pharmaceutical, Inc	NDC 57319-447-04, 670008L-03-0408	50 mL bottle
Serum bottle, 10 mL	VWR	16171319	Borosilicate glass
1 mL insulin syringe	VWR	BD329410	28 gauge needle
Sodium chloride	Sigma	S7653	2 M Solution
Microelectrode Puller	Narishige Group	PP-830
Heavy Polished Standard and Thin Walled Borosilicate Tubing	Sutter Instruments	B150-86-10HP	without filament, 0.86 mm
Microfil syringe needle for filling micropipettes	World Precision Instruments, Inc	MF28G
18 gauge Luer-Lock needle	Fisher Scientific	1130421	Syringe needle
Flexible Polyethylene Tubing	Fisher Scientific	22046941	0.034 inch diameter, approximately 10 inches
Proparacaine Hydrochloride Opthalmic Solution, USP, 0.5%	Akorn, Inc	NDC 17478-263-12	15 mL  sterile bottle
Curved Scissors	Fine Science Tools	14061-11
Microscope	Leica	StereoZoom 4
Hemostat Clamp	Fine Science Tools	1310912	curved edge
Triple Antibiotic Ointment	Fisher Scientific	NC0664481
Scalpel handle	Fine Science Tools	10004-13
Scalpel blade # 11	Fine Science Tools	10011-00
60 mm x 15 mm Disposable Petri Dish	VWR	351007
Phosphate Buffered Saline 10x Concentrate	Sigma, Life Science	P7059-1L	1x dilution
Spring Scissors	Fine Science Tools	15009-08
Forceps (2), Dumont # 5	Fine Science Tools	11251-30
3 mL Transfer Pipets, polyethylene, non sterile	BD Biosciences	357524 or 52947-948	1 and 2 mL graduations
35 mm x 10 mm Easy Grip Petri Dish	BD Biosciences	351008
Sylgard 184	VWR	102092-312
Cactus Needles	N/A	N/A
Paraformaldehyde	EMD Millipore	PX0055-3 or 818715.0100	Made into a 4% solution
Triton X-100	Sigma	T9284-100 mL	Made into both a 1% and 0.1% solution
Fetal Bovine Serum	Atlanta Biological	S11150	500 ml
Purified Mouse Anti-Rat CD90/mouse CD90.1	BD Pharmingen	Cat 554892	1:300 dilution
Alexa Fluor 594 goat anti-mouse	Life Technologies	A11005	1:300 dilution
Microscope Slides	Corning	2948-75x25
Glycerol	Sigma	G5516-100 mL	50% glycerol to 50% PBS, by weight
Coverglass	Corning	2975-225	Thickness 1 22 x 50 mm
Confocal Microscope	Nikon	C2 Eclipse Ti