Mucin Agarose-Gel-Elektrophorese: Western Blotting für Hochmolekulare Glykoproteine

Zusammenfassung

Mucins are high-molecular-weight glycoconjugates, with size ranging from 0.2 to 200 megadalton (MDa). As a result of their size, mucins do not penetrate conventional polyacrylamide gels and require larger pores for separation. We provide a detailed protocol for mucin agarose gel electrophoresis to assess relative quantification and study polymer assembly.

Zusammenfassung

Mucine, die stark glykosylierte Proteine ​​Schleimhautoberflächen auskleiden, sind als wichtiger Bestandteil der angeborenen Abwehr entwickelte sich durch das Epithel gegen eindringende Krankheitserreger zu schützen. Die Hauptrolle dieser Makromoleküle ist Einfangen der Teilchen und Abstand zu erleichtern, während die Schmierung der Schleimhaut zu fördern. Während der Proteinsynthese zu unterziehen Mucine intensive O-Glykosylierung und Multimerisierung, die dramatisch die Masse und Größe dieser Moleküle erhöhen. Diese post-translationalen Modifikationen sind entscheidend für die viskoelastischen Eigenschaften des Schleims. Als Folge der komplexen biochemischen und biophysikalischen Natur dieser Moleküle stellt die Arbeit mit Mucinen vielen Herausforderungen, die nicht durch herkömmliche Proteinanalyseverfahren überwunden werden können. Zum Beispiel ihre hohem Molekulargewicht verhindert elektrophoretische Wanderung durch regelmäßige Polyacrylamidgelen und ihre klebrigen Natur verursacht Adhäsion an Versuchsrohr. Doch die Untersuchung der Rolle von Mucinen in den Bereichen Gesundheit(Z. B. die Aufrechterhaltung der Schleimhaut Integrität) und Krankheiten (z. B. Hyperkonzentration, mucostasis, Krebs) hat vor kurzem gewonnen Interesse und Mucine werden als therapeutisches Ziel untersucht. Ein besseres Verständnis der Produktion und Funktion von Makromolekülen Mucin können neue pharmazeutische Ansätze, beispielsweise Inhibitoren der Muzin - Granulat Exozytose und / oder schleimlösende Mittel führen. Daher konsistente und zuverlässige Protokolle kritisch Mucin Biologie sind für wissenschaftlichen Fortschritt zu untersuchen. Hier beschreiben wir herkömmlichen Verfahren Mucin Makromolekülen durch Elektrophorese unter Verwendung eines Agarosegels getrennt, übertragen Protein in Nitrocellulosemembran und Erkennungssignal mit Mucin-spezifische Antikörper sowie Infrarot-Fluoreszenz Gel reader. Diese Techniken sind allgemein anwendbar Mucin Quantifizierung Multimerisierung zu bestimmen und die Wirkungen von pharmakologischen Verbindungen auf Mucinen zu testen.

Einleitung

Mucine werden normalerweise durch Schleimhautoberflächen erzeugt , die Hohlräume freigelegt mit der äußeren Umgebung Leitung (z. B., Atmungs-, Verdauungs-, Fortpflanzungstrakt, Augenoberfläche) sowie der inneren Organe (zB Pankreas, Gallenblase, Brustdrüsen). Das Vorhandensein dieser Glykoproteine ​​hält Oberflächenhydratation und bildet eine physikalische Barriere gegen Krankheitserreger. Obwohl Mucin Produktion ist wichtig, Gesundheit, Mucin Hyperkonzentration und / oder anomale Schleim Eigenschaften der Schleimhaut zu Obstruktion, bakterielle Besiedlung und chronische Entzündungen führen kann, die irreversible Gewebeschäden verursachen können. Eine ähnliche Kaskade von Ereignissen werden in mehreren Krankheiten beobachtet, z. B. zystische Fibrose ^1, chronische Otitis media ² und zervikovaginalen Infektion ^3. Daher ist es wichtig, die Rolle von Mucinen in Gesundheit und Krankheit zu verstehen und Routineprotokollen zur Proteinidentifizierung zu etablieren.

Miteinander ausgehenHaben, 19 Mucine Gene für große Polypeptidketten kodieren identifiziert und von 1,200 bis hin (z. B. MUC1) bis 22.000 (zB MUC16) Aminosäuren. Die Mucin-Genfamilie kann in zwei Untertypen unterteilt werden: die Membran-assoziierten Mucine, beteiligt an Zellsignalisierung und Oberflächen Abschirmung und die gelbildenden Mucine, verantwortlich für die viskoelastischen Eigenschaften von Schleim Gelen. Membran-assoziierte Mucine sind meist monomeren und heften sich an den Zelloberflächen über eine hydrophobe Transmembrandomäne. Im Gegensatz dazu gelbildenden Mucine besitzen mehrere von-Willebrand-Faktor (vWF) -ähnliche und Cystein-reichen Domänen, die für die Bildung von dynamischen polymeren Netzwerke wesentlich sind. Große Glykane sind an Serin und Threonin-Resten im gesamten apomucin verteilt. Diese dichten O-verknüpften Oligosaccharide kann bis zu 80% des Molekulargewichts ⁴ beitragen. Intra- und intermolekulare Disulfidbrücken verbindet Mucin Monomere gewährleisten die Integrität des Mucin Gel network. Als Folge der schweren Glykosylierung und Multimerisierung sind Muzine zu den größten Moleküle in der Tierwelt und nicht durch Standard-Gelelektrophorese unter Verwendung herkömmlicher SDS-PAGE Polyacrylamid-Gel und Standard-Proteinleitern analysiert werden kann. Diese Methoden lösen / getrennten Proteine ​​mit Molekulargewichten unter 250 kDa, während Mucin Monomere können bis zu 2 MDa im Fall von MUC16 erreichen. Jedoch können hochmolekulare Proteinleitern verwendet werden , um kleine Mucin Monomeren zu untersuchen (dh., MUC1).

Eine Vielzahl von Techniken kann Mucin Größe, Konformation und Interaktion zu untersuchen angewendet werden. Traditionell wird durch Mucin - Isolierung über isopycnic Dichtegradientenzentrifugation in denaturierenden Puffer, gefolgt von Größenausschlusschromatographie und Immunnachweis (z. B. Schlitz - Blotting) biochemische Charakterisierung von Mucinen erreicht ^5. Dynamische und / oder Mehrwinkellichtstreuung Informationen über den oligomeren Zustand von Mucin-reichen Proben zur Verfügung stellen ^{1. Zusätzlich geschwindigkeits Zonenzentrifugation verbunden mit Immunnachweis und Transmissionselektronenmikroskopie werden üblicherweise die makromolekulare Konformation von Mucinen 6 zu bestimmen. Die Massenspektrometrie ist auch proteolytischen Spaltung und analysieren Oligosaccharid - Zusammensetzung 1,7,8 verwendet Muzine zu quantifizieren, zu erfassen. Solche Techniken sind teuer, zeitaufwendig und oft große Mengen erfordern und / oder hohe Konzentrationen der Probe. Die Methodik hier beschrieben, dh., Mucin - Trennung durch Elektrophorese, ist reproduzierbar, kostengünstig und können in Hochdurchsatz - Studien verwendet werden , um relative Mucin Quantifizierung bereitzustellen und Polymeranordnung untersuchen. Allerdings erfordert dieser Test mit hoher Affinität und hoher Spezifität Mucin - Antikörper , die nicht für seltene mucins verfügbar sein können (z. B. MUC19) oder bestimmte Arten (z. B. Schwein, Frettchen).}

Agarose Western-Blot geeignet ist, eine Vielzahl von Mucin-reichen Proben mit Konzentrationen aufzulösengen im Bereich von 50 & mgr; g / ml (z. B. Zell Wäschen) bis 5 mg / ml (z. B. Sputum). Dieser Test wurde in den 1990er Jahren eingeführt und wurde nur in wenigen Speziallabors ^9,10 durchgeführt. Zunächst half diese Technik Atemwegssekreten ^11,12 Subpopulationen von Mucin Monomeren in menschlichen identifizieren und bestätigte das Oligomerisierungsverfahren in Becherzellen, die im endoplasmatischen Retikulum gefolgt von Dimer Multimerisierung im Golgi - Apparat ¹³ von Dimer - Bildung besteht. In jüngerer Zeit von der Erzeugung von polyklonalen Antikörpern gegen Mäuse mucins erleichtert Studien an kleinen Tiermodellen (z. B. Mucin - defizienten, βENaC, OVA-herausgefordert Mausmodelle) und eröffnet ein neues Forschungsgebiet für präklinische Studien Verbindungen Testen pharmakologische auf die Beseitigung von Schleim ausgerichtet die Lunge ^14-17. Als Ergebnis eines zunehmenden Interesses in biology Mucin und die Erzeugung neuer, spezifischere Mucin-Antikörper beschreiben wir herein die Methodik zu trennen Mucine durch Agarose-Gelelektrophorese, Vakuum Transfer auf Nitrocellulose und Zweifarben-Infrarot-Fluoreszenzdetektion.

Protokoll

1. Bereiten Sie Puffer für Mucin Gel Western Blotting

1. Bereiten Sie 1 Liter 50x TAE (Tris-Acetat-EDTA) Puffer.
   1. In 700 ml destilliertem Wasser (dH ₂ O) in 242 g Tris - Base (0,4 M), 57,1 g Eisessig (wiegen Flüssigkeit) (0,2 M) und 14,61 g (EDTA) (50 mM).
   2. Der pH - Wert auf 8,0 und das Volumen machen bis zu 1 Liter mit dH ₂ O.
2. Herstellung von 10 ml der 10fach-Beladungspuffer.
   1. Bereiten Sie 5 ml 1x TAE-Puffer. Dazu werden 5 ml Glycerin (50%), 25 mg Bromphenolblau (0,25%) und 100 mg Natriumdodecylsulfat (SDS) (1%).
3. Bereiten Sie 2 Liter 20x Natrium Kochsalzcitrat (SSC) Puffer.
   1. In 1,5 l dH ₂ O, fügen 350,6 g NaCl (3 M) und 176,4 g Trinatriumcitrat (Na ₃ C ₆ H ₅ O ₇₎ (0,3 M). Der pH - Wert auf 7,0 und das Volumen auf 2 Liter mit dH ₂ O bilden
4. Bereiten Sie 1 Liter 1x TAE-0,1% SDS-Puffer.
   1. 20 ml 50x TAE bis 980 ml ​​dH ₂ O. 1 g SDS zu einer 0,1% igen SDS-TAE-Lösung zu machen.

2. TAE-SDS-Agarose-Gel Vorbereitung

1. (. Dh 150 ml) Gießen ausreichendes Volumen 1x TAE-0,1% SDS - Puffer in einem microwavable Erlenmeyerkolben , um eine 5-7 mm dicke Gel. Hinzufügen, 0,8% (1,2 g) Agarose-Pulver.
2. Mikrowelle Kolben in 30 Sekunden-Intervallen mit intermittierender wirbelnden bis Agarose vollständig gelöst ist (normalerweise 1 - 3 Minuten). Verwenden Sie heiße Hand Pads während dieses Prozesses. Seien Sie vorsichtig, plötzliches Überkochen während wirbeln.
3. Lassen Sie die Agarose-Lösung abkühlen 5 - 10 min. Hinweis: Die Agarose-Lösung bereit sein wird, gegossen werden, wenn Boden des Kolbens für 5 sec auf der Handfläche belassen werden.
4. Bereiten Elektrophorese Gussschale (10 x 15 cm), indem Sie die Ränder mit Dichtband und Platzierung gut in Position kämmen.
5. Gießen Sie langsam Agarose-Lösung in ter Gussschale die Bildung von Blasen zu vermeiden. Entfernen Sie Blasen, die eine Pipettenspitze. Warten Sie auf das Gel zu kühlen und vollständig zu verfestigen. Einmal verfestigt, nehmen Sie den Kamm langsam durch Absaugen kollabiert die Vertiefungen zu vermeiden, und das Band von den Rändern der Schale zu entfernen.
6. Legen Agarose-Gel in das Gel Box und füllen Sie die Elektrophorese-Einheit mit 1x TAE-0,1% SDS-Puffer, bis das Gel vollständig bedeckt ist.

3. Probe geladen und Elektrophorese-Trenn

Hinweis: In unserem Labor haben wir häufig Proben verwenden, um von Maus und Menschen, einschließlich bronchoalveolären Lavage (BALF, beide Spezies), Zell-Waschungen aus humanen bronchialen Epithelzellen (HBE) und menschlichem Speichel und Sputum-Proben. Proben können durch Zugabe von Proteinase-Inhibitor-Cocktail in 6 M Harnstoff bei der Abholung oder gelagert für kurze Zeiträume (6 h) denaturiert werden.

1. Vorbereiten Proben für die Beladung durch Zugabe von 10% der Lade Farbstoff zu jeder Probe (dh., 30 ul Probe und 3ul Farbstoff). Homogenisieren Proben von oben und unten Pipettieren. Spin Kurz Röhrchen bei 5.000 Umdrehungen pro Minute nach unten Tröpfchen zu sammeln.
2. Sorgfältig laden gleichen Volumen von Proben in die Vertiefungen.
   1. Vornässen Spitzen und / oder Verdrängungspipetten verwenden Laden von hochviskosen Proben zu erleichtern. Langsam absaugen 80-90% der Proben-Farbstofflösung (dh 27 bis 30 & mgr; l) Pipettieren Blasen zu vermeiden.
   2. am Boden der Wells laden langsam und schrittweise nach oben die Pipettenspitze zu bewegen. Bei Proben, die an der Pipettenspitze befestigt bleiben, in einem 45 ° Winkel verzichtet und gerade über dem Brunnen verlängern oder sanft auf die Seite des gut verwenden, um den sehnig Schleim brechen. Sie nicht die Brunnen überlasten.
3. Verbinden Sie die Elektroden aus dem Gel Box auf der Elektrophorese-Stromerzeuger. Sicherstellen , dass die Elektroden korrekt angeschlossen sind (dh., Angeschlossen rote Kabel am positiven Ausgang des Generators) zu erlauben , negativ geladene Muzine in Richtung der positiven laufen Elektrode.
4. Laufen um das Gel bei 80 Volt für 90 min für eine einzelne Kamm Gel oder 60-75 min nach einem Doppelkamm Gel Überlappung zwischen den beiden Reihen zu verhindern.
5. Schalten Generatorleistung aus und trennen die Elektroden von der Stromquelle.
6. Entfernen Sie vorsichtig das Gel aus dem Gel-Box mit einer Hand auf beiden Seiten der Gelträger das Gel bleibt an Ort und Stelle zu gewährleisten.

4. Reduzieren Agarose-Gel für die effiziente Übertragung Mucin

1. Legen Sie das Gel flach in einem Glasbehälter. Spülen Sie das Gel mit dH ₂ O Spuren von TAE-SDS - Puffer zu entfernen.
2. Vorbereitung 1 Liter 4x SSC - Puffer durch Zugabe von 200 ml 20x SSC in 800 ml dH ₂ O. Machen 200 ml von 10 mM Dithiothreitol (DTT) 4x SSC Lösung durch Zugabe von 309 mg von frischem DTT in 200 ml 4x SSC-Puffer.
3. Weichen Sie das Gel mit DVB-T-4x SSC-Puffer und Deckel. sachte für 20 min (10 Umdrehungen pro Minute). Spülen Sie Gel mit DVB-T-freien Puffer 4x SSC.

"> 5. Vakuum-Kladde Montage und Sample Transfer auf eine Nitrocellulosemembran

1. Bereiten Sie Vakuum Löscher für die Übertragung.
   1. Bei Abmessungen Nitrocellulosemembran etwas breiter als das Gel (dh., 10 x 15 cm) Schneiden Sie vorsichtig.
   2. Nasse poröse Matte mit dH ₂ O und legen Sie es glatt Seite nach oben in die Kladde.
   3. Wet Nitrocellulosemembran mit DTT freien SSC-Puffer 4x und legen Sie sie in der Mitte der porösen Matte.
   4. Decken die poröse Matte mit der Gummidichtung, so dass die Öffnung der Dichtung präzise mit der Nitrocellulose-Membran ausgerichtet ist. Wenn poröse Matte noch sichtbar ist, stellen Sie vorsichtig die Membran kein Spalt bleibt zwischen Dichtung und Membran zu gewährleisten.
2. Legen Sie das Agarose-Gel auf der Oberseite der Membran. Gewährleisten Gel bildet eine dichte Abdichtung mit der Dichtung und die Vertiefungen des Gels auf der Membran für die Übertragung angeordnet sind.
   1. Vermeiden die Bildung von Blasen zwischen der Membran und dem Gel. Zur Minimierung derBildung von Blasen, spritzen einige Tropfen 4x SSC auf die Membran puffern und das Gel von oben nach unten keine Blasen gebildet zu spülen gleiten. Vermeiden Sie das Gel auf die Membran bewegt, wie Proteine ​​sofort auslöschen beginnt.
3. Sorgfältig abdecken, das Gel mit Puffer 4x SSC.
4. Beginnen Mucin Übertragung durch Absaugen.
   1. Drehen Sie Vakuum blotter ein und setzen Sie Druck bei 40 - 50 mbar. Fügen Sie ein paar Tropfen 4x SSC-Puffer auf dem Gel alle 5 - 10 min, das Gel vor dem Austrocknen zu verhindern. Führen Sie Transfer für 90 min. Optional: Nach der Fertigstellung der Brunnen mit einem Bleistift zur Orientierung markieren.
5. Entsorgen Sie das Gel und Abrufen von Nitrocellulosemembran auf dem Rand der Membran Kunststoff-Pinzette.

6. Membran Blocking und Nachweis

1. Spülen Membran sofort mit 1x phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS). Nicht die Membran austrocknen lassen.
2. Tauchen Sie die Membran in 50 ml 3% Milch-PBS Blockierungspuffer und auf ein rocker bei Raumtemperatur für 1 Std. die Blockierungspuffer Nach der Inkubation verwerfen.
3. Tauchen Membran in 1% Milch-PBS primären Antikörperlösung. Inkubieren der Membran in der primären Antikörperlösung über Nacht auf einem Schüttler bei 4 ° C. Nach der Inkubation verwerfen die primäre Antikörperlösung. Verdünne die primären Antikörper gegen ein 1: 2000 Verhältnis der Antikörperlösung Puffer zu blockieren. Anmerkung: Für Proben von Mäusen stammen, verwenden wir UNC 222 Kaninchen-anti-MUC5B und Ziege-anti-Green Fluorescent Protein (GFP). Bei Proben von Menschen stammen, verwenden wir H300 anti-MUC5B und 45M1 anti-MUC5AC primären Antikörper.
4. Wasch Membran 3 mal für 10 min auf einer Wippe mit PBS.
5. Tauchen Membran in 1% Milch-PBS sekundäre Antikörperlösung. Verdünne die Sekundärantikörper zu einer 1: 7.500 - Verhältnis von Antikörperlösung Puffer zu blockieren und Inkubation für 1 h auf einem Schüttler bei Raumtemperatur (beispielsweise 700 - Anti-Kaninchen und Anti-Ziege - 680.). Vor Licht durch in einem nicht transparenten Co Inkubationntainer. Entsorgen Sie die sekundären Antikörper-Lösung nach 1 Stunde.
6. Waschen Sie die Membran 3 mal mit PBS für 5 min. Spülen Membran mit dH ₂ O Salz zu entfernen.
7. Lesen Sie die Membran auf einem Infrarot-Fluoreszenzsystem nach den Anweisungen des Herstellers.

Ergebnisse

Wir zeigen repräsentative Ergebnisse von Muzinexpression folgende Agarose - Gelelektrophorese in BALF aus den Lungen von Mäusen (Abbildung 1). Folgende IL-13 Behandlung des Tg-MUC5AC Maus-Modell In diesem Beispiel verwendeten wir das Agarosegel upregulation zu zeigen, Produktion Mucin. Der Western - Blot zeigt eine visuelle Darstellung der Muzinexpression, die für eine quantitative Analyse von Multimer oder Monomerbande Signalintensität (Abbildung 2)...

Diskussion

Das Protokoll von Western - Blot in diesem Video kombiniert in der Molekularbiologie üblichen Techniken beschrieben Mucin große Makromoleküle zu trennen und zu übertragen, wie beispielsweise DNA, mit regelmäßigen Techniken zur Proteindetektion, dh., Immun - Blotting. Dieselbe Technik kann angewandt werden , die Biologie komplexer Glykosaminoglykanen zu studieren, wie beispielsweise den Abbau von hochmolekularen Hyaluronsäure ^18. Obwohl diese Technik in einem breiten Bereich von Assays erfolgre...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Tris Base	Sigma	T6060-1kg	1kg
Glacial Acetic Acid	Sigma	ARK2183-1L	1L
EDTA	Sigma	EDS-100g	100g
Glycerol	Fisher	BP229-1	1L
Bromophenol Blue	Sigma	114391-5g	5g
SDS (Sodium Dodecyl Sulfate)	Sigma	L6026-50g	50g
20X SSC (Sodium Saline Citrate) Buffer	Promega	V4261	1L
NaCl	Fisher	S271-1	1kg
Trisodium Citrate (Na3C6H5O7)	Sigma	W302600-1kg	1kg
10 mM DTT (dithiothreitol)	Sigma	D0632	25g
Milk Powder	Saco		Instant non-fat dry milk
Dulbecco Phosphate Buffered Saline (D-PBS)	Gibco lifetechnologies	14200-025	500mL
Anti-GFP Goat Primary Antibody (mouse samples)	Rockland antibodies and assays	600-101-215	1 mg
UNC 222 Anti-Muc5b Rabbit Primary Antibody (mouse samples)	UNC
H300 Anti-MUC5B Primary Antibodies (human samples)	Santa Cruz	sc-20119	200ug
45M1 Anti-MUC5AC Primary Antibodies (human samples)	Abcam	ab3649	100ug
Donkey Anti-rabbit 800CW IR Dye	LI-COR Biosciences	926-32213	0.5mg
Donkey Anti-mouse 680LT IR Dye	LI-COR Biosciences	926-68022	0.5mg
Electrophoresis Gel Box and Casting Tray	Owl Seperation Systems
Power Supply Box	Biorad	Model 200/20
Membrane Blotting Paper	Amersham	10600016
Whatman Paper and Nitrocellulose membrane	GE	10 439 196
Boekel/Appligene Vacuum Blotter 230v	Expotech USA	230600-2
Odyssey Infrared Fluorescence System	LI-COR Biosciences