La mucina en gel de agarosa de electroforesis: Western Blotting para glicoproteínas de alta peso molecular

Resumen

Mucins are high-molecular-weight glycoconjugates, with size ranging from 0.2 to 200 megadalton (MDa). As a result of their size, mucins do not penetrate conventional polyacrylamide gels and require larger pores for separation. We provide a detailed protocol for mucin agarose gel electrophoresis to assess relative quantification and study polymer assembly.

Resumen

Las mucinas, las proteínas fuertemente glicosiladas que recubren las superficies mucosas, se han desarrollado como un componente clave en la defensa innata mediante la protección del epitelio contra los patógenos invasores. La función principal de estas macromoléculas es el de facilitar la captura de partículas y la limpieza, mientras que la promoción de la lubricación de la mucosa. Durante la síntesis de proteínas, las mucinas se someten intensa O-glicosilación y la multimerización, que aumentan dramáticamente la masa y el tamaño de estas moléculas. Estas modificaciones post-traduccionales son esenciales para las propiedades viscoelásticas de moco. Como resultado de la naturaleza compleja bioquímicas y biofísicas de estas moléculas, trabajando con mucinas ofrece muchos retos que no se pueden superar por métodos de análisis de proteínas convencionales. Por ejemplo, su alto peso molecular impide la migración electroforética a través de geles de poliacrilamida regulares y su naturaleza pegajosa provoca la adhesión a un tubo experimental. Sin embargo, la investigación del papel de las mucinas en la salud(Por ejemplo., El mantenimiento de la integridad de la mucosa) y la enfermedad (por ejemplo., Hiperconcentración, mucoestasis, cáncer) ha ganado recientemente el interés y las mucinas se están investigando como una diana terapéutica. Una mejor comprensión de la producción y función de macromoléculas de mucina puede conducir a enfoques farmacéuticos nuevos, por ejemplo, inhibidores de mucina exocitosis de gránulos y / o agentes mucolíticos. Por lo tanto, los protocolos coherentes y fiables para investigar la biología de mucina son fundamentales para el progreso científico. Aquí, se describen los métodos convencionales para separar macromoléculas de mucina por electroforesis utilizando un gel de agarosa, la transferencia de la proteína en la membrana de nitrocelulosa, y detectar la señal con anticuerpos de mucina específica, así como lector de gel fluorescente en el infrarrojo. Estas técnicas son ampliamente aplicables para determinar mucina cuantificación, la multimerización y para poner a prueba los efectos de compuestos farmacológicos sobre mucinas.

Introducción

Las mucinas se producen normalmente por las superficies de la mucosa que recubren las cavidades expuestas al ambiente externo (por ejemplo., Respiratorio, tracto digestivo, reproductivos, superficie ocular), así como los órganos internos (por ejemplo, páncreas, vesícula biliar, glándulas mamarias). La presencia de estas glicoproteínas mantiene la hidratación de la superficie y forma una barrera física contra los patógenos. Aunque la producción de mucina es esencial para la mucosa de la salud, hiperconcentración de mucina y / o propiedades del moco aberrantes puede conducir a la obstrucción de los conductos, la colonización bacteriana y la inflamación crónica, que puede causar daño irreversible del tejido. Una cascada de acontecimientos similares se observan en varias enfermedades, por ejemplo., Fibrosis quística ^{1, 2} otitis media crónica y la infección cervicovaginal ^3. Por lo tanto, es importante entender el papel de las mucinas en la salud y la enfermedad y establecer protocolos de rutina para la identificación de proteínas.

Hasta la fecha, Se han identificado 19 genes mucinas y codifican cadenas de polipéptidos grandes que van desde 1200 (por ejemplo., MUC1) a 22.000 (por ejemplo, MUC16) aminoácidos. La familia de genes de mucina se puede dividir en dos subtipos: las mucinas asociadas a la membrana, que participan en la señalización celular y la superficie de blindaje, y las mucinas formadoras de gel, responsable de las propiedades viscoelásticas de los geles de moco. mucinas asociadas a la membrana son en su mayoría monomérica y se adhieren a las superficies de las células a través de un dominio que atraviesa la membrana hidrófoba. Por el contrario, las mucinas formadoras de gel poseen varios -como y dominios ricos en cisteína factor de von Willebrand (vWF) que son esenciales para la formación de redes poliméricas dinámicos. Grandes glicanos están unidos a residuos de serina y treonina distribuidos por todo el apomucina. Estos oligosacáridos O-ligados densos pueden contribuir hasta 80% del peso molecular ^4. enlaces disulfuro intra- e inter-moleculares que conectan monómeros de mucina asegurar la integridad de la Networ gel de mucinak. Como resultado de la glicosilación pesada y multimerización, mucinas están entre las moléculas más grandes en el mundo animal y no pueden ser analizados por electroforesis en gel estándar utilizando gel de poliacrilamida SDS-PAGE convencional y escaleras de proteínas estándar. Estos métodos se resuelven / proteínas separadas con pesos moleculares inferiores a 250 kDa, mientras que los monómeros de mucina pueden alcanzar hasta 2 MDa en el caso de MUC16. Sin embargo, las escaleras de proteínas de alto peso molecular se pueden utilizar para estudiar pequeñas monómeros de mucina (es decir., MUC1).

Una variedad de técnicas se pueden aplicar para estudiar el tamaño de mucina, la conformación y la interacción. Tradicionalmente, la caracterización bioquímica de las mucinas se logra mediante la mucina aislamiento mediante centrifugación isopícnica en gradiente de densidad en un tampón de desnaturalización, seguido de cromatografía de exclusión por tamaño y la inmunodetección (por ejemplo., Transferencia slot) ^5. y / o dispersión de luz multiángulo dinámico proporciona información sobre el estado oligomérico de muestras de mucina ricos ^{1. Además, la centrifugación de la velocidad zonal junto con la inmunodetección y microscopía electrónica de transmisión se utiliza comúnmente para determinar la conformación macromolecular de mucinas 6. La espectrometría de masas también se utiliza para cuantificar las mucinas, detectar la escisión proteolítica y analizar oligosacárido composición 1,7,8. Tales técnicas son costosas, consume tiempo y a menudo requieren grandes volúmenes y / o altas concentraciones de muestra. La metodología descrita en el presente documento, es decir., Mucina separación por electroforesis, es reproducible, de bajo coste y se puede utilizar en estudios de alto rendimiento para proporcionar la cuantificación relativa y mucina investigar montaje polímero. Sin embargo, este ensayo requiere de alta afinidad y de alta especificidad de mucina anticuerpos que pueden no estar disponibles para mucinas raras (por ejemplo., MUC19) o ciertas especies (por ejemplo., Cerdo, hurón).}

Western Blot La agarosa es adecuado para resolver una amplia variedad de muestras de mucina ricos con concentraciónlas que van desde 50 mg / ml (por ejemplo., lavados de células) a 5 mg / ml (por ejemplo., esputo). Este ensayo fue introducido en la década de 1990 y sólo se realizó en pocos laboratorios especializados ^9,10. Inicialmente, esta técnica ayudó a identificar subpoblaciones de monómeros de mucina en las secreciones respiratorias humanas ^11,12 y confirmó el proceso de oligomerización en las células caliciformes, que consiste en la formación de dímeros en el retículo endoplasmático, seguido de multimerización dímero en el aparato de Golgi ^13. Más recientemente, la generación de anticuerpos policlonales contra mucinas murinos facilitó los estudios en modelos animales pequeños (por ejemplo., Mucina, modelos de ratones desafiados con OVA βENaC, deficientes) y abrió un nuevo campo de investigación para los estudios preclínicos probar compuestos farmacológicos destinados a eliminar la mucosidad de los pulmones ^14-17. Como resultado de un creciente interés en la biología de mucina y la generación de nuevo, los anticuerpos de mucina más específicos, que describen traducción de estasn la metodología para separar las mucinas por electroforesis en gel de agarosa, transferencia de vacío a nitrocelulosa y la detección fluorescente en el infrarrojo de dos colores.

Protocolo

1. Preparar Los tampones de mucina Gel Western Blotting

1. Preparar 1 litro de 50x tampón TAE (Tris-acetato-EDTA).
   1. En 700 ml de agua destilada (dH ₂ O) añadir 242 g de base Tris (0,4 M), 57,1 g de ácido acético glacial (peso de líquido) (0,2 M) y 14,61 g de ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) (50 mM).
   2. Ajustar el pH a 8,0 y completar el volumen hasta 1 litro con dH ₂ O.
2. Preparar 10 ml de tampón de carga 10x.
   1. Preparar 5 ml de tampón 1x TAE. Para ello, añadir 5 ml de glicerol (50%), 25 mg de azul de bromofenol (0,25%), y 100 mg de dodecilsulfato de sodio (SDS) (1%).
3. Preparar 2 litros de tampón 20x de sodio citrato de solución salina (SSC).
   1. En 1,5 litros de _H2O destilada, agregar 350,6 g de NaCl (3 M) y 176,4 g de citrato trisódico (Na ₃ C ₆ H ₅ O ₇₎ (0,3 M). Ajustar el pH a 7,0 y se alcance un volumen de 2 litros con _dH2O
4. Preparar 1 litro de tampón 1x TAE-0,1% de SDS.
   1. Añadir 20 ml de 50x TAE a 980 ml ​​de _dH2O Añadir 1 g de SDS para hacer una solución 0,1% de SDS-TAE.

2. TAE-SDS en gel de agarosa Preparación

1. (. Es decir, 150 ml) Verter volumen suficiente de 1x TAE-0,1 tampón SDS% en un matraz Erlenmeyer de microondas para hacer un 5 - gel 7 mm de espesor. Añadir 0,8% (1,2 g) de polvo de agarosa.
2. matraz de microondas en intervalos de 30 seg con agitación intermitente hasta que se disuelve por completo de agarosa (generalmente 1 - 3 minutos). Use toallas de mano caliente durante este proceso. Tenga cuidado de la ebullición mientras se agita.
3. Deje que la solución de agarosa se enfríe durante 5 - 10 minutos a. Nota: La solución de agarosa estará listo para ser vertido al fondo del frasco se puede dejar en la palma de la mano durante 5 segundos.
4. Preparar bandeja de fundición de electroforesis (10 x 15 cm) mediante el sellado de los bordes con cinta adhesiva y colocando así peine en posición.
5. Verter lentamente solución de agarosa en tque la fundición de la bandeja para evitar la formación de burbujas. Eliminar las burbujas utilizando una punta de pipeta. Espere a que el gel se enfríe y solidifique por completo. Una vez solidificado, retire el peine lentamente para evitar el colapso de los pocillos mediante aspiración y retire la cinta de los bordes de la bandeja.
6. Colocar en gel de agarosa en el cuadro de gel y llenar la unidad de electroforesis con tampón TAE 1x SDS-0,1% hasta que el gel esté completamente cubierto.

3. carga de la muestra y separación de electroforesis

Nota: En nuestro laboratorio, que comúnmente utilizamos muestras tanto del ratón y el ser humano, incluyendo el lavado broncoalveolar (BALF; ambas especies), lavados celulares a partir de células epiteliales bronquiales humanas (HBE), y muestras de saliva y esputo humanos. Las muestras pueden ser desnaturalizadas en 6 M urea a la recogida o almacenados por períodos cortos de tiempo (6 horas) mediante la adición de cóctel inhibidor de proteinasa.

1. Preparar muestras para la carga mediante la adición de 10% de colorante de carga a cada muestra (es decir., 30 l de muestra y 3l de tinte). Homogeneizar las muestras de la pipeta hacia arriba y hacia abajo. Brevemente centrifugar los tubos a 5.000 rpm para recoger las gotas.
2. Con cuidado, cargar un volumen igual de muestras en los pocillos.
   1. consejos pre-húmedas y / o utilizar pipetas de desplazamiento positivo para facilitar la carga de muestras altamente viscosas. Lentamente aspirado de 80 - 90% de solución de muestra de colorante (es decir, 27 a 30 l) para evitar burbujas de pipeteo.
   2. Lentamente carga en el fondo de los pocillos y se mueven progresivamente la punta de la pipeta hacia arriba. Para las muestras que permanecen unidas a la punta de la pipeta, dispensar en un ángulo de 45 ° y alargar recta por encima del bien o suavemente usar el lado del pozo para romper el mucosidad viscosa. No sobrecargue los pozos.
3. Conectar los electrodos de la caja del gel de electroforesis el generador de energía. Asegúrese de que los electrodos están conectados correctamente (es decir., Cable rojo conectado a la salida positiva del generador) para permitir cargados negativamente mucinas para correr hacia lo positivo electrodo.
4. Correr el gel a 80 voltios durante 90 min para un solo gel peine, o 60 a 75 min para un gel doble peine para evitar el solapamiento entre las dos filas.
5. APAGUE el generador de energía y desconectar los electrodos de la fuente de alimentación.
6. Retire cuidadosamente el gel de la caja de gel con una mano en cada lado de la bandeja de moldeo para asegurar que el gel permanece en su lugar.

4. Reducir en gel de agarosa para una transferencia eficaz de mucina

1. Con cuidado, coloque la parte plana de gel en un recipiente de vidrio. Enjuague el gel con _H2O destilada para eliminar los restos de tampón TAE-SDS.
2. Preparar 1 litro de tampón SSC 4x añadiendo 200 ml de 20x SSC en 800 ml de dH ₂ O. Hacer 200 ml de ditiotreitol 10 mM (DTT) solución 4x SSC mediante la adición de 309 mg de la TDT fresco en 200 ml de tampón de 4x SSC.
3. Remojar el gel con tampón de TDT-4x SSC y la cubierta. Agite suavemente durante 20 min (10 rotaciones por minuto). Enjuague gel con TDT libre tampón SSC 4x.

"> 5. Vacío conjunto secante y la transferencia de la muestra a una membrana de nitrocelulosa

1. Preparar secante de vacío para la transferencia.
   1. Corte con cuidado la membrana de nitrocelulosa en dimensiones ligeramente más ancho que el gel (es decir., 10 x 15 cm).
   2. Estera porosa húmeda con _dH2O y colocarlo suave del lado del plano en el papel secante.
   3. membrana de nitrocelulosa mojada con tampón SSC 4x TDT libre y colocarlo en el centro de la malla porosa.
   4. Cubrir la estera porosa con la junta de goma, dejando la abertura de la junta precisamente alineada con la membrana de nitrocelulosa. Si la placa porosa es aún visible, ajuste cuidadosamente la membrana para asegurar queda ningún hueco entre la junta y la membrana.
2. colocar cuidadosamente el gel de agarosa en la parte superior de la membrana. Asegúrese de gel se forma un sello hermético con la junta y los pocillos del gel se colocan sobre la membrana para la transferencia.
   1. Evitar la formación de burbujas entre la membrana y el gel. Para minimizar elformación de burbujas, chorros unas gotas de 4x SSC tampón sobre la membrana y el gel se deslizan de arriba a abajo para eliminar cualquier burbuja formadas. Evite mover el gel sobre la membrana como proteínas comenzarán a borrar inmediatamente.
3. Con cuidado, cubrir el gel con tampón SSC 4x.
4. Iniciar la transferencia de mucina por succión.
   1. Girar secante de vacío y presión EN fijado en 40 - 50 mbar. Añadir unas gotas de tampón SSC 4x en el gel cada 5 - 10 minutos a para evitar que el gel se seque. transferencia de una duración de 90 min. Opcional: Al finalizar, marcar los pozos con un lápiz para la orientación.
5. Deseche el gel y recuperar la membrana de nitrocelulosa utilizando pinzas de plástico en el borde de la membrana.

6. El bloqueo de la membrana y de detección

1. Enjuague la membrana inmediatamente con solución salina tamponada con fosfato 1x (PBS). No deje que la membrana se seque.
2. Sumergir la membrana en 50 ml de 3% de leche-PBS solución amortiguadora de bloqueo y colocar en una rocker a temperatura ambiente durante 1 hr. Después de la incubación, desechar el tampón de bloqueo.
3. Sumergir la membrana en solución de anticuerpo primario leche-PBS 1%. Incubar la membrana en la solución de anticuerpo primario durante la noche en un agitador a 4 ° C. Después de la incubación, desechar la solución de anticuerpo primario. Diluir los anticuerpos primarios a una proporción de 1: 2000 de solución de anticuerpo a tampón de bloqueo. Nota: Para las muestras procedentes de ratones, usamos UNC 222 de conejo anti-MUC5B y de cabra anti-proteína fluorescente verde (GFP). Para las muestras procedentes de seres humanos, utilizamos anticuerpos primarios anti-H300 MUC5B y 45M1 anti-MUC5AC.
4. membrana Lavar 3 veces con PBS durante 10 min en un agitador.
5. Sumergir la membrana en solución de anticuerpo secundario leche-PBS 1%. Diluir los anticuerpos secundarios a una proporción 1: 7500 de solución de anticuerpo a tampón de bloqueo y se incuba a temperatura ambiente durante 1 hr en un agitador (por ejemplo, 700 anti-conejo y anti-cabra 680.). Proteger de la luz mediante la incubación de un compañero no transparententainer. Descartar la solución de anticuerpo secundario después de 1 hora.
6. membrana Lavar 3 veces con PBS durante 5 min. Enjuague la membrana con _H2O destilada para eliminar la sal.
7. Leer la membrana en un sistema de fluorescencia de infrarrojos de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

Resultados

Mostramos los resultados representativos de la expresión de mucina siguientes electroforesis en gel de agarosa en BALF de los pulmones de los ratones (Figura 1). En este ejemplo, se utilizó el gel de agarosa para mostrar la regulación positiva de la producción de mucina después del tratamiento de IL-13 de el modelo de ratón Tg-Muc5ac. La transferencia Western muestra una representación visual de la expresión de mucina, que puede ser utilizado para un análisis cu...

Discusión

El protocolo de transferencia de Western de mucina se describe en este vídeo combina técnicas convencionales utilizados en biología molecular para separar y transferir grandes macromoléculas, tales como ADN, con las técnicas habituales para la detección de proteínas, es decir., Inmunotransferencia. La misma técnica se podría aplicar para estudiar la biología de los glicosaminoglicanos complejos, tales como la descomposición de ácido hialurónico de alto peso molecular ^18. Aunque esta téc...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Tris Base	Sigma	T6060-1kg	1 kg
Glacial Acetic Acid	Sigma	ARK2183-1L	1 L
EDTA	Sigma	EDS-100g	100 g
Glycerol	Fisher	BP229-1	1 L
Bromophenol Blue	Sigma	114391-5g	5 g
SDS (Sodium Dodecyl Sulfate)	Sigma	L6026-50g	50 g
20x SSC (Sodium Saline Citrate) Buffer	Promega	V4261	1 L
NaCl	Fisher	S271-1	1 kg
Trisodium Citrate (Na3C6H5O7)	Sigma	W302600-1kg	1 kg
10 mM DTT (dithiothreitol)	Sigma	D0632	25 g
Milk Powder	Saco		Instant non-fat dry milk
Dulbecco Phosphate Buffered Saline (D-PBS)	Gibco lifetechnologies	14200-025	500 ml
Anti-GFP Goat Primary Antibody (mouse samples)	Rockland antibodies and assays	600-101-215	1 mg
UNC 222 Anti-Muc5b Rabbit Primary Antibody (mouse samples)	UNC
H300 Anti-MUC5B Primary Antibodies (human samples)	Santa Cruz	sc-20119	200 μg
45M1 Anti-MUC5AC Primary Antibodies (human samples)	Abcam	ab3649	100 μg
Donkey Anti-rabbit 800CW IR Dye	LI-COR Biosciences	926-32213	0.5 mg
Donkey Anti-mouse 680LT IR Dye	LI-COR Biosciences	926-68022	0.5 mg
Electrophoresis Gel Box and Casting Tray	Owl Seperation Systems
Power Supply Box	Biorad	Model 200/20
Membrane Blotting Paper	Amersham	10600016
Whatman Paper and Nitrocellulose membrane	GE	10 439 196
Boekel/Appligene Vacuum Blotter 230 v	Expotech USA	230600-2
Odyssey Infrared Fluorescence System	LI-COR Biosciences