Mucina Agarosio elettroforesi su gel: Western Blotting per glicoproteine ​​ad alto peso molecolare

Riepilogo

Mucins are high-molecular-weight glycoconjugates, with size ranging from 0.2 to 200 megadalton (MDa). As a result of their size, mucins do not penetrate conventional polyacrylamide gels and require larger pores for separation. We provide a detailed protocol for mucin agarose gel electrophoresis to assess relative quantification and study polymer assembly.

Abstract

Mucine, le proteine ​​pesantemente glicosilata che rivestono le superfici mucose, si sono evoluti come componente chiave di difesa innata proteggendo l'epitelio contro gli agenti patogeni invasori. Il ruolo principale di queste macromolecole è di facilitare la cattura delle particelle e la clearance favorendo la lubrificazione della mucosa. Durante la sintesi proteica, mucine subiscono intensa O-glicosilazione e multimerizzazione, che aumentano notevolmente la massa e le dimensioni di queste molecole. Queste modificazioni post-traduzionali sono critici per le proprietà viscoelastiche del muco. Come risultato della complessa natura biochimica e biofisica di queste molecole, lavorando con mucine fornisce molte sfide che non possono essere superati mediante metodi di analisi proteica convenzionali. Per esempio, il loro alto peso molecolare impedisce migrazione elettroforetica mediante gel di poliacrilammide regolari e la loro natura appiccicosa provoca l'adesione al tubo sperimentale. Tuttavia, indagando il ruolo di mucine nella salute(Ad es., Mantenendo l'integrità della mucosa) e malattia (ad es., Iperconcentrazione, mucostasis, cancro) ha recentemente guadagnato interesse e mucine sono oggetto di indagine come un obiettivo terapeutico. Una migliore comprensione della produzione e della funzione di macromolecole mucina può portare ad approcci farmaceutici innovativi, ad esempio, inibitori di mucina esocitosi di granuli e / o agenti mucolitici. Pertanto, i protocolli coerenti e affidabili per indagare la biologia mucina sono fondamentali per il progresso scientifico. Qui, descriviamo i metodi convenzionali per separare mucina macromolecole mediante elettroforesi utilizzando un gel, il trasferimento della proteina in membrana di nitrocellulosa, e rilevare il segnale con anticorpi specifici mucina così come lettore di gel a fluorescenza a raggi infrarossi. Queste tecniche sono ampiamente applicabile per determinare mucina quantificazione, multimerizzazione e per testare gli effetti dei composti farmacologici su mucine.

Introduzione

Mucine sono normalmente prodotti da superfici mucose che rivestono le cavità esposti all'ambiente esterno (ad es., Respiratorio, digestivo, tratto riproduttivo, superficie oculare), così come gli organi interni (ad esempio, pancreas, della cistifellea, ghiandole mammarie). La presenza di queste glicoproteine ​​mantiene l'idratazione superficiale e forma una barriera fisica contro i patogeni. Anche se la produzione di mucina è essenziale per la salute della mucosa, mucina iperconcentrazione e / o muco aberranti può portare a ostruzione del dotto, la colonizzazione batterica e infiammazione cronica, che può causare danni ai tessuti irreversibili. Un simile cascata di eventi sono stati osservati in diverse malattie, per esempio., La fibrosi cistica ^1, otite media cronica ² e l'infezione cervicovaginale ^3. Pertanto, è importante comprendere il ruolo di mucine di salute e di malattia e di stabilire protocolli di routine per l'identificazione di proteine.

Ad oggi, 19 mucine geni sono stati identificati e codificano per grandi catene polipeptidiche che vanno da 1.200 (ad es., MUC1) a 22.000 (per esempio, MUC16) aminoacidi. La famiglia genica mucina può essere divisa in due sottotipi: le mucine associate alla membrana, coinvolte nella segnalazione cellulare e la superficie schermante e le mucine gelificanti, responsabile delle proprietà viscoelastiche del gel muco. mucine associata alla membrana sono per lo più monomerica e allegare alla superficie delle cellule tramite un dominio di membrana-spanning idrofoba. Al contrario, mucine gelificanti possiedono diversi -come e ricche di cisteina domini fattore di von Willebrand (vWF) che sono essenziali per la formazione di reti polimeriche dinamiche. Grandi glicani sono attaccati alla serina e treonina distribuiti in tutto il apomucin. Questi oligosaccaridi densi O-linked possono contribuire fino al 80% del peso molecolare ^4. Intra e inter-molecolari legami disolfuro che collegano monomeri mucina garantire l'integrità del networ gel di mucinaK. Come risultato di glicosilazione pesante e multimerizzazione, mucine sono tra le più grandi molecole nel mondo animale e non possono essere analizzati mediante elettroforesi su gel standard utilizzando convenzionale gel SDS-PAGE poliacrilammide e scale proteine ​​standard. Questi metodi risolvono / proteine ​​separate con pesi molecolari inferiori a 250 kDa mentre monomeri mucina possono raggiungere fino a 2 MDa nel caso di MUC16. Tuttavia, scale di proteine ​​ad alto peso molecolare possono essere utilizzati per studiare piccoli monomeri mucina (es., MUC1).

Una varietà di tecniche può essere applicata per studiare dimensioni mucina, conformazione e interazione. Tradizionalmente, caratterizzazione biochimica di mucine si ottiene mucina isolamento tramite isopycnic centrifugazione in gradiente di densità in buffer di denaturazione, seguita da cromatografia dimensione esclusione e immunorilevazione (ad es., Di slot blotting) ^5. e / o diffusione della luce multi-angolo dinamico fornire informazioni sullo stato oligomerico di campioni ricchi di mucina ^{1. Inoltre, centrifugazione rate-zonale accoppiato con immunolocalizzazione e microscopia elettronica a trasmissione sono comunemente utilizzati per determinare la conformazione macromolecolare di mucine 6. La spettrometria di massa è anche usato per quantificare mucine, rilevare taglio proteolitico e analizzare la composizione oligosaccaride 1,7,8. Tali tecniche sono costose, richiede tempo e spesso richiedono grandi volumi e / o alte concentrazioni di campione. La metodologia descritta, ad esempio., Mucina separazione mediante elettroforesi, è riproducibile, a basso costo e può essere usato in studi di alta throughput per fornire relativa mucina quantificazione e indagare assemblaggio polimero. Tuttavia, questo test richiede ad alta affinità, ad alta specificità anticorpi mucina che potrebbero non essere disponibili per rari mucine (ad es., MUC19) o alcune specie (ad es., Maiale, Ferret).}

Agarose Western blotting è adatto per risolvere una varietà di campioni ricchi di mucina con concentrazionezioni che vanno da 50 mg / ml (ad es., lavaggi cellulari) a 5 mg / ml (ad es., espettorato). Questo test è stato introdotto nel 1990 ed è stata eseguita solo in pochi laboratori specializzati ^9,10. Inizialmente, questa tecnica ha contribuito ad individuare sottopopolazioni di monomeri mucina nelle secrezioni respiratorie dell'uomo ^11,12 e confermato il processo di oligomerizzazione in cellule caliciformi, che consiste di formazione dimero nel reticolo endoplasmatico seguita da dimero multimerizzazione nel Golgi ^13. Più di recente, la generazione di anticorpi policlonali contro mucine murini facilitato studi su modelli animali di piccole dimensioni (ad es., Mucina deficienti, modelli murini βENaC, OVA-sfidati) e ha aperto un nuovo campo di ricerca per gli studi preclinici composti test farmacologici che mirano a rimuovere il muco dal i polmoni ^14-17. Come risultato di un crescente interesse mucina biologia e la generazione di nuovi e più specifici anticorpi mucina, descriviamo herein metodologia per separare mucine mediante elettroforesi su gel di agarosio, trasferimento vuoto nitrocellulosa e rilevazione fluorescente infrarosso bicolore.

Protocollo

1. Preparare buffer per Mucin Gel Western Blotting

1. Preparare 1 litro di 50x TAE (Tris-acetato-EDTA) buffer.
   1. In 700 ml di acqua distillata (dH ₂ O) aggiungere 242 g di Tris base (0,4 M), 57,1 g di acido acetico glaciale (pesare liquido) (0,2 M) e 14.61 g di acido etilendiamminotetraacetico (EDTA) (50 mM).
   2. Regolare il pH a 8,0 e rendere il volume fino a 1 litro con dH ₂ O.
2. Preparare 10 ml di 10x tampone di caricamento.
   1. Preparare 5 ml di tampone 1x TAE. A tale scopo, aggiungere 5 ml di glicerolo (50%), 25 mg di blu di bromofenolo (0,25%) e 100 mg di sodio dodecil solfato (SDS) (1%).
3. Preparate 2 litri di tampone 20x di sodio citrato di soluzione salina (SSC).
   1. In 1,5 litri di dH ₂ O, aggiungere 350,6 g di NaCl (3 M) e 176,4 g di citrato trisodico (Na ₃ C ₆ H ₅ O ₇₎ (0,3 M). Regolare il pH a 7,0 e portare il volume a 2 litri con dH ₂ O.
4. Preparare 1 litro di 1x tampone TAE-0.1% SDS.
   1. Aggiungere 20 ml di 50x TAE a 980 ml ​​di dH ₂ O. Aggiungere 1 g di SDS per ottenere una soluzione 0,1% SDS-TAE.

2. TAE-SDS agarosio gel Preparazione

1. (. Vale a dire, 150 ml) Versare un volume sufficiente di 1x TAE-0,1% tampone SDS in un pallone di Erlenmeyer nel microonde per fare un 5 - gel di 7 millimetri di spessore. Aggiungere 0,8% (1,2 g) di polvere di agarosio.
2. Forno a microonde pallone in intervalli di 30 sec con vorticoso intermittente fino agarosio è completamente sciolto (in genere 1 - 3 min). Usare tamponi mano calda durante questo processo. Fare attenzione di ebollizione eruttiva mentre vorticoso.
3. Lasciare che la soluzione di agarosio raffreddare per 5 - 10 minuti. Nota: La soluzione di agarosio sarà pronto per essere versato quando fondo del pallone può essere lasciato sul palmo per 5 sec.
4. Preparare vassoio colata elettroforesi (10 x 15 cm) sigillando i bordi con nastro e sistemazione ben pettine in posizione.
5. Versare lentamente soluzione di agarosio in tha colata vassoio per evitare la formazione di bolle. Eliminare le bolle utilizzando una punta della pipetta. Attendere il gel raffreddare e solidificare completamente. Una volta solidificato, rimuovere il pettine lentamente per evitare collasso pozzetti mediante aspirazione e rimuovere il nastro dai bordi del vassoio.
6. Mettere gel nella casella di gel e riempire l'unità di elettroforesi con 1x TAE-0.1% tampone SDS fino a quando il gel è completamente coperto.

3. Il campione Caricamento e elettroforesi La separazione

Nota: Nel nostro laboratorio, usiamo comunemente campioni sia da mouse e gli esseri umani, tra cui il fluido di lavaggio broncoalveolare (BAL; entrambe le specie), lavaggio delle cellule dalle cellule epiteliali bronchiali umane (HBE), e campioni di saliva e di espettorato umani. I campioni possono essere denaturate in 6 M di urea al momento della raccolta o conservati per brevi periodi di tempo (6 ore) con l'aggiunta di inibitore della proteinasi cocktail.

1. Preparare campioni per loading aggiungendo 10% di colorante di caricamento per ciascun campione (es., 30 ml di campione e 3ml di colorante). Omogeneizzare campioni pipettando su e giù. Brevemente spin down tubi a 5.000 giri per raccogliere gocce.
2. caricare con cautela uguale volume di campioni nei pozzetti.
   1. punte Pre-umidi e / o utilizzare pipette spostamento positivo per facilitare il caricamento dei campioni altamente viscosi. Lentamente aspirato 80-90% della soluzione del campione-dye (per esempio, 27 - 30 ml) per evitare le bolle di pipettamento.
   2. Lentamente caricare al fondo dei pozzetti e progressivamente spostare la punta della pipetta verso l'alto. Per i campioni che rimangono attaccate alla punta della pipetta, dispensare a 45 ° e allungare dritto sopra pozzo o delicatamente utilizzare il lato del pozzo per rompere il muco filante. Non sovraccaricare i pozzi.
3. Collegare gli elettrodi dalla scatola gel per il generatore di corrente elettroforesi. Assicurarsi che gli elettrodi siano collegati correttamente (es., Cavo rosso collegato all'uscita positivo del generatore) per consentire negativamente mucine a correre verso il positivo addebitato elettrodo.
4. Attivare il gel a 80 Volts per 90 minuti per un singolo gel pettine, o 60 - 75 min per un gel doppio pettine per evitare sovrapposizioni tra le due file.
5. SPEGNERE generatore e scollegare gli elettrodi dalla sorgente di alimentazione.
6. Rimuovere accuratamente il gel dalla scatola gel con una mano su entrambi i lati del vassoio di colata per garantire il gel rimanga in posizione.

4. Ridurre agarosio gel per un efficiente trasferimento Mucin

1. posizionare con cura il piano di gel in un contenitore di vetro. Lavare il gel con dH ₂ O per rimuovere le tracce di tampone TAE-SDS.
2. Preparare 1 litro di tampone di 4x SSC aggiungendo 200 ml di 20x SSC in 800 ml di dH ₂ O. Rendere 200 ml di 10 mM ditiotreitolo (DTT) soluzione 4x SSC aggiungendo 309 mg di fresco DTT in 200 ml di tampone 4x SSC.
3. Immergere il gel con tampone DTT-4x SSC e la copertura. Agitare delicatamente per 20 min (10 rotazioni al minuto). Risciacquare gel con DTT-libera tampone 4x SSC.

"> 5. Aspirare Assemblea assorbente e di trasferimento del campione ad una membrana di nitrocellulosa

1. Preparare carta assorbente vuoto per il trasferimento.
   1. Asportare accuratamente membrana di nitrocellulosa a dimensioni leggermente più ampie rispetto al gel (es., 10 x 15 cm).
   2. Wet tappeto poroso con dH ₂ O e posizionarlo liscio-side-up nella carta assorbente.
   3. Wet membrana di nitrocellulosa con tampone SSC 4x DTT-libero e posizionarlo al centro del tappeto porosa.
   4. Coprire il tappetino poroso con la guarnizione di gomma, lasciando l'apertura della guarnizione precisamente allineato con la membrana di nitrocellulosa. Se mat porosa è ancora visibile, regolare con cura la membrana per garantire l'assenza divario resta tra la guarnizione e la membrana.
2. posizionare accuratamente il gel di agarosio sopra della membrana. Assicurare forma un gel una tenuta ermetica con la guarnizione ed i pozzetti del gel sono posizionati sulla membrana per il trasferimento.
   1. Evitare la formazione di bolle tra la membrana ed il gel. Per minimizzare laformazione di bolle, spruzzare qualche goccia di 4x SSC tampone sulla membrana e far scorrere il gel da cima a fondo per svuotare eventuali bolle formate. Evitare di spostare il gel sulla membrana proteine ​​inizierà a cancellare immediatamente.
3. coprire con cura il gel con il tampone 4x SSC.
4. Inizia trasferimento mucina mediante aspirazione.
   1. Accendere carta assorbente vuoto su e impostare la pressione a 40 - 50 mbar. Aggiungere qualche goccia di tampone 4x SSC sul gel ogni 5 - 10 minuti per evitare che il gel si asciughi. trasferimento Run per 90 min. Opzionale: Al termine, segnare i pozzetti con una matita per l'orientamento.
5. Eliminare il gel e recuperare membrana di nitrocellulosa utilizzando pinzette di plastica sul bordo della membrana.

6. Blocco membrana e rilevamento

1. Risciacquare membrana immediatamente con soluzione salina 1x tampone fosfato (PBS). Non lasciate che la membrana asciugare.
2. Immergere la membrana in 50 ml di 3% di latte-PBS tampone di bloccaggio e posto su un rocker a temperatura ambiente per 1 ora. Dopo l'incubazione, scartare il tampone bloccante.
3. Immergere membrana 1% soluzione di anticorpo primario latte-PBS. Incubare la membrana nella soluzione di anticorpo primario durante la notte su una sedia a dondolo a 4 ° C. Dopo l'incubazione, scartare la soluzione di anticorpo primario. Diluire gli anticorpi primari ad un rapporto di 1: 2.000 di soluzione di anticorpi al tampone di bloccaggio. Nota: Per i campioni provenienti da topi, usiamo UNC 222 coniglio anti-Muc5b e capra proteina anti-verde fluorescente (GFP). Per i campioni provenienti da esseri umani, usiamo H300 anti-MUC5B e 45M1 anti-MUC5AC anticorpi primari.
4. membrana lavata 3 volte con PBS per 10 minuti su un agitatore meccanico.
5. Immergere membrana 1% soluzione di anticorpo secondario latte-PBS. Diluire gli anticorpi secondari ad un rapporto di 1: 7.500 di soluzione di anticorpi tampone bloccante e incubare a temperatura ambiente per 1 ora su un agitatore meccanico (ad esempio, 700 anti-coniglio e 680 anti-capra.). Proteggere dalla luce incubando in un co non trasparententainer. Scartare la soluzione di anticorpo secondario dopo 1 ora.
6. membrana lavare 3 volte con PBS per 5 min. Risciacquare a membrana con dH ₂ O per rimuovere il sale.
7. Leggere la membrana su un sistema di fluorescenza a raggi infrarossi secondo le istruzioni del produttore.

Risultati

Mostriamo risultati rappresentativi di espressione mucina seguenti elettroforesi su gel di agarosio in BALF dai polmoni di topi (Figura 1). In questo esempio, abbiamo usato il gel per mostrare upregulation di mucina produzione di IL-13 dopo il trattamento del modello di topo Tg-MUC5AC. Il Western blot mostra una rappresentazione visiva di espressione mucina, che può essere utilizzato per l'analisi quantitativa di multimero o l'intensità del segnale di banda mon...

Discussione

Il protocollo di mucina Western blotting descritto in questo video combina tecniche convenzionali utilizzate in biologia molecolare per separare e trasferire grandi macromolecole, come il DNA, con tecniche regolari per il rilevamento di proteine, cioè., Immunoblotting. La stessa tecnica può essere applicata per studiare la biologia di glicosaminoglicani complessi, quali la ripartizione di alta peso molecolare dell'acido ialuronico ^18. Sebbene questa tecnica potrebbe essere utilizzata in un'...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Tris Base	Sigma	T6060-1kg	1 kg
Glacial Acetic Acid	Sigma	ARK2183-1L	1 L
EDTA	Sigma	EDS-100g	100 g
Glycerol	Fisher	BP229-1	1 L
Bromophenol Blue	Sigma	114391-5g	5 g
SDS (Sodium Dodecyl Sulfate)	Sigma	L6026-50g	50 g
20x SSC (Sodium Saline Citrate) Buffer	Promega	V4261	1 L
NaCl	Fisher	S271-1	1 kg
Trisodium Citrate (Na3C6H5O7)	Sigma	W302600-1kg	1 kg
10 mM DTT (dithiothreitol)	Sigma	D0632	25 g
Milk Powder	Saco		Instant non-fat dry milk
Dulbecco Phosphate Buffered Saline (D-PBS)	Gibco lifetechnologies	14200-025	500 ml
Anti-GFP Goat Primary Antibody (mouse samples)	Rockland antibodies and assays	600-101-215	1 mg
UNC 222 Anti-Muc5b Rabbit Primary Antibody (mouse samples)	UNC
H300 Anti-MUC5B Primary Antibodies (human samples)	Santa Cruz	sc-20119	200 μg
45M1 Anti-MUC5AC Primary Antibodies (human samples)	Abcam	ab3649	100 μg
Donkey Anti-rabbit 800CW IR Dye	LI-COR Biosciences	926-32213	0.5 mg
Donkey Anti-mouse 680LT IR Dye	LI-COR Biosciences	926-68022	0.5 mg
Electrophoresis Gel Box and Casting Tray	Owl Seperation Systems
Power Supply Box	Biorad	Model 200/20
Membrane Blotting Paper	Amersham	10600016
Whatman Paper and Nitrocellulose membrane	GE	10 439 196
Boekel/Appligene Vacuum Blotter 230 v	Expotech USA	230600-2
Odyssey Infrared Fluorescence System	LI-COR Biosciences