Glaucomes induisant une procédure dans un<em&gt; In Vivo</em&gt; Modèle de rat et Whole-mount Retina Préparation

Résumé

Glaucoma is characterized by damage to retinal ganglion cells. Inducing glaucoma in animal models can provide insight into the study of this disease. Here, we outline a procedure that induces loss of RGCs in an in vivo rat model and demonstrates the preparation of whole-mount retinas for analysis.

Résumé

Le glaucome est une maladie du système nerveux central affectant les cellules ganglionnaires de la rétine (CGR). axones RGC constituant le nerf optique portent entrée visuelle au cerveau pour la perception visuelle. Dommages à RGC et leurs axones conduit à la perte et / ou la cécité vision. Bien que la cause spécifique du glaucome est inconnue, le principal facteur de risque de la maladie est une pression intraoculaire élevée. procédures de Glaucome induisant dans des modèles animaux sont un outil précieux pour les chercheurs qui étudient le mécanisme de RGC mort. De telles informations peuvent conduire au développement de traitements neuroprotecteurs efficaces qui pourraient aider à la prévention de la perte de vision. Le protocole dans le présent document décrit un procédé d'induction du glaucome - comme conditions dans un modèle de rat in vivo où 50 ul de 2 M solution saline hypertonique est injecté dans le plexus veineux épiscléral. Blanchir des navires indique injection réussie. Cette procédure entraîne une perte de RGC pour simuler le glaucome. Un mois aprèsinjection, les animaux sont sacrifiés et les yeux sont enlevés. Ensuite, la cornée, le cristallin et vitreux sont enlevés pour faire un œilleton. La rétine est ensuite détachée de l'arrière de l'œil et le tombé sur des boîtes Sylgard en utilisant des aiguilles de cactus. A ce stade, les neurones de la rétine peuvent être colorées pour l'analyse. Les résultats de ce laboratoire montrent que 25% environ de RGC sont perdus dans le mois de la procédure par rapport aux contrôles internes. Cette procédure permet une analyse quantitative de la rétine la mort des cellules ganglionnaires dans un modèle in vivo d' un glaucome chez le rat.

Introduction

Le glaucome est un groupe de maladies oculaires affectant les neurones de la rétine, en particulier, les cellules ganglionnaires de la rétine ^1-2. Les axones de ces cellules convergent pour devenir le nerf optique portant des informations visuelles au cerveau où la vision est perçue. Dommages à RGC et leurs axones provoque donc des défauts visuels.

Les principales caractéristiques associées à des troubles du glaucome sont RGC la dégénérescence et la mort, augmentation de la pression intraoculaire (PIO) et optique de coupe de disque et une atrophie. Ces caractéristiques conduisent à la perte du champ visuel ou complète, une cécité irréversible. À l' heure actuelle, le glaucome a causé la cécité dans 70 millions de personnes à travers le monde ^3. En tant que tel, il est le troisième cause mondiale de cécité ^4.

Le mécanisme exact de RGC la mort dans le glaucome demeure inconnue. Beaucoup de recherches ont été faites pour résoudre le mystère. Il est connu, cependant, que le principal facteur de risque de glaucome est une augmentation in pression intraoculaire due à la circulation irrégulière de l'humeur aqueuse (AH) dans la chambre antérieure de l'oeil. AH agit comme un substitut transparent et incolore pour le sang dans la chambre antérieure de l'oeil avasculaire. Il nourrit les cellules environnantes, élimine les déchets sécrétés des processus métaboliques, transporte les neurotransmetteurs, et permet la circulation des médicaments et des cellules inflammatoires dans l'oeil pendant les états pathologiques ^1.

Le maintien de la circulation aqueuse de l'humour implique le corps ciliaire et le trabéculum. L'humeur aqueuse est produite par le corps ciliaire. Il circule alors dans la chambre antérieure pour maintenir la santé globale du tissu oculaire. 75-80% d'humeur aqueuse est activement sécrétés par la non-pigmentaire épithélium ciliaire lorsque le fluide est filtré à travers trois couches de tissu spongieux dans le muscle ciliaire. Les sorties de fluide à travers le trabéculum et à travers le canal de Schlemm qui empts dans le système sanguin ⁵ .La restante de 20 - 25% du débit contourne le trabéculum et passivement sécrétées par ultrafiltration et la diffusion à travers la voie de uveo-sclérale. Cette voie semble être relativement indépendante de la pression intraoculaire ^1.

Lorsque la production d'humeur aqueuse et de sortie sont hors d'équilibre, la pression augmente dans l'œil. Comme indiqué, cette augmentation de la pression intra-oculaire est le principal facteur de risque pour le développement du glaucome. Une telle pression provoque des dommages aux couches complexes de neurones de la rétine à l'arrière de l'œil. Les dommages aux axones des cellules ganglionnaires de la rétine du nerf optique provoque le cerveau pour ne plus recevoir de l'information visuelle précise. En conséquence, la perception de la vision est perdue et la cécité complète peut se produire.

À ce jour, il n'y a pas de remède pour le glaucome. Différentes méthodes de traitement existent qui visent principalement à réduire la pression intraoculaire. Ceux-ci comprennent topiqueclasses de médicaments tels que les bloqueurs des récepteurs beta1-adrénergiques, ou analogues de prostaglandines topiques. Les bêta - bloquants réduisent la pression intra - oculaire en diminuant la production d'humeur aqueuse ^7. Les prostaglandines fonctionnent pour diminuer la PIO en augmentant l'écoulement de l' humeur aqueuse ^8-14. Alpha-adrénergiques et des inhibiteurs de l'anhydrase carbonique sont également utilisées comme méthodes de traitement secondaire. Alpha agonistes adrénergiques augmentent sortie par la voie uvéoscléral ^15-17. Les inhibiteurs de l' anhydrase carbonique réduisent la production de AH par inhibition enzymatique ^18. Une grande partie des procédures plus invasives sont également utilisés pour traiter le glaucome. Trabéculoplastie au laser est utilisé pour augmenter l'écoulement de l' humeur aqueuse ^19. Une autre thérapie chirurgicale, appelée trabéculectomie, crée un autre site de drainage pour filtrer AH lorsque la voie trabéculaire traditionnelle est bloqué ^20-21.

Ces options de traitement ont été connus pour effcacement réduire la PIO. Toutefois, jusqu'à 40% des patients atteints de glaucome montrent des niveaux de PIO normales indiquant un besoin de méthodes thérapeutiques plus complètes. ^22,23 De plus, la rétine la mort des cellules ganglionnaires vu dans le glaucome est irréversible une fois qu'il commence et les traitements actuels ne pas arrêter la progression de la maladie ^24-28. Cela a mis en évidence la nécessité pour les thérapies neuroprotectrices efficaces qui ciblent la survie des neurones eux-mêmes. Développement de modèles de glaucome est crucial pour ce développement.

Dans cette étude , nous démontrons une méthode d'induction des effets du glaucome comme chez les rats adultes Long Evans en utilisant une procédure modifiée initialement décrite par Morrison ^29. Dans cette procédure, les injections de 2 M solution saline hypertonique dans le plexus veineux épiscléral induit des conditions de glaucome comme par le tissu des cicatrices pour réduire humeur aqueuse dans le trabéculum conduisant à une augmentation de la pression intra-oculaire et une perte importante de RGC wSEIN d' un mois de la procédure ^30-31. procédures de Glaucome induisant, telles que celle décrite ici, peut être la clé pour débloquer de nouveaux développements dans les traitements du glaucome.

Protocole

Toutes les procédures en utilisant des sujets animaux ont été en conformité avec les normes de l'Institut de protection des animaux et l'utilisation Commission (IACUC) à l'Université Western Michigan.

1. Les animaux

1. Utilisez rats mâles et femelles de 3 mois dans cette étude.
2. Garder les animaux dans un cycle de 12 heures de lumière / obscurité avec un accès libre à la nourriture et de l'eau.

2. Préparation de KAX Cocktail pour anesthésie animale

1. Dissoudre 50 mg de xylazine (20 mg / ml) dans 5 ml de kétamine (100 mg / ml) avec 1 ml d'acépromazine (10 mg / ml) et 3 ml d'eau distillée. Bien mélanger.
2. Stériliser avec un filtre à seringue et stocker cette solution dans un flacon à sérum de 10 ml.

3. KAX Injection

1. Peser animale (g) et le retour à la cage avant d'être prêt pour l'injection.
2. Injecter 0,1 ml KAX / 100 g de poids corporel des animaux par voie intrapéritonéale, en utilisant une seringue de 1 ml d'insuline avec une aiguille 28 G.
3. Permettrepour animaux à devenir inconscient. Vérifiez les réflexes en pinçant les pieds et la queue.
4. Gardez tous les animaux en toute sécurité dans le laboratoire pour la durée de la chirurgie.
5. Post-chirurgie, remplacer les animaux dans leurs cages et de garder à l'aise dans RT jusqu'à ce que la conscience est rétablie. retour Seuls les animaux de l'animalerie lorsque les animaux se réveillent et reprendre un comportement normal.

4. Préparation pour la chirurgie et de l'Assemblée Microneedle

1. Faire une solution stérile 2 M de NaCl.
2. Utilisez un extracteur de microélectrodes (figure 1C) de tirer un 0,86 mm de diamètre intérieur norme poli lourd et mince tube de borosilicate paroi en deux microaiguilles de verre finement effilées (figure 1D, figure 1E).
3. Remblayer une micro - aiguille à l'étape précédente avec 2 M de solution saline à l' aide d' une aiguille de seringue et le remblayage d' une seringue de 1 ml (figure 1B). Touchez les bulles d'air de la pointe de l'électrode.
4. Remplir une deuxième seringue de 1 ml avec 2 MNaCl. Branchez une aiguille de 18 G, puis fixer une longueur (environ 10 pouces) de tubes en polyéthylène (figure 1A). Utiliser le piston de seringue pour remplir le tube de polyethylene avec une solution saline à travers l'aiguille.
5. Lorsque les deux microaiguille et tubes sont remplis avec une solution saline, connectez soigneusement les deux. Éliminer l'air dans la connexion entre eux (Figure 2).
6. Finement biseauter la pointe de la microaiguille en raclant très légèrement contre le grain d'une serviette en papier de cours.
7. Vérifier la résistance de la microaiguille en poussant doucement le piston de la seringue jusqu'à ce qu'une fine jet de liquide peut être vu sur la serviette en papier. Le courant de liquide ne devrait pas être plus large que 0,5 mm.

5. Préparation des animaux

1. Appliquer 1 - 2 gouttes anesthésique topique à la cornée (Proparacaine Hydrochloride Solution ophtalmique, USP, 0,5%). Attendre jusqu'à ce qu'aucun réflexe oculaire se produit.
2. Coupez les moustaches avec des ciseaux.
3. Saturate un applicateur de pointe de coton avec une solution de bétadine et de la zone tampon autour de l'œil expérimental.
4. En utilisant un microscope, joindre un hémostatique pour serrer la paupière inférieure à gonfler l'œil, exposer la veine épiscléral et de limiter le mouvement des yeux. (Figure 3, flèche)

6. Glaucome induisant une injection de solution saline

1. Lorsque l'ensemble de micro-aiguilles et l'animal sont préparés, commencer injections.
2. Lorsque l'animal est confirmé pour être insensible aux pieds / pincement de la queue, percer soigneusement la veine épiscléral avec la microaiguille en venant à un angle faible entre 10 et 20 degrés par rapport à la veine (figure 3, flèche blanche). Une ponction réussie dans la veine est apparente lorsque le sang pénètre dans la pointe de la micro - aiguille (figure 3, flèche noire).
3. Lentement et manuellement injecter environ 50 pi de solution saline dans la veine. Cela devrait prendre environ 10 secondes. Les veines sera blanc blanch que le sel circule through la vascularisation (figure 4, flèche). Certaines régions peuvent maintenir une apparence de sang rouge (figure 4, flèche).
   1. Réaliser une deuxième injection dans la veine, en face du site de la première, afin d'assurer une lésion rétinienne complète à la couche complète des cellules ganglionnaires de la rétine.
      Note: En quelques minutes, on devrait voir un aspect trouble distinct à travers l'iris de l'œil que le sel circule à travers le système vasculaire.
4. Laissez l'œil opposé non traité pour être utilisé comme un contrôle interne.

7. Récupération animale

1. Retirez le hémostatique.
2. Utiliser un applicateur en coton pour appliquer une pommade antibiotique triple (bacitracine zinc, le sulfate de néomycine, le sulfate polymysin B) sur le site serré par la pince hémostatique et de sites d'injection. Les dommages aux tissus autour de l'œil ne se produit pas à l'aide du hémostatique.
3. > La place anesthésié les animaux dans leurs cages sur une couverture d'eau chaude circulant à prevhypothermie ent. Garder les animaux sous observation jusqu'à ce que la conscience et le comportement normal sont repris. Transports animaux éveillés à la colonie des animaux. Les animaux restent dans la colonie jusqu'au moment du sacrifice.

8. Sacrifice animal et Retina Removal

1. Un mois après la procédure pour induire le glaucome, les animaux sont euthanasiés par asphyxie au _CO2 et à la perforation thoracique secondaire.
   1. Placez l'animal dans la chambre et mettre le couvercle en toute sécurité.
   2. Ouvrir les vannes de CO ₂ et régulateur de gaz pour permettre le volume de 20% / min CO ₂ déplacement oxygène dans la chambre.
   3. Prévoyez quatre à 5 min pour l'animal expirer.
   4. Éteignez les deux valves.
   5. Enlever l'animal de la chambre et effectuer une ponction thoracique secondaire avec un scalpel stérile.
2. Après l'euthanasie, utiliser un scalpel pour couper le tissu conjonctif dans la cavité orbitale entourant l'oeil, being attention à ne pas couper dans le globe oculaire lui-même.
3. Soigneusement utiliser des ciseaux de bord incurvées pour couper le nerf optique et tout tissu restant à extraire le globe oculaire intact. Placez globe oculaire extrait dans une boîte de 60 mm stérile x 15 mm jetable de Pétri contenant du PBS frais.
4. Faire une œilleton du globe oculaire. Pour ce faire, faire une petite incision au scalpel juste en arrière de la frontière entre l'iris et la sclérotique. Suivez cette incision autour de la circonférence de l'œil avec de petits ciseaux de printemps pour enlever l'hémisphère cornée du globe oculaire. L'hémisphère relié au nerf optique reste.
5. Trouvez la très mince rétine rose / beige à l'intérieur du œilleton de l'animal euthanasié. Maintenez la couche pigmentée de la rétine avec des pinces émoussées pour stabiliser l'œilleton. Utilisez une autre paire de pinces fermées pour taquiner très doucement la rétine entière intacte au large de l'arrière de l'œil. Évitez de pincer, tirer, ou tirant la rétine directement.
6. Utilisez de petits ciseaux à ressort pour couper lezone où le nerf optique est encore attachée à la rétine.
7. Assurez-vous de couper tout épithélium pigmentaire résiduel ou le tissu scléral de la rétine.
8. En utilisant une pipette de transfert, transférer très doucement la rétine isolée à un Sylgard propre enduit 35 mm boîte de Pétri x 10 mm contenant du PBS frais.

9. Retina Whole-Mount Préparation

1. Une fois dans le plat Sylgard, utilisez une pince et une aiguille de cactus à la broche de la rétine en place. Gardez la couche de cellules ganglionnaires de la rétine vers le haut et vers le bas du nerf optique. forme hémisphérique de la rétine est notable même après fixation. La courbure de la rétine se courber vers le plafond lorsque la couche de cellules ganglionnaires de la rétine est dans l'orientation souhaitée.
2. Utilisez de petits ciseaux pour couper la rétine en quatre quadrants, ce qui rend la forme d'un trèfle à quatre feuilles rayonnant à partir de la tête du nerf optique.
3. Epingler les quadrants de la rétine avec des aiguilles de cactus supplémentaires pour rendre la rétine aussi plat que possible without étirement (figure 5).
4. Fixer les rétines épinglées dans le plat de Sylgard avec 3 ml de paraformaldéhyde 4% O / N à la température ambiante.

10. coloration des anticorps de la rétine

Remarque: Tache rétines fixes avec des anticorps primaires et secondaires pour visualiser les neurones de la rétine (figure 6).

1. Rincer, rétines plates montées fixes trois fois pendant 2 minutes chacun dans du PBS.
2. Perméabiliser les rétines avec 1% de Triton X-100 avec 1% de sérum de fœtus bovin dans du PBS pendant 60 min.
3. Rincer rétines trois fois, 2 min chacun, dans du PBS.
4. Rincer deux fois avec 0,1% de Triton X-100 dans du PBS, 5 min par lavage.
5. Rincer deux fois avec PBS, 5 min par lavage.
6. Incuber avec 1% de Triton X-100 et 1% de sérum de fœtus bovin dans du PBS à température ambiante pendant 45 min.
7. Rincer deux fois avec 0,1% de Triton X-100 dans du PBS, 5 min par lavage.
8. Rincer deux fois avec PBS, 5 min par lavage.
9. Incuber chaque rétine dans 3 ml de 1% de sérum de fœtus bovin dans du PBSavec la souris purifié anti-rat CD90 / souris CD90.1 (dilution 1: 300) O / N à la température ambiante.
10. Rincer rétines une fois avec 0,1% de Triton X-100 dans du PBS pendant 5 min.
11. Rincer deux fois avec PBS, 5 min par lavage.
12. Incuber chaque rétine dans 3 ml de PBS (pas de FBS) avec Alexa Fluor 594 de chèvre anti-IgG de souris secondaire (1: 300) O / N à la température ambiante.
13. Laver rétines avec du PBS généreusement.
14. En utilisant un microscope à dissection, enlever soigneusement les aiguilles de cactus de la rétine.
15. transférer doucement rétines sur des lames de microscope avec une pipette de transfert. Assurez-vous de maintenir l'orientation avec la couche rétinienne des cellules ganglionnaires face au plafond. forme hémisphérique de la rétine est notable même après fixation. La courbure de la rétine se courber vers le plafond lorsque la couche de cellules ganglionnaires de la rétine est dans l'orientation souhaitée.
16. Absorber tout excès de PBS avec Kimwipe ou tout autre matériau absorbant. Veillez à ne pas absorber la rétine.
17. Ajouter 5 gouttes de ½ glycérol et ½ PBS en poids modmédias ontage.
18. Couvrir la rétine avec la lamelle, en évitant les bulles d'air.
19. lamelle sécurisée à l'aide de vernis à ongles clair, colle ou autre adhésif.

Résultats

Cette section illustre les composants de l' appareil et la procédure utilisée pour induire des conditions de glaucome comme dans un modèle in vivo de glaucome chez le rat. Nous montrons les différents outils et l'équipement utilisés pour effectuer une injection de solution saline hypertonique qui provoque une augmentation de la pression intraoculaire. Nous montrons l'injection dans le plexus veineux épiscléral avec son effet de blanchiment caractéristique et...

Discussion

Ce protocole décrit un procédé pour induire des conditions de glaucome analogue dans un modèle in vivo chez le rat. Cette procédure utilise une injection de solution saline hypertonique pour induire une cicatrisation dans le trabéculum ^{29, 32.} Le développement du tissu cicatriciel obture l'écoulement de l' humeur aqueuse qui augmente la pression dans la chambre antérieure. Avec une diminution des sorties et l'accumulation de pression, la lentille suspendue par des ligaments élas...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Xylazine hydrochloride, Minimum 99%	Sigma, Life Science	X1251-1G
Ketamine hydrochloride injection, USP, 100mg/mL	Putney, Inc	NDC 26637-411-01	10 mL bottle
Acepromazine Maleate, 10mg/mL	Phoenix Pharmaceutical, Inc	NDC 57319-447-04, 670008L-03-0408	50 mL bottle
Serum bottle, 10 mL	VWR	16171319	Borosilicate glass
1 mL insulin syringe	VWR	BD329410	28 gauge needle
Sodium chloride	Sigma	S7653	2 M Solution
Microelectrode Puller	Narishige Group	PP-830
Heavy Polished Standard and Thin Walled Borosilicate Tubing	Sutter Instruments	B150-86-10HP	without filament, 0.86 mm
Microfil syringe needle for filling micropipettes	World Precision Instruments, Inc	MF28G
18 gauge Luer-Lock needle	Fisher Scientific	1130421	Syringe needle
Flexible Polyethylene Tubing	Fisher Scientific	22046941	0.034 inch diameter, approximately 10 inches
Proparacaine Hydrochloride Opthalmic Solution, USP, 0.5%	Akorn, Inc	NDC 17478-263-12	15 mL  sterile bottle
Curved Scissors	Fine Science Tools	14061-11
Microscope	Leica	StereoZoom 4
Hemostat Clamp	Fine Science Tools	1310912	curved edge
Triple Antibiotic Ointment	Fisher Scientific	NC0664481
Scalpel handle	Fine Science Tools	10004-13
Scalpel blade # 11	Fine Science Tools	10011-00
60 mm x 15 mm Disposable Petri Dish	VWR	351007
Phosphate Buffered Saline 10x Concentrate	Sigma, Life Science	P7059-1L	1x dilution
Spring Scissors	Fine Science Tools	15009-08
Forceps (2), Dumont # 5	Fine Science Tools	11251-30
3 mL Transfer Pipets, polyethylene, non sterile	BD Biosciences	357524 or 52947-948	1 and 2 mL graduations
35 mm x 10 mm Easy Grip Petri Dish	BD Biosciences	351008
Sylgard 184	VWR	102092-312
Cactus Needles	N/A	N/A
Paraformaldehyde	EMD Millipore	PX0055-3 or 818715.0100	Made into a 4% solution
Triton X-100	Sigma	T9284-100 mL	Made into both a 1% and 0.1% solution
Fetal Bovine Serum	Atlanta Biological	S11150	500 ml
Purified Mouse Anti-Rat CD90/mouse CD90.1	BD Pharmingen	Cat 554892	1:300 dilution
Alexa Fluor 594 goat anti-mouse	Life Technologies	A11005	1:300 dilution
Microscope Slides	Corning	2948-75x25
Glycerol	Sigma	G5516-100 mL	50% glycerol to 50% PBS, by weight
Coverglass	Corning	2975-225	Thickness 1 22 x 50 mm
Confocal Microscope	Nikon	C2 Eclipse Ti