緑内障誘導の手順<em&gt;インビボ</em&gt;ラットモデルと全体のマウント網膜準備

要約

Glaucoma is characterized by damage to retinal ganglion cells. Inducing glaucoma in animal models can provide insight into the study of this disease. Here, we outline a procedure that induces loss of RGCs in an in vivo rat model and demonstrates the preparation of whole-mount retinas for analysis.

要約

緑内障は、網膜神経節細胞（RGC）に影響する中枢神経系の疾患です。視神経を構成するRGC軸索は、視覚のための脳に視覚入力を運びます。 RGCとその軸索の損傷は、視力低下および/または失明につながります。緑内障の特定の原因は不明であるが、疾患の主要な危険因子は、高眼圧です。動物モデルにおける緑内障を誘発する手順は、RGC死のメカニズムを研究する研究者にとって貴重なツールです。このような情報は、視力低下の予防に役立つ可能性があり効果的な神経保護治療法の開発につながることができます。 2 M高張食塩水の50μlを上強膜静脈叢に注入されたin vivoでのラットモデルにおける条件のように-本稿におけるプロトコルは、緑内障を誘導する方法を説明します。血管の白化は、成功した注射を示しています。この手順は、緑内障をシミュレートするために、RGCの損失を引き起こします。次の一ヶ月注射は、動物を屠殺し、眼を除去します。次に、角膜、レンズ、および硝子体は、アイカップを作るために除去されます。網膜は、その後、目の奥から剥離し、サボテン​​の針を使用して、シルガード皿上に固定されています。この時点で、網膜のニューロンは、分析のために染色することができます。このラボからの結果は、内部統制と比較した場合、RGCの約25％は、手順の1カ月以内に失われていることを示しています。この手順は、 インビボでラット緑内障モデルにおける網膜神経節細胞死の定量的分析を可能にします。

概要

緑内障は、具体的には、網膜神経節細胞^1-2、網膜内ニューロンに影響を及ぼす眼疾患群です。これらの細胞の軸索は、視力が知覚される脳に視覚情報を運ぶ視神経になるように収束します。 RGCとその軸索の損傷は、したがって、視覚的な欠陥を引き起こします。

緑内障の障害に関連する主要な特性は、RGCの変性と死、眼圧の上昇（IOP）、および視神経乳頭陥凹と萎縮しています。これらの機能は、視野欠損、または完全な、不可逆的な失明につながります。現在、緑内障は、世界中7000万人³に失明を引き起こしました。このように、それは失明⁴の世界第三位の原因です。

緑内障におけるRGC死の正確なメカニズムは不明のまま。多くの研究は謎のロックを解除するために行われてきました。緑内障の主要な危険因子が増加Iであることが知られています眼の前房内の房水（AH）の不規則な循環へのn眼圧。 AHは、眼の無血管前房内の血液のための無色透明の代替として機能します。それは、周囲の細胞に栄養を与える代謝プロセスから分泌された老廃物を除去し、神経伝達物質を搬送し、病理学的状態¹の間に薬や眼内の炎症細胞の循環を可能にします。

房水循環の維持は毛様体および小柱網を必要とします。房水は、毛様体により産生されます。その後、眼組織の全体的な健康を維持するために、前房に流入します。 75 - 流体は毛様体筋における海綿状組織の3層を介して濾過されたときに、房水流出の80％が積極的に非色素毛様体上皮を介して分泌されます。小柱網を通じて、どの優先使用シュレム管を通る流体の出口20残りの血液系^5【選択に新設-流出の25％は、小柱網をバイパスして受動的にuveo -強膜経路を介して限外濾過し、拡散によって分泌されます。この経路は、眼圧¹の相対的に独立であるように見えます。

房水の生産と流出がバランスの外にある場合、圧力は、目の中に構築します。上述のように、眼圧の増加は、緑内障の発症における主要な危険因子です。このような圧力は、目の奥の網膜における神経細胞の複雑な層への損傷を引き起こします。視神経の網膜神経節細胞の軸索の損傷は、もはや正確な視覚情報を受け取るには、脳を引き起こしません。その結果、視覚の認識は失われ、完全な失明が発生する可能性があります。

現在までに、緑内障の治療法は存在しません。別の治療法は、主に眼内圧を低下させることを目指していること存在します。これらは、局所含みますこのようなベータアドレナリン受容体遮断薬などの薬物クラス、または局所プロスタグランジン類似体。ベータ遮断薬は、房水⁷の産生を減少させることによって眼圧を低下させます。プロスタグランジンは、房水^8~14の流出を増加させることにより、IOPを低下させるように機能します。アルファアドレナリン作動薬および炭酸脱水酵素阻害剤はまた、治療の二次方法として使用されています。アルファアドレナリン作動薬は、ブドウ膜強膜経路^15-17を介して流出を増加させます。炭酸脱水酵素阻害剤、酵素阻害¹⁸ AHの産生を減少させます。はるかに侵襲的な手順はまた、緑内障を治療するために使用されています。レーザー線維柱帯形成術は、房水¹⁹の流出を増加させるために使用されます。線維柱帯切除術と呼ばれる別の外科的治療は、従来の小柱経路が^20-21ブロックされたときにAHをフィルタリングするための代替排水サイトを作成します。

これらの治療の選択肢は、EFFに知られていますectively IOPを低下させます。しかし、緑内障患者の最大40％が、より完全な治療法の必要性を示す正常なIOPレベルを示す^{。22,23は、}さらにそれが始まり、現在の治療は、疾患の進行を停止しないと、緑内障で見られる網膜神経節細胞死は不可逆的です^24-28。これは、神経細胞自体の生存をターゲットに効果的な神経保護治療の必要性を強調しています。緑内障モデルの開発は、この開発のために重要です。

本研究では、元々モリソン²⁹によって概説修飾手順を用いて、成体のロングエバンスラットの緑内障のような効果を誘導する方法を実証しています。この手順では、上強膜静脈叢に2 M高張生理食塩水の注射は、眼圧の上昇とワットRGCの有意な損失につながる小柱網で房水の流出を減らすために組織を瘢痕により、緑内障のような条件を誘発します手順^30-31の1ヶ月ithin。このような、ここで説明したものと緑内障を誘発する手順は、緑内障治療における新たな展開のロックを解除するための鍵であってもよいです。

プロトコル

動物被験体を使用して、すべての手順は、ウェスタンミシガン大学の動物実験委員会（IACUC）の研究所の基準に準拠していました。

1.動物

1. 本研究で雌雄ラットに生後3ヶ月を使用してください。
2. 食料と水に自由にアクセスさせて12時間の明/暗サイクルで動物を保​​管してください。

動物麻酔のためのKAXカクテルの調製

1. 1 mLのアセプロマジン（10mg / ml）および蒸留水3mlで5 mlのケタミン（100 mg / mlで）にキシラジン（20 mg / mlで）50mgを溶解します。完全に混合。
2. シリンジフィルターで滅菌し、10ミリリットルの血清ボトルにこのソリューションを保存します。

3. KAXインジェクション

1. 動物（g）を秤量し、注射の準備ができるまで、ケージに戻します。
2. 28 G針で1mlのインスリンシリンジを用いて、腹腔内に0.1 mlのKAX / 100gの動物の体重を注入します。
3. 許可します動物のために無意識になるために。足と尾をつまんで反射神経をチェックしてください。
4. 安全に手術期間中のラボですべての動物を保管してください。
5. 術後、それらのケージに動物を交換し、意識が回復されるまで、RTで快適に保ちます。動物のみが目覚めたときに動物施設に動物を返し、通常の動作を再開します。

手術およびマイクロニードルアセンブリ4.準備

1. 無菌の2 M NaCl溶液を作ります。
2. 2細かくテーパーガラスマイクロニードル（ 図1D、図1E）に1 0.86ミリメートル、内径重い研磨標準と薄い壁ホウケイ酸チューブを引っ張って微小電極プラー（ 図1C）を使用します。
3. 埋め戻しの注射針と1ml注射器（ 図1B）を使用して、2 M生理食塩水で前の手順から1マイクロニードルを埋め戻し。電極の先端から気泡をタップします。
4. 2 Mで第1ミリリットル注射器を埋めますNaClを。 18 G針を接続し、ポリエチレンチューブ（ 図1A）の長さ（約10インチ）を添付。針を介して生理食塩水でポリエチレン管を埋めるために、シリンジのプランジャーを使用してください。
5. マイクロニードルとチューブの両方を生理食塩水で満たされている場合には、慎重に2を接続してください。それらの間の接続（ 図2）内の任意の空気を排除します。
6. 細かくコースペーパータオルの粒に対して非常に軽くこすることによってマイクロニードルの先端を面取り。
7. 液体の細い流れは、ペーパータオル上で見ることができるようになるまで静かにシリンジのプランジャーを押すことによってマイクロニードルの抵抗を確認してください。液体の流れは、0.5ミリメートルよりも広いべきではありません。

動物の5.準備

1. 適用1から2は、角膜（プロパラカイン塩酸塩点眼液、USP 0.5％）に局所麻酔薬をドロップします。何の眼反射が発生しなくなるまで待ちます。
2. ハサミでウィスカーをト​​リミング。
3. S実験的な目の周りベータダイン液と綿棒エリアで綿棒をaturate。
4. 顕微鏡を使用して、目を膨らみ強膜上静脈を露出させ、目の動きを制限するには、下部まぶたをクランプするように止血剤を添付します。 （ 図3、矢印）

6.緑内障誘導生理食塩水注射

1. マイクロニードルアセンブリおよび動物を製造する場合、注射を開始します。
2. 動物が足/テールピンチに反応しないことが確認された場合には、慎重に静脈（ 図3、白矢印）に10と20度との間に低角度で来ることにより、マイクロニードルと強膜上静脈を突き刺します。血液はマイクロニードル（ 図3、黒い矢印）の先端に入ったときに静脈に成功したパンクは明らかです。
3. ゆっくりと手動で静脈に約50μlの生理食塩水を注入します。これは、約10秒を取る必要があります。静脈意志塩のthro循環するように白く、白ぐふ血管系（ 図4、矢印）。一部の地域は、血液の赤い外観（ 図4、矢印）を維持することができます。
   1. 完全な網膜神経節細胞層への徹底した網膜の損傷を確実にするために、対向する第1の部位に、静脈に二回目の注射を実行します。
      注：塩は、血管系を循環するように数分以内に、1は、目の虹彩を通じて明確な曇った外観が表示されるはずです。
4. 内部コントロールとして使用するための未処理の反対の目を​​残します。

7.動物の回復

1. 止血剤を削除します。
2. 止血剤によって、および注射部位にクランプサイトに三重の抗生物質軟膏（バシトラシン亜鉛、硫酸ネオマイシン、polymysin B硫酸塩）を適用するために綿棒を使用してください。目の周りの組織の損傷は、止血剤を使用して発生しません。
3. > PREVする循環温水毛布の上にケージ内麻酔動物を配置しますENT低体温。意識と通常の動作が回復するまで観察下に動物を保管してください。バック動物コロニーに目を覚まし、動物を輸送します。動物は屠殺時まで植民地に残ります。

8.動物の犠牲と網膜の取り外し

1. 緑内障を誘発する手順を、次の1ヶ月、動物をCO ₂窒息と二胸椎穿刺によって安楽死させます。
   1. チャンバー内に動物を置き、しっかりとふたを置きます。
   2. 20％体積/分でCO ₂の変位を可能にするために、CO ₂ガス調整弁を開き チャンバー内の酸素。
   3. 期限切れに動物のために4〜5分を許可します。
   4. 両方のバルブをオフにします。
   5. チャンバーから動物を削除し、滅菌メスで二胸椎穿刺を行います。
2. 安楽死の後、目の周囲の眼窩内の結合組織を切断するためにメスを使用して、BEI眼球自体に切らないように注意してくださいngの。
3. 慎重に無傷の眼球を抽出するために視神経と残りの組織を切断するために湾曲した縁部のはさみを使用しています。新鮮なPBSを含む滅菌60ミリメートルX 15ミリメートルの使い捨てペトリ皿に抽出された眼球を配置します。
4. 眼球からアイカップを作ります。これを行うには、メスで小切開を行うだけで、虹彩と強膜との境界に後方。眼球から角膜半球を除去するために、小さな春のハサミで目の周囲に、この切開に従ってください。視神経に接続された半球が残ります。
5. 安楽死させた動物からのアイカップの内側に非常に薄いピンク/ベージュ網膜を探します。アイカップを安定化させるために鈍化鉗子で網膜色素上皮層を保持します。非常に優しく、目の奥のオフ全体無傷の網膜をいじめるために、閉じた鉗子の別のペアを使用してください。 、ピンチ引っ張り、または直接網膜を引っ張ることは避けてください。
6. カットする小さな春のはさみを使用視神経がまだ網膜に装着されているエリア。
7. 網膜から残留色素上皮または強膜組織を切り取るようにしてください。
8. トランスファーピペットを使用して、非常に静かに新鮮なPBSを含む35ミリメートル×10ミリメートルペトリ皿を被覆したクリーンなシルガードに孤立した網膜を転送します。

9.ホールマウント網膜準備

1. いったんシルガード皿で、場所で網膜を固定する鉗子と1サボテンの針を使用します。上向きに網膜神経節細胞層を維持し、ダウン視神経。網膜の半球形状も定着後の注目すべきです。網膜神経節細胞層が所望の向きにあるとき、網膜の曲率は、天井に向かってカールします。
2. 視神経乳頭から放射状に四つ葉のクローバーの形を作り、4つの象限に網膜をカットするために、小さなはさみを使用してください。
3. 可能なwithoとして網膜は限り平坦にするために追加のサボテンの針を持つ網膜の象限をピンストレッチUT（ 図5）。
4. RTで4％パラホルムアルデヒドO / Nの3ミリリットルとのSylgard皿で固定網膜を修正しました。

網膜の10抗体染色

注：ステインが（ 図6）網膜におけるニューロンを表示するための一次および二次抗体を用いた網膜を固定。

1. 固定、フラットマウントされた網膜をPBS中で2分間、3回洗浄します。
2. 60分間、PBS中の1％ウシ胎児血清、1％トリトンX-100で網膜を透過。
3. すすぎは、PBS中で3回、2分毎に、網膜。
4. PBS中0.1％トリトンX-100、洗浄当たり5分で二回リンス。
5. 、PBSで2回洗浄当たり5分を洗い流します。
6. 45分間室温でPBS中の1％トリトンX-100および1％ウシ胎児血清をインキュベートします。
7. PBS中0.1％トリトンX-100、洗浄当たり5分で二回リンス。
8. 、PBSで2回洗浄当たり5分を洗い流します。
9. PBSで3ミリリットルの1％ウシ胎児血清中の各網膜をインキュベート精製したマウス抗ラットCD90 /マウスCD90.1（1：300希釈）O / RTでN。
10. 5分間、PBS中の0.1％トリトンX-100で一回網膜をすすぎます。
11. 、PBSで2回洗浄当たり5分を洗い流します。
12. 二アレクサフルオロ594ヤギ抗マウスIgGを用いて3 mlのPBS（無FBS）の各網膜をインキュベートし（1：300）O / RTでN。
13. 気前PBSで網膜を洗ってください。
14. 解剖顕微鏡を使用して、慎重に網膜からサボテンの針を削除します。
15. 静かに転送ピペットを用いて顕微鏡スライド上に網膜を転送します。天井に直面している網膜神経節細胞層との方向を維持するようにしてください。網膜の半球形状も定着後の注目すべきです。網膜神経節細胞層が所望の向きにあるとき、網膜の曲率は、天井に向かってカールします。
16. キムワイプまたは他のこのような吸収性材料を用いて余分なPBSを吸収します。網膜を吸収しないように注意してください。
17. 1/2グリセリン5滴を追加し、午前のように重量PBS 1/2ountingメディア。
18. 気泡を避け、カバーガラスと網膜をカバーしています。
19. 明確なマニキュア、接着剤、または他の接着剤を用いてカバーガラスを固定します。

結果

このセクションでは、 インビボでラット緑内障モデルにおける緑内障のような状態を誘導するために使用される装置部品及び手順を示します。我々は、眼圧の上昇を引き起こす高張食塩水の注入を実行するために使用される個々のツールおよび機器を示します。私たちは、その特徴的なブランチング効果と結果前房の曇った外観を持つ強膜上静脈叢への注入を...

ディスカッション

このプロトコルは、 インビボのラットモデルにおける緑内障のような状態を誘導する方法を記載しています。この手順は、小柱網^29、32に瘢痕化を誘導するために高張食塩水の注入を使用しています。瘢痕組織を開発する前房に圧力を増加させ、房水の流出を閉塞します。減少した流出圧力が構築して、弾性靱帯によって吊り下げレンズはバック硝子体腔内に押し込みます。硝...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Xylazine hydrochloride, Minimum 99%	Sigma, Life Science	X1251-1G
Ketamine hydrochloride injection, USP, 100mg/ml	Putney, Inc	NDC 26637-411-01	10 ml bottle
Acepromazine Maleate, 10mg/ml	Phoenix Pharmaceutical, Inc	NDC 57319-447-04, 670008L-03-0408	50 ml bottle
Serum bottle, 10 ml	VWR	16171319	Borosilicate glass
1 ml insulin syringe	VWR	BD329410	28 G needle
Sodium chloride	Sigma	S7653	2 M Solution
Microelectrode Puller	Narishige Group	PP-830
Heavy Polished Standard and Thin Walled Borosilicate Tubing	Sutter Instruments	B150-86-10HP	without filament, 0.86 mm
Microfil syringe needle for filling micropipettes	World Precision Instruments, Inc	MF28G
18 gauge Luer-Lock needle	Fisher Scientific	1130421	Syringe needle
Flexible Polyethylene Tubing	Fisher Scientific	22046941	0.034 inch diameter, approximately 10 inches
Proparacaine Hydrochloride Opthalmic Solution, USP, 0.5%	Akorn, Inc	NDC 17478-263-12	15 ml  sterile bottle
Curved Scissors	Fine Science Tools	14061-11
Microscope	Leica	StereoZoom 4
Hemostat Clamp	Fine Science Tools	1310912	curved edge
Triple Antibiotic Ointment	Fisher Scientific	NC0664481
Scalpel handle	Fine Science Tools	10004-13
Scalpel blade #11	Fine Science Tools	10011-00
60 mm x 15 mm Disposable Petri Dish	VWR	351007
Phosphate Buffered Saline 10x Concentrate	Sigma, Life Science	P7059-1L	1x dilution
Spring Scissors	Fine Science Tools	15009-08
Forceps (2), Dumont # 5	Fine Science Tools	11251-30
3 ml Transfer Pipets, polyethylene, non sterile	BD Biosciences	357524 or 52947-948	1 and 2 ml graduations
35 mm x 10 mm Easy Grip Petri Dish	BD Biosciences	351008
Sylgard 184	VWR	102092-312
Cactus Needles
Paraformaldehyde	EMD Millipore	PX0055-3 or 818715.0100	Made into a 4% solution
Triton X-100	Sigma	T9284-100 ml	Made into both a 1% and 0.1% solution
Fetal Bovine Serum	Atlanta Biological	S11150	500 ml
Purified Mouse Anti-Rat CD90/mouse CD90.1	BD Pharmingen	Cat 554892	1:300 dilution
Alexa Fluor 594 goat anti-mouse	Life Technologies	A11005	1:300 dilution
Microscope Slides	Corning	2948-75x25
Glycerol	Sigma	G5516-100 ml	50% glycerol to 50% PBS, by weight
Coverglass	Corning	2975-225	Thickness 1 22 x 50 mm
Confocal Microscope	Nikon	C2 Eclipse Ti