Glokom uyaran bir de Prosedürü<em&gt; İn Vivo</em&gt; Rat Modeli ve Tüm montaj Retina Hazırlık

Özet

Glaucoma is characterized by damage to retinal ganglion cells. Inducing glaucoma in animal models can provide insight into the study of this disease. Here, we outline a procedure that induces loss of RGCs in an in vivo rat model and demonstrates the preparation of whole-mount retinas for analysis.

Özet

Glokom, retinal bez hücrelerin (RGCs) etki eden, merkezi sinir sisteminin bir hastalığıdır. optik sinir oluşturan RGC aksonlar görsel algı için beyne görsel girdi taşırlar. RGCs ve akson hasar görme kaybı ve / veya körlüğe yol açar. glokom spesifik nedeni bilinmemekle birlikte, hastalığın birincil risk faktörü yüksek bir göz içi basıncı. hayvan modellerinde Glokom uyaran prosedürler RGC ölüm mekanizmasını çalışan araştırmacılar için değerli bir araçtır. Bu tür bilgiler görme kaybının önlenmesinde yardımcı olabilir etkili bir nöro-koruyucu tedavilerin geliştirilmesine yol açabilir. 2 M hipertonik salin 50 ul episkleral venöz pleksus enjekte edilir, bir in vivo sıçan modelinde koşulları gibi - bu yazıda protokolü glokom teşvik etmek için bir yöntem tarif eder. damarların Ağartma başarılı bir enjeksiyon gösterir. Bu prosedür glokom simüle etmek için RGCs kaybına neden olur. takip eden bir ayenjeksiyonu, hayvanlar kurban edilmiş ve gözler uzaklaştırılır. Sonraki, kornea, lens ve vitreus bir göz yuvasını yapmak için kaldırılır. Retina sonra gözün arka soyulmuş ve kaktüs iğneler kullanılarak Sylgard yemekleri üzerine tutturulmuş. Bu noktada, retina nöronlarının analizi için boyandı. Bu laboratuvarda elde edilen sonuçlar iç kontroller ile karşılaştırıldığında RGCs yaklaşık% 25'i prosedürü bir ay içinde kaybolur olduğunu göstermektedir. Bu prosedür, bir in vivo sıçan glokom modelinde retinal ganglion hücresi ölümü kantitatif analizi sağlar.

Giriş

Glokom özel olarak ise, retinal ganglion hücre ^1-2, retina nöronlarını etkileyenler göz hastalıklarının grubudur. Bu hücrelerin aksonları vizyon algılanan beyine görsel bilgileri taşıyan optik sinir olmaya birleşir. RGCs ve akson hasar dolayısıyla görsel kusurları neden olur.

glokom bozuklukları ile ilişkili birincil özellikler RGC dejenerasyonu ve ölümü, artan göz içi basıncı (GİB) ve optik diskin çukurluğu ve atrofi vardır. Bu özellikler görme alanı kaybı ya da tam geri dönüşü olmayan körlüğe yol açar. Şu anda, glokom, dünya çapında 70 milyon insanın ³ körlük neden olmuştur. Bunun gibi, körlük ⁴ dünyanın en büyük üçüncü nedenidir.

Glokom RGC kesin ölüm mekanizması bilinmemektedir. Çok araştırma gizem kilidini açmak için yapılmıştır. Glokom birincil risk faktörü bir artış i Bununla birlikte, bilinennedeniyle gözün ön kamarasında sulu mizah (AH) düzensiz dolaşımına n göz içi basıncı. AH gözün avasküler ön kamara kan saydam ve renksiz bir yedek olarak işlev görür. Bu, çevredeki hücreleri besler metabolik süreçler salgılanan atık ürünler kaldırır, nörotransmitter nakil ve patolojik devletlerin ¹ sırasında uyuşturucu ve gözün içinde inflamatuar hücrelerin dolaşımını sağlar.

Sulu mizah dolaşım bakım siliyer cisim ve trabeküler ağı içerir. Sulu mizah siliyer cisim tarafından üretilir. Daha sonra göz dokusunun genel sağlığını korumak için ön kamaraya akar. 75 - Sıvı siliyer kasta süngerimsi doku üç katmandan süzülür zaman sulu mizah çıkışı% 80 aktif olmayan pigment siliyer epitel içinden salgılanır. trabeküler ağ yoluyla ve hangi satınalmada öncelikli Schlemm Kanalı aracılığıyla sıvı çıkar20 Kalan kan sistemi ⁵ hayranlarıyla içine ler - çıkışı% 25 trabeküler ağı atlar ve pasif uveo-skleral yolu ile ultrafiltrasyon ve difüzyon tarafından salgılanır. Bu yol göz içi basıncı ¹ nispeten bağımsız olduğu görülmektedir.

aköz üretimi ve çıkış dengesi olduğunda, basınç gözün içindeki kurar. Belirtildiği gibi, göz içi basıncının bu artış glokom gelişiminde en önemli risk faktörüdür. Bu baskı, gözün arkasındaki retina nöronlarının karmaşık tabakalar hasara neden olur. optik sinir retina ganglion hücre aksonları hasar artık doğru bir görsel bilgi almak için beyin neden olur. Bunun bir sonucu olarak, görüş algılama kaybolur ve tam körlük olabilir.

Bugüne kadar, glokom için tedavisi yoktur. Farklı tedavi yöntemleri öncelikle göz içi basıncını azaltmak amacı vardır. Bu harici,Bu beta1-adrenerjik reseptör blokerleri, ya da topik prostaglandin analogları olarak ilaç sınıfları. Beta blokerler sulu mizah ⁷ üretimini azaltarak göz içi basıncını azaltır. Prostaglandinler sulu mizah ^8-14 akışını artırarak GİB'in azaltmak için çalışır. Alfa adrenerjik agonistler, karbonik anhidraz inhibitörleri, aynı zamanda tedavi ikincil yöntem olarak kullanılmaktadır. Alfa adrenerjik agonistler uveoskleral yolunun ^15-17 ile çıkışı artar. Karbonik anhidraz inhibitörleri enzimatik inhibisyon ¹⁸ ile AH üretimini azaltır. Çok daha invaziv girişimler aynı zamanda glokom tedavisinde kullanılmaktadır. Lazer trabeküloplasti sulu mizah ¹⁹ çıkış artırmak için kullanılır. Trabekülektomi adlı başka bir cerrahi tedavi, geleneksel trabeküler yolu ^20-21 bloke olduğunda AH filtrelemek için alternatif bir drenaj sitesi oluşturur.

Bu tedavi seçenekleri eff bilinmektedirectively Göz içi basıncını düşürmek. Ancak, glokom hastalarının% 40'a varan daha tam tedavi yöntemleri için bir ihtiyaç gösteren, normal GİB göstermektedir. ^22,23 Ek olarak başlar ve güncel tedaviler hastalığın ilerlemesini bitmiyor kez glokom görülen retina ganglion hücre ölümü geri döndürülemez ^24-28. Bu nöronların kendilerini hayatta hedefleyen etkili nöroprotektif tedaviler gerekliliğini göstermiştir. glokom modellerinin geliştirilmesi, bu gelişimi için çok önemlidir.

Bu çalışmada, ilk olarak Morrison ²⁹ ile belirtilen bir tadil edilmiş bir prosedür kullanılarak, yetişkin Long Evans sıçanlarda glokom gibi etkileri başlatmak için bir yöntem gösteriyorlar. Bu prosedürde, episkleral venöz pleksus içine 2 M hipertonik salin enjeksiyonları göz içi basınç artışı ve RGCs önemli bir kayıp w yol açan trabeküler ağda sulu mizah çıkışı azaltmak için doku yara izi ile glokom gibi koşullar indüklerprosedür ^30-31 bir ay ithin. Böyle Burada anlatılan biri olarak Glokom uyaran prosedürleri, glokom tedavisinde yeni gelişmeler çözmenin anahtarı olabilir.

Protokol

hayvan denekleri kullanan tüm işlemler Western Michigan Üniversitesi'nde Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi (IACUC) Enstitüsü standartlarına uygun olmuştur.

1. Hayvanlar

1. Bu çalışmada, erkek ve dişi sıçanlarda 3 aylık kullanın.
2. yiyecek ve suya serbest erişim ile 12 saat ışık / karanlık döngüsünde hayvanları tutun.

Hayvan Anestezi için KAX Kokteyli 2. Hazırlık

1. 1 mi asepromazin (10 mg / ml) damıtılmış su, 3 ml ile 5 mi, ketamin (100 mg / ml) içinde ksilazin (20 mg / ml), 50 mg eritin. İyice karıştırın.
2. bir şırınga filtresi ile sterilize ve 10 mi, serum şişeye bu çözüm saklayın.

3. KAX Enjeksiyon

1. hayvan (g) tartılır ve enjeksiyon için hazır olana kadar kafesin geri dönün.
2. 28 G iğne ile 1 ml insülin şırıngası kullanılarak, intraperitonal 0.1 mi KAX / 100 g hayvan vücut ağırlığına enjekte edilir.
3. İzin vermekhayvan için bilinçsiz olmak. ayak ve kuyruk kısma refleksleri kontrol edin.
4. Ameliyat süresince güvenle laboratuarında tüm hayvanları tutun.
5. Post-cerrahi, kafeslerine hayvanlar yerine ve bilinç sağlanıncaya kadar RT rahat tutun. Sadece hayvanlar uyandırmak zaman hayvan tesisine hayvanları dönmek ve normal davranış devam edin.

Cerrahi ve Microneedle Meclisi 4. Hazırlık

1. Steril 2 M NaCl çözeltisi olun.
2. İki ince konik cam microneedles (Şekil 1D, Şekil 1E) içine bir 0.86 mm iç çap ağır cilalı standart ve ince duvarlı borosilikat tüp çekmek için bir mikroelektrot çektirmesi (Şekil 1C) kullanın.
3. 2 M tuz, bir dolgu şırınga iğnesi ve 1 ml şırınga (Şekil 1B) kullanılarak önceki adımda elde edilen bir mikroiğne Dolgu. elektrot ucu hava kabarcıklarını dışarı dokunun.
4. 2 M ile ikinci 1 ml şırınga doldurunNaCI ile yıkanmıştır. 18 G iğne bağlayın ve sonra polietilen boru (Şekil 1A) bir uzunluğa (yaklaşık 10 inç) ekleyin. iğne ile tuzlu su ile polietilen boru doldurmak için şırınga pistonu kullanın.
5. microneedle ve tüp hem de tuzlu su ile dolu olduğunda, dikkatli bir şekilde birbirine bağlamak. Aralarında bağlantı (Şekil 2) herhangi bir havayı ortadan kaldırın.
6. İnce bir ders kağıt havlu tahıl karşı çok hafifçe kazıyarak Mikroiğnenin ucu konik.
7. yavaşça sıvının ince bir dere kağıt havlu üzerine görülebilir kadar şırınga pistonu iterek Mikroiğnenin direncini kontrol ediniz. sıvı akıntısı 0.5 mm daha büyük olmalıdır.

Animal 5. hazırlanması

1. 2 damla kornea topikal anestetik (Proparakain hidroklorür Oftalmik Solüsyon USP,% 0.5) - 1 uygulayın. Hiçbir göz refleks oluşuncaya kadar bekleyin.
2. makasla bıyıkları kesin.
3. SDeneysel göz çevresinde betadin çözüm ve çubukla alanına sahip bir pamuk uçlu aplikatör aturate.
4. Bir mikroskop kullanarak, göz şişkinliği Episkleral ven ortaya çıkarmak ve göz hareketi kısıtlamak için alt göz kapağı kelepçe bir hemostat ekleyin. (Şekil 3, ok başı)

6. Glokom uyaran Tuzlu Enjeksiyon

1. microneedle montaj ve hayvan hazırlandıkları zaman, enjeksiyon başlar.
2. Hayvan ayak / kuyruk tutam tepkisiz olması teyit edildiğinde, dikkatlice ven (Şekil 3, beyaz ok) 10 ve 20 derece arasında düşük bir açıda gelerek microneedle ile Episkleral ven delin. Kan mikroiğne (Şekil 3, siyah ok) ucu girer damar içine başarılı bir lastik belirgindir.
3. Yavaş ve el damar içine yaklaşık 50 ul tuzlu su enjekte edilir. Bu, yaklaşık 10 sn almalıdır. Damarlar olacak tuz uçtan bir uca dolaşır olarak mazur beyazugh damar (Şekil 4, ok başı). Bazı bölgeler kan kırmızı bir görünüm (Şekil 4, ok) muhafaza edebilir.
   1. tam retina ganglion hücre tabakası tam retina hasarı sağlamak için, karşısındaki ilk site, damar içine ikinci bir enjeksiyon gerçekleştirin.
      Not: Tuz damar sistemi aracılığıyla dolaşır olarak dakika içinde, bir gözün iris yoluyla ayrı bir bulutlu bir görünüm görmelisiniz.
4. Bir iç kontrol olarak kullanılmak üzere muamele edilmemiş karşı gözü terk.

7. Hayvan Kurtarma

1. hemostat çıkarın.
2. hemostatla tarafından ve enjeksiyon sitelere kenetlenmiş siteye üçlü antibiyotik merhem (basitrasin çinko, neomisin sülfat, polymysin B sülfat) uygulamak için bir pamuk aplikatör kullanın. Göz çevresinde doku hasarı hemostat kullanarak oluşmaz.
3. > Bir dolaşan sıcak su battaniye kafeslerine Place anestezi hayvanların prev içinent hipotermi. bilinç ve normal bir davranış kazanmış kadar gözlem altında hayvanları tutun. geri hayvan koloniye uyanık hayvan taşıyın. Hayvanlar kurban zamanına kadar koloni kalır.

8. Hayvan Kurban ve Retina Kaldırma

1. Glokom ikna etmek için prosedürü izleyerek Bir ay, hayvanlar CO ₂ boğulma ve ikincil göğüs ponksiyon ile ötenazi.
   1. odasında hayvan koyun ve güvenli kapağı koydu.
   2. % 20 hacmi / dk CO ₂ deplasman izin CO ₂ ve gaz regülatörü vanaları açın odasındaki oksijen.
   3. Hayvan sona erecek dört ila 5 dakika bekleyin.
   4. Her iki vanaları kapatın.
   5. odasından gelen hayvan çıkarın ve steril bir bisturi ile ikincil göğüs delik gerçekleştirin.
2. Ötenazi sonra, göz, bei çevreleyen orbita boşluğuna bağ dokusu kesmek için bir neşter kullanabilirsinizng dikkatli küresi kendi içine kesmek için değil.
3. Dikkatle sağlam gözü ayıklamak için optik siniri ve kalan doku kesmek için kavisli kenar makas kullanın. Taze PBS içeren steril bir 60 mm x 15 mm atılabilir bir petri ekstre gözün yerleştirin.
4. göz küresi bir göz yuvasını yapın. Bunu yapmak için, neşter ile küçük bir kesi sadece iris ve sklera arasındaki sınır posterior olun. göz küresi kornea yarımkürede kaldırmak için küçük yaylı makas ile göz çevresine bu kesi izleyin. optik sinir bağlı hemisfer kalır.
5. ötenazi hayvandan Göz yuvası içinde çok ince pembe / bej retina bulun. Göz yuvası stabilize etmek için körleşmiş forseps ile retinanın pigmentli tabakası tutun. çok yavaşça gözün arka kapalı bütün dokunulmamış retina kızdırmak için kapalı forseps başka bir çift kullanın. , Kısma çekerek, ya da doğrudan retinaya asılarak kaçının.
6. kesmek için küçük yaylı makas kullanınOptik sinir hala retinaya bağlı olduğu alan.
7. retinadan herhangi bir kalıntı pigment epitel ya da skleral doku kesip emin olun.
8. Bir transfer pipet kullanarak, çok yavaşça taze PBS içeren 35 mm x 10 mm petri kaplı temiz bir sylgard izole retina aktarın.

9. Tüm Montaj Retina Hazırlık

1. Bir kez Sylgard çanak, yerinde retina pin forseps ve bir kaktüs iğne kullanın. yukarı bakacak şekilde retina ganglion hücre tabakası tutun ve aşağı optik sinir. retinanın yarım küre şekli bile tespit sonrasında dikkat çekicidir. retinal ganglion hücre tabakası arzu edilen bir doğrultuda olduğunda retina kavis tavana doğru kıvrılmasına olacaktır.
2. optik sinir başı yayılan dört yapraklı yonca şeklini verme, dört parçaya bölünür retina kesmek için küçük bir makas kullanın.
3. Mümkün witho olarak retina gibi düz hale getirmek için ek kaktüs iğne ile retina kadran pingerme ut (Şekil 5).
4. % 4 paraformaldehid O / oda sıcaklığında N 3 ml Sylgard çanak tutturulmuş retina sabitleyin.

Retina 10. Antikor Boyama

Not: Birincil ve ikincil antikorlar ile Leke sabit retina retina (Şekil 6) nöronların görüntüleme için.

1. PBS içinde sabit, düz monte retina 2 dakika boyunca üç kez yıkayın.
2. 60 dakika boyunca PBS içinde% 1 fetal bovin serumu ile% 1 Triton X-100 ile retina geçirgenliği.
3. Durulama PBS içinde üç kez 2 dakika her biri, retina.
4. PBS içinde% 0.1 Triton X-100, yıkama başına 5 dakika ile iki kez yıkayın.
5. PBS yıkama başına 5 dakika ile iki kez yıkayın.
6. 45 dakika boyunca oda sıcaklığında PBS içinde% 1 Triton X-100 ve% 1 fetal inek serumu ile inkübe edin.
7. PBS içinde% 0.1 Triton X-100, yıkama başına 5 dakika ile iki kez yıkayın.
8. PBS yıkama başına 5 dakika ile iki kez yıkayın.
9. PBS içinde 3 mi% 1 fetal inek serumu, her retina inkübesaflaştırılmış fare anti-fare CD90 / fare CD90.1 (1: 300 seyreltme) O / oda sıcaklığında N.
10. 5 dakika boyunca PBS içinde% 0.1 Triton X-100 ile bir kez retina durulayın.
11. PBS yıkama başına 5 dakika ile iki kez yıkayın.
12. İkincil Alexa Fluor 594 keçi anti-fare IgG'si ile 3 ml PBS (Resim FBS) her bir retina inkübe (1: 300) O / oda sıcaklığında N.
13. liberal PBS ile retina yıkayın.
14. Bir diseksiyon mikroskobu kullanarak dikkatli bir şekilde retinanın kaktüs iğneleri çıkarın.
15. Yavaşça bir transfer pipet yardımıyla mikroskop lamı üzerine retina aktarın. tavana bakacak şekilde retina ganglion hücre tabakası ile yönünü korumak için emin olun. retinanın yarım küre şekli bile tespit sonrasında dikkat çekicidir. retinal ganglion hücre tabakası arzu edilen bir doğrultuda olduğunda retina kavis tavana doğru kıvrılmasına olacaktır.
16. KimWipe ya da diğer emici madde ile herhangi bir aşırı PBS emer. retina emmek için dikkatli olun.
17. ½ gliserol 5 damla ilave edin ve am ağırlık olarak PBS ½tutarlı medya.
18. hava kabarcıkları kaçınarak, lamel ile retina örtün.
19. net oje, tutkal veya başka bir yapıştırıcı kullanarak güvenli lamel.

Sonuçlar

Bu bölüm, bir in vivo sıçan glokom modelinde glokom gibi koşullar uyarılması için kullanılan aygıt bileşenlerini ve prosedürü görüntülemektedir. Biz göz içi basıncı bir artışa neden bir hipertonik salin enjeksiyonu gerçekleştirmek için kullanılan bireysel araç ve gereçleri gösterir. Biz onun karakteristik haşlama etkisi ve sonuçları ön kamara bulutlu görünümü ile episkleral venöz pleksus içine enjeksiyon göstermektedir. Biz de retina kald?...

Tartışmalar

Bu protokol, bir in vivo sıçan modelinde glokom gibi koşulların oluşturulması için bir yöntem tarif eder. Bu prosedür ^{29, 32.} Skar dokusu geliştirilmesi ön kamarada basıncı artar sulu mizah çıkışı tıkar trabeküler ağda yara izi ikna etmek için hipertonik salin enjeksiyonu kullanır. azalmış çıkış ve basınç kurmak ile, elastik ligaman tarafından askıya objektif geri vitreus odasına iter. Vitreus mizah sonra kırılgan retina nöronlar zarar retina üzerine basınç uyg...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Xylazine hydrochloride, Minimum 99%	Sigma, Life Science	X1251-1G
Ketamine hydrochloride injection, USP, 100mg/ml	Putney, Inc	NDC 26637-411-01	10 ml bottle
Acepromazine Maleate, 10mg/ml	Phoenix Pharmaceutical, Inc	NDC 57319-447-04, 670008L-03-0408	50 ml bottle
Serum bottle, 10 ml	VWR	16171319	Borosilicate glass
1 ml insulin syringe	VWR	BD329410	28 G needle
Sodium chloride	Sigma	S7653	2 M Solution
Microelectrode Puller	Narishige Group	PP-830
Heavy Polished Standard and Thin Walled Borosilicate Tubing	Sutter Instruments	B150-86-10HP	without filament, 0.86 mm
Microfil syringe needle for filling micropipettes	World Precision Instruments, Inc	MF28G
18 gauge Luer-Lock needle	Fisher Scientific	1130421	Syringe needle
Flexible Polyethylene Tubing	Fisher Scientific	22046941	0.034 inch diameter, approximately 10 inches
Proparacaine Hydrochloride Opthalmic Solution, USP, 0.5%	Akorn, Inc	NDC 17478-263-12	15 ml  sterile bottle
Curved Scissors	Fine Science Tools	14061-11
Microscope	Leica	StereoZoom 4
Hemostat Clamp	Fine Science Tools	1310912	curved edge
Triple Antibiotic Ointment	Fisher Scientific	NC0664481
Scalpel handle	Fine Science Tools	10004-13
Scalpel blade #11	Fine Science Tools	10011-00
60 mm x 15 mm Disposable Petri Dish	VWR	351007
Phosphate Buffered Saline 10x Concentrate	Sigma, Life Science	P7059-1L	1x dilution
Spring Scissors	Fine Science Tools	15009-08
Forceps (2), Dumont # 5	Fine Science Tools	11251-30
3 ml Transfer Pipets, polyethylene, non sterile	BD Biosciences	357524 or 52947-948	1 and 2 ml graduations
35 mm x 10 mm Easy Grip Petri Dish	BD Biosciences	351008
Sylgard 184	VWR	102092-312
Cactus Needles
Paraformaldehyde	EMD Millipore	PX0055-3 or 818715.0100	Made into a 4% solution
Triton X-100	Sigma	T9284-100 ml	Made into both a 1% and 0.1% solution
Fetal Bovine Serum	Atlanta Biological	S11150	500 ml
Purified Mouse Anti-Rat CD90/mouse CD90.1	BD Pharmingen	Cat 554892	1:300 dilution
Alexa Fluor 594 goat anti-mouse	Life Technologies	A11005	1:300 dilution
Microscope Slides	Corning	2948-75x25
Glycerol	Sigma	G5516-100 ml	50% glycerol to 50% PBS, by weight
Coverglass	Corning	2975-225	Thickness 1 22 x 50 mm
Confocal Microscope	Nikon	C2 Eclipse Ti