녹내장 유도 절차<em&gt; 생체</em&gt; 쥐 모델 및 전체 마운트 망막 준비

요약

Glaucoma is characterized by damage to retinal ganglion cells. Inducing glaucoma in animal models can provide insight into the study of this disease. Here, we outline a procedure that induces loss of RGCs in an in vivo rat model and demonstrates the preparation of whole-mount retinas for analysis.

초록

녹내장은 망막 신경절 세포 (망막 신경절 세포)에 영향 중추 신경계 질환이다. 시신경을 구성하는 RGC 축삭은 시각적 인식에 대한 뇌 영상 입력을 수행한다. 망막 신경절 세포 및 축삭 손상은 시력 상실 및 / 또는 실명에 이르게. 녹내장의 특정 원인 불명이지만, 병의 주 위험 인자 안압 상승이다. 동물 모델에서 녹내장 유발 절차는 RGC 죽음의 메커니즘을 공부하는 연구자들에게 유용한 도구입니다. 이러한 정보는 시력 상실의 예방에 도움이 있었다 효과적인 신경 보호 치료제의 개발로 이어질 수있다. 2 M 고장 성 식염수 50 μL가 상공 막 정맥총 주입되는 생체 래트 모델에서와 같은 조건 -이 문서에서 프로토콜 녹내장을 유도하는 방법을 설명한다. 선박의 창백 성공적인 주사를 나타냅니다. 이 절차는 녹내장을 시뮬레이션하는 망막 신경절 세포의 손실이 발생합니다. 다음 한 달주입, 동물 희생하고 눈은 제거됩니다. 다음으로, 각막, 렌즈, 유리체는 아이 컵을 제거한다. 망막은 안구의이면으로부터 박리 선인장 바늘을 사용하여 실 가드 접시에 고정된다. 이 시점에서, 망막 신경 세포 분석을 위해 염색 할 수있다. 이 실험의 결과는 내부 통제에 비해 망막 신경절 세포의 약 25 %가 절차의 1 개월 이내에 손실 된 것으로 나타났다. 이 절차는 생체 녹내장 래트 모델의 망막 신경절 세포 사멸의 정량 분석을 허용한다.

서문

녹내장은 구체적으로는, 망막 신경절 세포 ^1-2, 망막 신경 세포에 영향을 눈 질환 군이다. 이러한 세포의 축삭 비전 인식되고 뇌에 시각 정보를 전달하는 시신경 될 모이다. 망막 신경절 세포 및 축삭 손상 때문에 시각적 결함을 발생합니다.

녹내장 질환과 관련된 주요 특성은 RGC 변성과 죽음, 증가 된 안압 (IOP), 및 광학 디스크 부항과 위축이다. 이러한 기능은 시야 손실 또는 전체, 돌이킬 수없는 시력 상실로 이어집니다. 현재 녹내장은 전 세계적으로 7천만명 ³ 실명가 발생했습니다. 따라서, 그것은 실명 ^(4)의 세계에서 세 번째로 큰 원인이다.

녹내장의 RGC 죽음의 정확한 메커니즘은 알 수없는 남아 있습니다. 많은 연구는 신비의 잠금을 해제하기 위해 수행되었다. 녹내장의 주요 위험 인자는 증가 나는 것을 그러나 알려져때문에 눈의 전방에서 수성 유머 (AH)의 불규칙한 순환에 n 개의 안압. AH는 눈의 무혈성 전방에 혈액 투명하고 무색의 대체 역할을합니다. 또한, 주변 셀 영양 대사 과정에서 분비 노폐물을 제거하고, 신경 전달 물질을 수송 및 병적 상태 ^일 동안 약물과 안구 내 염증 세포의 순환을 허용한다.

방수 순환의 유지 보수는 모양체와 섬유주을 포함한다. 방수는 모양체에 의해 생성된다. 그러므로 안구 조직의 전반적인 건강을 유지하기 위해 전방으로 흐른다. (75) - 유체가 모양체 근육의 해면 조직의 세 가지 레이어를 통해 여과 될 때 방수 유출의 80 %는 적극적으로 비 안료 섬모 상피를 통해 분비된다. 섬유주를 통해 어느 EMPT Schlemm의 운하를 통해 유체 종료(20)에 남아있는 혈액 계 ⁵ 국지적으로 이거 - 유출의 25 %는 섬유주를 무시하고 수동적으로 uveo - 공막 경로를 통해 한외 여과 및 확산에 의해 분비된다. 이 경로는 안압 ^1의 비교적 독립적으로 나타납니다.

방수의 생산과 유출이 균형을 때, 압력은 눈에서 작성합니다. 언급 한 바와 같이, 안압의 증가는 녹내장의 개발에 주요 위험 인자이다. 이러한 압력은 눈 뒤쪽의 망막 신경 세포의 복잡한 층에 손상을 야기한다. 시신경의 망막 신경절 세포의 축삭 손상은 더 이상 정확한 시각 정보를 수신하지 않으려면 뇌가 발생합니다. 그 결과, 시각 인식이 손실되고 완전한 실명이 발생할 수있다.

현재까지 녹내장에 대한 치료가 없습니다. 다른 처리 방법은 주로 안압을 감소시키는 것을 목표로 존재한다. 이러한 국소 포함이러한 베타 - 아드레날린 수용체 차단제, 또는 국소 프로스타글란딘 유사체와 같은 약물 클래스. 베타 차단제는 방수 ^(7)의 생산을 감소시켜 안압을 감소시킨다. 프로스타글란딘은 방수 ^8-14의 유출을 증가시킴으로써 IOP를 감소시키는 기능을한다. 알파 아드레날린 성 작용제 및 탄산 탈수 효소 저해제는 또한 보조 치료 방법으로 사용된다. 알파 아드레날린 작용제는 uveoscleral 경로 ^15-17을 통해 유출을 증가시킨다. 탄산 탈수 효소 저해제는 효소 저해 ¹⁸ AH의 생산을 감소시킨다. 훨씬 더 침습적 절차는 녹내장을 치료하는 데 사용하고있다. 레이저 섬유주은 방수 ^(19)의 유출을 증가시키기 위해 사용된다. 섬유주 절제술이라는 또 다른 수술 치료, 전통 소주 경로가 ^20-21 차단 될 때 AH를 필터링 할 수있는 대안 배수 사이트를 만듭니다.

이러한 치료 방법은 EFF 것으로 알려져ectively 안압을 감소시킨다. 그러나, 녹내장 환자의 40 %가 더 완전한 치료 방법에 대한 필요성을 나타내는 정상 IOP 레벨을 나타낸다. ^{(22, 23)는} 또한 그것의 시작과 현재 치료 질환의 진행을 중지하지 일단 녹내장 볼 망막 신경절 세포의 사멸은 비가역 ^24-28. 이 뉴런 자체의 생존을 타겟팅 효과적인 신경 치료에 대한 필요성을 강조하고있다. 녹내장 모델의 개발이 개발에 매우​​ 중요합니다.

본 연구에서 우리는 원래 모리슨 ^(29)에 의해 설명 된 절차를 사용하여 변형 성인 긴 에반스 쥐들 녹내장과 같은 효과를 유도하는 방법을 설명한다. 이 과정에서, 상공 막 정맥총에 2 M 고장 성 식염수 주사 안압의 증가 및 망막 신경절 세포의 상당한 손실 w 선도 섬유주에 방수 유출을 줄이기 위해 조직 흉터 녹내장과 같은 조건을 유도절차 ^30-31 한 달 ithin. 이러한 여기에 설명 된 것과 녹내장 유발 절차, 녹내장 치료의 새로운 발전을 잠금 해제의 열쇠가 될 수 있습니다.

프로토콜

동물의 주제를 사용하는 모든 절차는 웨스턴 미시간 대학의 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)의 학회의 기준에 따라왔다.

1. 동물

1. 이 연구에서 남성과 여성의 쥐에게 세 3 개월을 사용합니다.
2. 음식과 물을 무료로 액세스 할 수있는 12 시간 빛 / 어둠주기에서 동물을 유지합니다.

동물 마취에 대한 KAX 칵테일 2. 준비

1. 1 ml의 아세 프로 마진 (10 ㎎ / ㎖) 및 증류수 3 ㎖에 5 mL의 케타민 (100 ㎎ / ㎖)의 자일 라진 (20 ㎎ / ㎖) 50 mg을 녹인다. 철저하게 섞는다.
2. 주사기 필터 소독 및 10 ml의 혈청 병에이 솔루션을 저장합니다.

3. KAX 주입

1. 동물 (g)을 달아 주입을위한 준비가 될 때까지 케이지로 돌아갑니다.
2. 28 G 바늘을 1 ml의 인슐린 주사기를 사용하여 0.1ml를 복강 KAX / 100g 동물 체중을 주입.
3. 허용하다동물에 대한 의식이 될 수 있습니다. 발과 꼬리를 곤란하여 반사를 확인합니다.
4. 수술 기간 동안 안전하게 실험실에서 모든 동물을 유지합니다.
5. 포스트 수술은 자신의 새장에 동물을 교체하고 의식이 회복 될 때까지 RT 편안한 유지합니다. 만 동물이 각성 할 때 동물 시설에 동물을 반환하고 정상적인 동작을 다시 시작합니다.

외과 및 미세 조립 4. 준비

1. 멸균 2 M NaCl 용액을 확인합니다.
2. 이 미세하게 테이퍼 유리 미세 바늘 (그림 1D, 그림 1E)로 한 0.86 mm 내경에게 무거운 연마 표준 및 얇은 벽으로 둘러싸인 붕 규산염 관을 끌어 미세 전극 풀러 (그림 1C)를 사용합니다.
3. 2 M 식염수 메우기 주사기 바늘과 1 ML의 주사기 (그림 1B)를 사용하여 이전 단계에서 하나의 미세 백필. 전극의 선단으로부터 기포를 탭.
4. 2 M과 제 1 ML의 주사기를 채우염화나트륨. 18 G 바늘을 연결 한 다음 폴리에틸렌 튜브 (그림 1A)의 길이 (약 10 인치)에 연결합니다. 바늘을 통하여 식염수 폴리에틸렌 튜브를 채우기 위해 주사기 플런저를 사용한다.
5. 미세 바늘과 튜브 모두 식염수로 가득 할 때, 조심스럽게 두 가지를 연결합니다. 그들 사이의 접속 (도 2)에 공기를 제거한다.
6. 미세 물론 종이 타월의 입자에 대해 매우 가볍게 긁어하여 미세 바늘의 끝을 베벨.
7. 부드럽게 액체 미세 스트림 종이 타월에 보일 때까지 주사기 플런저를 밀어 미세 바늘의 저항을 확인한다. 액체의 흐름은 0.5 mm보다 넓은 없어야합니다.

동물의 5. 준비

1. 2 방울 각막에 국소 마취제 (Proparacaine 염산염 안과 솔루션, USP, 0.5 %) - 1을 적용합니다. 더 안구 반사가 발생하지 않을 때까지 기다립니다.
2. 가위로 수염을 손질.
3. 에스실험 눈 주위 betadine 용액과 면봉 공간이있는 코튼 팁 어플리케이터를 aturate.
4. 현미경을 사용하여, 눈을​​ 팽창 상공 막 정맥을 노출하고 눈의 움직임을 제한하기 위해 아래 눈꺼풀을 고정하기 위해 지혈을 연결합니다. (그림 3, 화살표)

6. 녹내장 유발 식염수 주입

1. 미세 바늘 조립체 및 동물이 제조 될 때, 주사를 시작한다.
2. 동물 피트 / 꼬리 핀치에 응답하지 않는 것으로 확인되면, 조심스럽게 정맥 (그림 3, 흰색 화살표) 10과 20도 사이의 낮은 각도로 오는에 의해 미세과 상공 막 정맥을 관통. 혈액이 미세 바늘 (도 3, 검은 화살표)의 선단에 들어가면 정맥 천자 성공적인 명백하다.
3. 천천히 수동 ​​정맥 약 50 μL의 생리 식염수를 주입. 이 약 10 초 정도 소요됩니다. 정맥 것이다 소금이 죽 순환으로 희게 흰색우 혈관 (그림 4, 화살촉). 일부 지역은 피가 붉은 모양 (그림 4, 화살표)를 유지할 수있다.
   1. 전체 망막 신경절 세포 층 철저한 망막 손상을 확인하기 위해, 대향하는 제 사이트로, 정맥 내로 주입 제를 수행한다.
      참고 : 소금은 혈관 시스템을 통해 순환으로 분 이내에, 하나는 눈의 홍채를 통해 구별 흐린 모습을 볼 수 있습니다.
4. 내부 통제로 사용하기 위해 치료 반대 눈을 둡니다.

7. 동물 복구

1. 지혈을 제거합니다.
2. 지혈에 의해 주사 부위에 고정 사이트에 트리플 항생제 연고 (바시 트라 신 아연, 네오 마이신 황산염, polymysin의 B 황산)을 적용 할면 주걱을 사용합니다. 눈 주위 조직의 손상은 지혈을 사용하여 발생하지 않습니다.
3. > 순환 온수 담요에 자신의 새장에 넣어 마취 동물은 이전합니다천만에 저체온증. 의식과 정상적인 동작이 회복 될 때까지 관찰에서 동물을 유지합니다. 다시 동물의 식민지에 깨어있는 동물을 운반 할 것. 동물 희생의 시간이 될 때까지 식민지에 남아 있습니다.

8. 동물의 희생과 망막 제거

1. 녹내장을 유도하는 절차를 수행 한 달, 동물 CO ₂ 질식 및 보조 흉부 천자에 의해 안락사시켰다.
   1. 챔버에서 동물을 놓고 단단히에 뚜껑을 넣어.
   2. 20 부피 % / 분 CO ₂ 변위를 허용하는 CO ₂ 가스 조절 밸브를 열고 챔버 내의 산소.
   3. 동물이 만료하기위한 사에 5 분을 허용합니다.
   4. 두 밸브의 전원을 끄십시오.
   5. 챔버에서 동물을 제거하고 멸균 메스와 보조 흉부 천자를 수행합니다.
2. 안락사 후 눈 BEI 주변 궤도 공동 내의 결합 조직을 잘라 메스를 사용NG주의 안구 자체로 절단하지.
3. 조심스럽게 그대로 안구를 추출하는 시​​신경과 남아있는 조직을 잘라 곡선 가장자리에 가위를 사용합니다. 신선한 PBS를 포함하는 무균 60mm X 15mm 일회용 페트리 접시에서 추출 된 안구를 놓습니다.
4. 안구에서 아이 컵을합니다. 이렇게하려면 메스와 작은 절개 단지 홍채와 공막 사이의 경계에 후부합니다. 안구에서 각막 반구를 제거하는 작은 봄 가위로 눈의 둘레 주변이 절개를 수행합니다. 시신경 접속 반구 남아있다.
5. 안락사 동물에서 아이 컵 내부의 매우 얇은 핑크 / 베이지 망막을 찾을 수 있습니다. 아이 컵을 안정화 무딘 집게와 망막의 색소 층을 잡으십시오. 아주 부드럽게 눈 뒤쪽 떨어져 전체 그대로 망막을 애타게 폐쇄 포셉의 다른 쌍을 사용합니다. , 곤란 당겨, 또는 직접 망막을 잡아 당 겼하지 마십시오.
6. 를 잘라 작은 봄 가위를 사용하여시신경 여전히 망막에 부착되는 영역.
7. 망막에서 남아있는 색소 상피 또는 공막 조직을 절단해야합니다.
8. 전송 피펫을 사용하여 매우 부드럽게 신선한 PBS를 포함 35mm X 10mm 페트리 접시 코팅 깨끗한 실 가드에 고립 된 망막을 전송합니다.

9. 전체 마운트 망막 준비

1. 일단 실 가드 접시, 장소에 망막 핀 집게 하나의 선인장 바늘을 사용합니다. 이 위를 향하도록 망막 신경절 세포 층을 유지하고 아래로 시신경. 망막의 반구 모양도 고정 후 주목할 만하다. 망막 신경절 세포 층이 원하는 방향에있는 경우 망막의 곡률 천정을 향해 구부러 것이다.
2. 시신경 유두에서 발산하는 네 잎 클로버의 모양을 만들고, 네 개의 사분면으로 망막을 잘라 작은 가위를 사용합니다.
3. 가능한 witho으로 망막이 플랫하게 추가 선인장 바늘과 망막의 사분면 핀스트레칭 유타 (그림 5).
4. 4 % 파라 포름 알데히드의 O / RT에서 N의 3 ml의 실 가드 접시에 고정 된 망막을 수정합니다.

망막의 10 항체 염색

참고 : 기본 및 보조 항체와 얼룩 고정 망막을 망막에 (그림 6) 뉴런을 볼.

1. PBS에서 고정 평면 탑재 망막 2 분 동안 3 회를 씻어.
2. 60 분 동안 PBS에서 1 % 소 태아 혈청과 1 % 트리톤 X-100으로 망막 Permeabilize 하시려면.
3. 린스 PBS로 세 번, 2 분, 각각, 망막.
4. PBS에서 0.1 % 트리톤 X-100, 세척 당 5 분 두 번 씻어.
5. PBS, 세척 당 5 분 두 번 씻어.
6. 45 분 동안 실온에서 PBS 중 1 % 트리톤 X-100, 1 % 소 태아 혈청과 인큐베이션.
7. PBS에서 0.1 % 트리톤 X-100, 세척 당 5 분 두 번 씻어.
8. PBS, 세척 당 5 분 두 번 씻어.
9. PBS에서 3 ml의 1 % 소 태아 혈청에서 각 망막 부화정제 마우스 항 - 쥐 CD90 / 마우스 CD90.1 (1 : 300 희석) O / RT에서 N.
10. 5 분 동안 PBS에서 0.1 % 트리톤 X-100로 한번 씻어 망막.
11. PBS, 세척 당 5 분 두 번 씻어.
12. 보조 알렉사 플 루어 594 염소 항 - 마우스 IgG로 3 ml의 PBS (NO FBS)의 각 망막을 품어 (1 : 300) O / RT에서 N.
13. 자유롭게 PBS로 망막을 씻으십시오.
14. 해부 현미경을 사용하여 조심스럽게 망막에서 선인장 바늘을 제거합니다.
15. 조심스럽게 전송 피펫과 현미경 슬라이드에 망막을 전송합니다. 천장에 직면 망막 신경절 세포 층과 방향을 유지해야합니다. 망막의 반구 모양도 고정 후 주목할 만하다. 망막 신경절 세포 층이 원하는 방향에있는 경우 망막의 곡률 천정을 향해 구부러 것이다.
16. 킴 와이프 ​​또는 다른 흡수제로 초​​과 PBS를 흡수한다. 망막을 흡수하지 않도록주의하십시오.
17. ½ 글리세롤 5 방울을 추가하고 오전과 같은 중량 PBS 1/2ounting 미디어.
18. 공기 방울을 방지 커버 슬립으로 망막을 커버.
19. 명확한 매니큐어, 접착제, 또는 다른 접착제를 사용하여 안전 커버 슬립.

결과

이 섹션은 생체 녹내장 래트 모델 녹내장과 같은 조건을 유도하기 위해 사용되는 장치 구성 요소 및 방법을 도시한다. 우리는 안압의 증가를 일으키는 고장 성 식염수 주입을 수행하는 데 사용되는 개별 도구 및 장치를 나타낸다. 우리는 그 특성 창백 효과와 결과 전방의 흐린 외관 상공 막 정맥 얼기에 주사를 보여줍니다. 우리는 또한 망막 제거 및 손실 망막 신경?...

토론

이 프로토콜은 생체 내 쥐 모델에서 녹내장과 같은 조건을 유도하는 방법을 설명한다. 이 절차는 ^{29, 32.} 흉터 조직을 개발하는 것은 전방에 압력을 증가 방수의 유출 폐색 섬유주에 흉터를 유발하는 고장 성 식염수 주사를 사용합니다. 감소 유출 및 압력 구축으로, 탄성 인대에 의해 중단 렌즈 다시 유리체 챔버로 푸시합니다. 유리체 유머는 깨지기 쉬운 망막 신경 세포의 손상을 망?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Xylazine hydrochloride, Minimum 99%	Sigma, Life Science	X1251-1G
Ketamine hydrochloride injection, USP, 100mg/ml	Putney, Inc	NDC 26637-411-01	10 ml bottle
Acepromazine Maleate, 10mg/ml	Phoenix Pharmaceutical, Inc	NDC 57319-447-04, 670008L-03-0408	50 ml bottle
Serum bottle, 10 ml	VWR	16171319	Borosilicate glass
1 ml insulin syringe	VWR	BD329410	28 G needle
Sodium chloride	Sigma	S7653	2 M Solution
Microelectrode Puller	Narishige Group	PP-830
Heavy Polished Standard and Thin Walled Borosilicate Tubing	Sutter Instruments	B150-86-10HP	without filament, 0.86 mm
Microfil syringe needle for filling micropipettes	World Precision Instruments, Inc	MF28G
18 gauge Luer-Lock needle	Fisher Scientific	1130421	Syringe needle
Flexible Polyethylene Tubing	Fisher Scientific	22046941	0.034 inch diameter, approximately 10 inches
Proparacaine Hydrochloride Opthalmic Solution, USP, 0.5%	Akorn, Inc	NDC 17478-263-12	15 ml  sterile bottle
Curved Scissors	Fine Science Tools	14061-11
Microscope	Leica	StereoZoom 4
Hemostat Clamp	Fine Science Tools	1310912	curved edge
Triple Antibiotic Ointment	Fisher Scientific	NC0664481
Scalpel handle	Fine Science Tools	10004-13
Scalpel blade #11	Fine Science Tools	10011-00
60 mm x 15 mm Disposable Petri Dish	VWR	351007
Phosphate Buffered Saline 10x Concentrate	Sigma, Life Science	P7059-1L	1x dilution
Spring Scissors	Fine Science Tools	15009-08
Forceps (2), Dumont # 5	Fine Science Tools	11251-30
3 ml Transfer Pipets, polyethylene, non sterile	BD Biosciences	357524 or 52947-948	1 and 2 ml graduations
35 mm x 10 mm Easy Grip Petri Dish	BD Biosciences	351008
Sylgard 184	VWR	102092-312
Cactus Needles
Paraformaldehyde	EMD Millipore	PX0055-3 or 818715.0100	Made into a 4% solution
Triton X-100	Sigma	T9284-100 ml	Made into both a 1% and 0.1% solution
Fetal Bovine Serum	Atlanta Biological	S11150	500 ml
Purified Mouse Anti-Rat CD90/mouse CD90.1	BD Pharmingen	Cat 554892	1:300 dilution
Alexa Fluor 594 goat anti-mouse	Life Technologies	A11005	1:300 dilution
Microscope Slides	Corning	2948-75x25
Glycerol	Sigma	G5516-100 ml	50% glycerol to 50% PBS, by weight
Coverglass	Corning	2975-225	Thickness 1 22 x 50 mm
Confocal Microscope	Nikon	C2 Eclipse Ti