Glaucoma de indução de Procedimento em um<em&gt; In Vivo</em&gt; Modelo de Rato e Whole mount-Retina Preparação

Resumo

Glaucoma is characterized by damage to retinal ganglion cells. Inducing glaucoma in animal models can provide insight into the study of this disease. Here, we outline a procedure that induces loss of RGCs in an in vivo rat model and demonstrates the preparation of whole-mount retinas for analysis.

Resumo

O glaucoma é uma doença do sistema nervoso central que actua nas células ganglionares da retina (RGCs). axônios RGC que compõem o nervo óptico carregam informação visual ao cérebro para a percepção visual. Danos para CGR e seus axónios leva a perda de visão e / ou cegueira. Embora a causa específica do glaucoma é desconhecida, o factor de risco principal para a doença é uma pressão intra-ocular elevada. procedimentos de indução de glaucoma em modelos animais são uma ferramenta valiosa para os investigadores que estudam o mecanismo da morte das CGR. Tal informação pode levar ao desenvolvimento de tratamentos neuroprotectores eficazes que podem auxiliar na prevenção da perda de visão. O protocolo no presente documento descreve um método de indução de glaucoma - como condições em um modelo de rato in vivo, onde 50 ul de 2 M solução salina hipertônica é injetado na plexo venoso episcleral. Descascamento dos vasos indica injecção bem sucedida. Este procedimento causa a perda de CGR para simular o glaucoma. Um mês seguinteinjecção, os animais são sacrificados e os olhos são removidos. Em seguida, a córnea, lente, e são removidos do vítreo para fazer uma ocular. A retina é então desenrolada a partir da parte posterior do olho e fixado em placas de Sylgard utilizando agulhas cacto. Nesta altura, os neurónios da retina pode ser corada para análise. Os resultados deste laboratório mostram que aproximadamente 25% dos RGCs são perdidos dentro de um mês do procedimento em relação aos controles internos. Este procedimento permite a análise quantitativa da morte das células ganglionares retinais num modelo de glaucoma em ratos in vivo.

Introdução

O glaucoma é um grupo de doenças dos olhos que afectam os neurónios da retina, em particular, as células ganglionares da retina ^1-2. Os axónios dessas células convergem para tornar-se o nervo óptico que transporta a informação visual para o cérebro onde a visão é percebida. Danos para CGR e seus axónios, por conseguinte, provoca defeitos visuais.

As principais características associadas a distúrbios de glaucoma são degeneração RGC e da morte, aumento da pressão intra-ocular (PIO) e escavação do disco óptico e atrofia. Estas características levam a perda de campo visual ou completa, cegueira irreversível. Atualmente, o glaucoma tem causado cegueira em 70 milhões de pessoas em todo o mundo ^3. Como tal, é a terceira maior causa mundial de cegueira ^4.

O mecanismo exato da morte RGC em glaucoma permanece desconhecida. Muita investigação tem sido feito para desvendar o mistério. Sabe-se, no entanto, que o factor de risco primário de glaucoma é um aumento iN pressão intra-ocular devido à circulação irregular de humor aquoso (AH) na câmara anterior do olho. AH actua como um substituto transparente e incolor para o sangue na câmara anterior avascular do olho. Ela alimenta as células vizinhas, remove os resíduos segregadas a partir de processos metabólicos, transporta neurotransmissores, e permite a circulação de drogas e células inflamatórias dentro do olho durante estados patológicos ^1.

A manutenção da circulação de humor aquoso envolve o corpo ciliar e a malha trabecular. O humor aquoso é produzido pelo corpo ciliar. Em seguida, flui para a câmara anterior para manter a saúde geral do tecido ocular. 75-80% do fluxo de humor aquoso é segregado activamente através do epitélio ciliar não pigmentada, quando o fluido é filtrado através de três camadas de tecido esponjoso no músculo ciliar. As saídas de fluido através da malha trabecular e através do canal de Schlemm que apropriaçãos para o sistema sanguíneo ⁵ .A restantes 20 - 25% do escoamento ignora a malha trabecular e é passivamente segregada por ultrafiltração e a difusão através da via uveo-escleral. Esta via parece ser relativamente independente da pressão intra-ocular ^1.

Quando a produção de humor aquoso e saída estão fora de equilíbrio, a pressão aumenta dentro do olho. Como foi dito, este aumento na pressão intra-ocular é o principal factor de risco no desenvolvimento do glaucoma. Essa pressão faz com que dano para as camadas intrincadas de neurónios na retina na parte posterior do olho. Danos aos axônios de células ganglionares da retina do nervo óptico leva o cérebro a não receber mais informação visual precisa. Como resultado, a percepção de visão é perdida e pode ocorrer cegueira completa.

Até à data, não existe cura para o glaucoma. Existem métodos de tratamento diferentes que visam principalmente para reduzir a pressão intra-ocular. Estes incluem tópicaclasses de medicamentos, tais como bloqueadores do receptor beta 1-adrenérgicos, ou análogos de prostaglandinas tópicos. Bloqueadores beta reduzem a pressão intra-ocular através da diminuição da produção de humor aquoso ^7. Prostaglandinas funcionar para reduzir a pressão intra-ocular através do aumento da drenagem do humor aquoso ^8-14. agonistas adrenérgicos alfa e inibidores da anidrase carbónica, também são utilizados como métodos de tratamento secundário. Alfa agonistas adrenérgicos aumentar a vazão através da via uveoscleral ^15-17. Inibidores da anidrase carbónica reduzem a produção de AH por inibição enzimática ^18. Muito mais procedimentos invasivos, também estão a ser usadas para tratar o glaucoma. Trabeculoplastia a laser é usado para aumentar a drenagem do humor aquoso a ^19. Outra terapia cirúrgica, chamada trabeculectomia, cria um local de drenagem alternativa para filtrar AH quando a via trabecular tradicional está bloqueada ^20-21.

Estas opções de tratamento têm sido conhecida a EFFectively reduzir a PIO. No entanto, até 40% dos pacientes de glaucoma mostram níveis normais de PIO que indica uma necessidade para métodos terapêuticos mais completos. ^22,23 Além disso, de células ganglionares da retina morte visto no glaucoma é irreversível uma vez que começa e tratamentos actuais não parar a progressão da doença ^24-28. Este pôs em evidência a necessidade de terapias neuroprotetoras eficazes que visam a sobrevivência dos próprios neurônios. Desenvolvimento de modelos de glaucoma é fundamental para esse desenvolvimento.

Neste estudo, estão a demonstrar um método de induzir efeitos glaucoma semelhante em ratos Long Evans adultos utilizando um procedimento modificado descrito originalmente por Morrison ^29. Neste procedimento, as injecções de 2 M de solução salina hipertónica no plexo venoso episcleral induz condições glaucoma semelhante por tecido cicatricial para reduzir a saída de humor aquoso na malha trabecular que conduz a um aumento na pressão intra-ocular e uma significativa perda de CGR Within de um mês após o procedimento ^30-31. procedimentos de indução de glaucoma, como o aqui descrito, pode ser a chave para desvendar novos desenvolvimentos em tratamentos de glaucoma.

Protocolo

Todos os procedimentos que utilizam indivíduos animais têm sido de acordo com as normas do Institute of Animal Care e Use Committee (IACUC) na Western Michigan University.

1. Os animais

1. Utilizar ratos do sexo masculino e feminino de 3 meses de idade no presente estudo.
2. Manter os animais em um 12 hr ciclo de luz / escuro, com livre acesso a comida e água.

2. Preparação de KAX Cocktail para anestesia animal

1. Dissolve-se 50 mg de xilazina (20 mg / ml) em 5 ml de cetamina (100 mg / ml) com 1 ml de acepromazina (10 mg / ml) e 3 ml de água destilada. Homogeneizar.
2. Esterilizar com um filtro de seringa e armazenar desta solução para um frasco de soro de 10 ml.

3. Injeção KAX

1. Pesar animais (g) e de regresso ao compartimento até que esteja pronto para a injecção.
2. Injectar 0,1 mL KAX / 100 g de peso corporal do animal intraperitonealmente, utilizando uma seringa de insulina de 1 ml com uma agulha de 28 g.
3. Permitirpara animal a ficar inconsciente. Verifique reflexos por beliscar os pés e cauda.
4. Mantenha todos os animais de forma segura em laboratório para a duração da cirurgia.
5. Pós-cirurgia, substituir animais em suas jaulas e manter confortável em RT até que a consciência é recuperada. retornar apenas animais para a instalação de animal quando os animais despertar e retomar o comportamento normal.

4. Preparação para a cirurgia e Montagem Microneedle

1. Adicione uma solução 2 M de NaCl estéril.
2. Use um extrator de microeletrodos (Figura 1C) para puxar um diâmetro interno de 0,86 mm padrão polido pesado e fino tubo de borosilicato murada em duas microagulhas de vidro finamente cônicos (Figura 1D, Figura 1E).
3. Backfill uma micro-agulha do passo anterior com 2 M de soro fisiológico usando uma agulha de seringa de aterro e uma seringa de 1 ml (Figura 1B). Toque as bolhas de ar a partir da ponta do eletrodo.
4. Encha uma segunda seringa de 1 ml com 2 MNaCl. Ligue uma agulha G 18 e, em seguida, anexar um comprimento (aproximadamente 10 polegadas) de tubo de polietileno (Figura 1A). Utilizar o êmbolo da seringa para encher o tubo de polietileno com uma solução salina através da agulha.
5. Quando tanto a micro-agulha e o tubo são cheios com uma solução salina, ligar cuidadosamente os dois. Eliminar qualquer ar na ligação entre os mesmos (figura 2).
6. Finamente bisel a ponta do microneedle raspando muito levemente contra o grão de uma toalha de papel claro.
7. Verificar a resistência da micro-agulha empurrando suavemente o êmbolo da seringa até um bom fluxo de líquido pode ser visto na toalha de papel. O fluxo de líquido não deve ser maior do que 0,5 mm.

5. Preparação de animais

1. Aplicar 1 - 2 gotas de anestésico tópico à córnea (Anestalcon Solução Oftálmica, USP, 0,5%). Espere até que não ocorra nenhum reflexo ocular.
2. Aparar bigodes com uma tesoura.
3. Saturate um aplicador de ponta de algodão com solução de betadine e área de cotonete ao redor do olho experimental.
4. Usando um microscópio, anexar uma pinça hemostática para apertar a pálpebra inferior a protuberância do olho, expor a veia episcleral e restringir o movimento dos olhos. (Figura 3, seta)

6. Injecção salina de indução de glaucoma

1. Quando o conjunto de microagulhas eo animal são preparados, começam injeções.
2. Quando o animal está confirmado para ser insensível à pitada pés / cauda, ​​perfurar cuidadosamente a veia episcleral com a micro-agulha, vindo em um ângulo baixo entre 10 e 20 graus para a veia (Figura 3, seta branca). Um punção de sucesso na veia é aparente quando o sangue entra na ponta da micro-agulha (Figura 3, seta preta).
3. Lenta e manualmente injetar cerca de 50 salinas ul na veia. Isso deve levar cerca de 10 segundos. As veias vai branco blanch como o sal circula through a vasculatura (Figura 4, ponta de seta). Algumas regiões podem manter uma aparência vermelhas do sangue (Figura 4, seta).
   1. Executar uma segunda injecção na veia, do lado oposto ao local da primeira, para assegurar a completa danos na retina para a camada de células ganglionares da retina completa.
      Nota: Dentro de minutos, deve-se ver um aspecto turvo distinta através da íris do olho como o sal circula através do sistema vascular.
4. Deixar o olho contralateral não tratado para ser utilizado como um controlo interno.

7. Recuperação de Animais

1. Remover a pinça hemostática.
2. Use um aplicador de algodão para aplicar pomada antibiótica tripla (bacitracina de zinco, sulfato de neomicina, B sulfato de polymysin) para o site preso pela pinça hemostática e locais de injecção. danos nos tecidos ao redor dos olhos não ocorre usando a pinça hemostática.
3. > Place anestesiados animais em suas jaulas em um cobertor água morna de circulação para prevhipotermia ent. Manter os animais sob observação até que a consciência eo comportamento normal são recuperou. Transporte de animais acordados para a colônia animal. Animais permanecem na colônia até o momento do sacrifício.

8. O Sacrifício de Animais e Retina Remoção

1. Um mês após o procedimento para induzir glaucoma, os animais são sacrificados por asfixia com _CO2 e punção torácica secundária.
   1. Colocar o animal na câmara e colocar a tampa em forma segura.
   2. Abrir as válvulas CO ₂ e regulador de gás para permitir volume de 20% / min _de CO ₂ deslocamento de oxigênio na câmara.
   3. Permitir que quatro a cinco minutos para que o animal a expirar.
   4. Desligue ambas as válvulas.
   5. Remover animal a partir da câmara e realizar uma punção torácica secundária com um bisturi estéril.
2. Após a eutanásia, usar um bisturi para cortar o tecido conjuntivo no interior da cavidade orbital em torno do olho, being cuidado para não cortar na própria globo ocular.
3. Cuidadosamente utilize uma tesoura para cortar borda curva do nervo óptico e qualquer tecido restante para extrair o globo ocular intacta. Coloque globo ocular extraído em um x 15 mm placa de Petri estéril 60 milímetros descartável contendo PBS fresco.
4. Faça um ocular do globo ocular. Para fazer isso, fazer uma pequena incisão com o bisturi apenas posterior à fronteira entre a íris e esclera. Seguir esta incisão em torno da circunferência do olho com uma tesoura pequena mola para remover o hemisfério da córnea do globo ocular. O hemisfério ligado ao nervo óptico permanece.
5. Encontre a retina muito fina rosa / bege dentro da ocular do animal sacrificados. Segurar a camada pigmentado da retina com uma pinça embotadas para estabilizar a ocular. Use outro par de pinças fechadas de provocar muito suavemente toda a retina intacta fora da parte posterior do olho. Evite beliscar, puxar, ou puxando a retina diretamente.
6. Use pequenas tesouras para cortar a molaa área onde o nervo óptico ainda está ligado à retina.
7. Certifique-se de cortar qualquer epitélio pigmentar residual ou tecido escleral da retina.
8. Usando uma pipeta de transferência, muito gentilmente transferir a retina isolado a um Sylgard limpo revestido 35 milímetros x 10 mm placa de Petri contendo PBS fresco.

9. Retina Preparação Whole-Mount

1. Uma vez no prato Sylgard, utilize uma pinça e uma agulha de cacto para fixar a retina no lugar. Manter a camada de células ganglionares da retina para cima e para baixo do nervo óptico. forma hemisférica da retina é notável, mesmo após a fixação. A curvatura da retina vai enrolar para o tecto, quando a camada de células ganglionares da retina é na orientação desejada.
2. Use pequenas tesouras para cortar a retina em quatro quadrantes, fazendo a forma de um trevo de quatro folhas irradiando a partir da cabeça do nervo óptico.
3. Pin os quadrantes da retina com agulhas de cactos adicionais para tornar a retina o mais plano possível withoUT alongamento (Figura 5).
4. Fixar as retinas fixados no prato Sylgard com 3 ml de paraformaldeído a 4% O / N à temperatura ambiente.

10. Coloração de anticorpos de Retina

Nota: as retinas mancha fixas com anticorpos primários e secundários para a visualização de neurónios da retina (Figura 6).

1. Lavar, retinas planas montadas fixas três vezes para 2 min cada em PBS.
2. Permeabilizar as retinas com 1% de Triton X-100 com soro bovino fetal a 1% em PBS durante 60 min.
3. Enxaguar retinas três vezes, 2 minutos cada, com PBS.
4. Lavar duas vezes com 0,1% de Triton X-100 em PBS, 5 minutos por lavagem.
5. Lavar duas vezes com PBS, 5 min por lavagem.
6. Incubar com 1% de Triton X-100 e soro fetal de bovino a 1% em PBS à temperatura ambiente durante 45 min.
7. Lavar duas vezes com 0,1% de Triton X-100 em PBS, 5 minutos por lavagem.
8. Lavar duas vezes com PBS, 5 min por lavagem.
9. Incubar cada retina em soro fetal bovino a 3 ml de 1% em PBScom rato purificada anti-rato CD90 / rato CD90.1 (diluição 1: 300) O / N à temperatura ambiente.
10. Lavar uma vez com retinas 0,1% de Triton X-100 em PBS durante 5 min.
11. Lavar duas vezes com PBS, 5 min por lavagem.
12. Incubar cada retina em 3 ml de PBS (sem FBS) com Alexa Fluor 594 anticorpo de cabra anti-IgG de ratinho secundário (1: 300) O / N à temperatura ambiente.
13. Lavar as retinas com PBS liberalmente.
14. Usando um microscópio de dissecação, remover cuidadosamente agulhas cacto da retina.
15. Gentilmente transferir retinas em lâminas de microscópio com uma pipeta de transferência. Certifique-se de manter a orientação com a camada de células ganglionares da retina de frente para o teto. forma hemisférica da retina é notável, mesmo após a fixação. A curvatura da retina vai enrolar para o tecto, quando a camada de células ganglionares da retina é na orientação desejada.
16. Absorve o excesso de PBS com Kimwipe ou outro material, tais absorvente. Tenha cuidado para não absorver a retina.
17. Adicione 5 gotas de ½ glicerol e ½ PBS em peso, como ammedia ONTAGEM.
18. Cubra retina com lamela, evitando bolhas de ar.
19. Seguro lamela usando clara polonês prego, cola, ou outro adesivo.

Resultados

Esta seção ilustra os componentes do aparelho e procedimento utilizados para induzir condições de glaucoma-like em um modelo de glaucoma in vivo de ratos. Mostramos as ferramentas individuais e o equipamento usado para realizar uma injecção de solução salina hipertónica, que provoca um aumento na pressão intra-ocular. Mostramos a injecção no plexo venoso episcleral com o seu efeito de branqueamento característica e o aspecto turvo do que resulta da câmara anterior....

Discussão

Este protocolo descreve um método de induzir condições de glaucoma semelhante em um modelo de rato in vivo em. Este procedimento utiliza uma injecção de solução salina hipertónica para induzir a formação de cicatrizes na malha trabecular ^{29, 32.} O desenvolvimento de tecido de cicatriz oclui o escoamento do humor aquoso, que aumenta a pressão na câmara anterior. Com a diminuição da vazão e pressão construir, a lente suspensa por ligamentos elásticos empurra de volta para a câmara ví...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Xylazine hydrochloride, Minimum 99%	Sigma, Life Science	X1251-1G
Ketamine hydrochloride injection, USP, 100mg/ml	Putney, Inc	NDC 26637-411-01	10 ml bottle
Acepromazine Maleate, 10mg/ml	Phoenix Pharmaceutical, Inc	NDC 57319-447-04, 670008L-03-0408	50 ml bottle
Serum bottle, 10 ml	VWR	16171319	Borosilicate glass
1 ml insulin syringe	VWR	BD329410	28 G needle
Sodium chloride	Sigma	S7653	2 M Solution
Microelectrode Puller	Narishige Group	PP-830
Heavy Polished Standard and Thin Walled Borosilicate Tubing	Sutter Instruments	B150-86-10HP	without filament, 0.86 mm
Microfil syringe needle for filling micropipettes	World Precision Instruments, Inc	MF28G
18 gauge Luer-Lock needle	Fisher Scientific	1130421	Syringe needle
Flexible Polyethylene Tubing	Fisher Scientific	22046941	0.034 inch diameter, approximately 10 inches
Proparacaine Hydrochloride Opthalmic Solution, USP, 0.5%	Akorn, Inc	NDC 17478-263-12	15 ml  sterile bottle
Curved Scissors	Fine Science Tools	14061-11
Microscope	Leica	StereoZoom 4
Hemostat Clamp	Fine Science Tools	1310912	curved edge
Triple Antibiotic Ointment	Fisher Scientific	NC0664481
Scalpel handle	Fine Science Tools	10004-13
Scalpel blade #11	Fine Science Tools	10011-00
60 mm x 15 mm Disposable Petri Dish	VWR	351007
Phosphate Buffered Saline 10x Concentrate	Sigma, Life Science	P7059-1L	1x dilution
Spring Scissors	Fine Science Tools	15009-08
Forceps (2), Dumont # 5	Fine Science Tools	11251-30
3 ml Transfer Pipets, polyethylene, non sterile	BD Biosciences	357524 or 52947-948	1 and 2 ml graduations
35 mm x 10 mm Easy Grip Petri Dish	BD Biosciences	351008
Sylgard 184	VWR	102092-312
Cactus Needles
Paraformaldehyde	EMD Millipore	PX0055-3 or 818715.0100	Made into a 4% solution
Triton X-100	Sigma	T9284-100 ml	Made into both a 1% and 0.1% solution
Fetal Bovine Serum	Atlanta Biological	S11150	500 ml
Purified Mouse Anti-Rat CD90/mouse CD90.1	BD Pharmingen	Cat 554892	1:300 dilution
Alexa Fluor 594 goat anti-mouse	Life Technologies	A11005	1:300 dilution
Microscope Slides	Corning	2948-75x25
Glycerol	Sigma	G5516-100 ml	50% glycerol to 50% PBS, by weight
Coverglass	Corning	2975-225	Thickness 1 22 x 50 mm
Confocal Microscope	Nikon	C2 Eclipse Ti