ムチンアガロースゲル電気泳動：高分子量の糖タンパク質のためのウェスタンブロッティング

要約

Mucins are high-molecular-weight glycoconjugates, with size ranging from 0.2 to 200 megadalton (MDa). As a result of their size, mucins do not penetrate conventional polyacrylamide gels and require larger pores for separation. We provide a detailed protocol for mucin agarose gel electrophoresis to assess relative quantification and study polymer assembly.

要約

ムチン、粘膜表面を裏打ち重くグリコシル化タンパク質は、侵入する病原体に対する上皮を保護することにより先天的防御の重要なコンポーネントとして発展してきました。これらの高分子の主な役割は、粘膜の潤滑を促進しながら粒子捕獲およびクリアランスを容易にすることです。タンパク質合成の間に、ムチンは劇的にこれらの分子の質量と大きさを増加させる強烈なO-グリコシル化および多量体を受けます。これらの翻訳後修飾は、粘液の粘弾性特性のために重要です。これらの分子の複雑な生化学的および生物物理学的性質の結果として、ムチンでの作業は従来のタンパク質分析方法によって克服することができない多くの課題を提供します。例えば、それらの高分子量は、通常のポリアクリルアミドゲルを介して電気泳動を防止し、その粘着性の性質は、実験チューブへの接着を引き起こします。しかし、健康でムチンの役割を調査（ 例えば 、粘膜の整合性を維持する）および疾患（ 例えば 、hyperconcentration、mucostasis、癌）は、最近関心を集めているし、ムチンは、治療標的として研究されています。高分子をムチンの産生および機能のより良い理解は、ムチン顆粒エキソサイトーシスの新規な医薬の手法、 例えば 、阻害剤および/ ​​または粘液溶解薬につながる可能性があります。したがって、一貫性と信頼性の高いプロトコルは、ムチン生物学は科学の進歩のために重要で調査しました。ここでは、アガロースゲルを用いた電気泳動によってムチン高分子を分離し、ニトロセルロース膜にタンパク質を転写し、ムチン特異的抗体を用いた信号ならびに赤外蛍光ゲルリーダーを検出するための従来の方法を説明します。これらの技術はムチン定量、多量体化を決定し、ムチンの薬理学的化合物の効果を試験するために広く適用されています。

概要

ムチンは、通常、外部環境にさらされた空洞を裏打ちする粘膜表面によって製造されている（ 例えば 、呼吸器、消化器、生殖器、眼表面）だけでなく、内臓（ 例えば 、膵臓、胆嚢、乳腺）。これらの糖タンパク質の存在は、表面水和を維持し、病原体に対する物理的障壁を形成します。ムチン生産は不可逆的な組織損傷を引き起こす可能性管閉塞、細菌定着および慢性炎症につながることができ、ムチンhyperconcentrationおよび/または異常な粘液の特性を健康粘膜することが不可欠ですが。イベントの同様のカスケードは、 例えば 、いくつかの疾患で観察される。、嚢胞性線維症^1、慢性中耳炎²と頸膣感染^3。従って、健康および疾患におけるムチンの役割を理解し、タンパク質同定のためのルーチンのプロトコルを確立することが重要です。

現在まで、19ムチン遺伝子が同定され、1200至るまで大きなポリペプチド鎖のためにエンコードされている（ 例えば 、MUC1）22,000（ 例えば 、MUC16）アミノ酸に。細胞シグナル伝達及び表面遮蔽に関与する膜関連ムチン、およびゲル形成ムチン、粘液ゲルの粘弾性特性を担う：ムチン遺伝子ファミリーは、2つのサブタイプに分類することができます。膜結合型ムチンは主に単量体であり、疎水性の膜貫通ドメインを介して細胞表面に付着します。対照的に、ゲル形成ムチンダイナミックポリマーネットワークの形成に必須であるいくつかのフォンビルブラント因子（vWF）様システインリッチドメインを有します。大グリカンはアポムチン全体に分散セリンおよびトレオニン残基に結合しています。これらの高密度のO結合型オリゴ糖は、分子量⁴の80％にまで寄与し得ます。ムチンモノマーを接続する分子内および分子間ジスルフィド結合は、ムチンゲルnetworの完全性を確保しますK。重いグリコシル化および多量体の結果として、ムチンは、動物の世界でも最大規模の分子の間であり、従来のSDS-PAGEポリアクリルアミドゲルと標準タンパク質ラダーを使用して、標準的なゲル電気泳動により分析することができません。ムチンモノマーはMUC16の場合は2 MDAに達することができますが、これらの方法は、250キロダルトンより低い分子量を有する/別々のタンパク質を解決します。しかしながら、高分子量のタンパク質ラダーは、小さなムチン単量体を研究するために使用することができる（ すなわち 、MUC1）。

種々の技術は、ムチンのサイズ、コンホメーションと相互作用を研究するために適用することができます。伝統的に、ムチンの生化学的特徴は、サイズ排除クロマトグラフィーおよび免疫検出に続いて、変性バッファに等密度密度勾配遠心分離を介して分離ムチンによって達成される（ 例えば 、スロットブロット法^）5。動的および/または多角度光散乱は、ムチンが豊富なサンプルのオリゴマー状態に関する情報を提供します ^{1。加えて、免疫および透過型電子顕微鏡を用いて結合されたレートゾーン遠心分離は、一般的にムチン6の巨大分子のコンホメーションを決定するために使用されます。質量分析はまた、ムチンを定量化するタンパク質分解的切断を検出し、オリゴ糖組成物1,7,8を分析するために使用されます。このような技術は、時間がかかり、多くの場合は、大容量および/または試料の高濃度を必要とする、高価です。本明細書に記載された方法、 すなわち 、電気泳動による分離ムチン、再現可能な、低コストであり、相対的なムチンの定量化を提供し、ポリマーのアセンブリを調査するためにハイスループット試験に使用することができます。しかし、このアッセイは、（ 例えば 、ブタ、フェレット）希少ムチン（ 例えば 、MUC19）、または特定の種のために利用できない場合があり、高親和性、高特異性ムチン抗体を必要とします。}

アガロースウェスタンブロッティングはconcentraとムチン豊富なサンプルの多種多様を解決するのに適しています50μg/ mlの（ 例えば 、細胞洗浄液）から5ミリグラム/ mlの範囲ン（ 例えば 、痰）。このアッセイは、1990年代に導入され、わずか数の専門研究室^9,10で行いました。最初は、この技術は、ヒトの気道分泌物^11,12にムチン単量体の亜集団を識別助け、ゴルジ装置¹³における二量体の多量に続いて小胞体内の二量体の形成で構成杯細胞におけるオリゴマー化プロセスを、確認しました。さらに最近では、マウスムチンに対するポリクローナル抗体の生成から粘液を除去することを目的とした試験薬理学的化合物を小動物モデルの研究（ 例えば 、欠損、βENaC、OVAチャレンジマウスモデルをムチン）を促進し、前臨床試験のための研究の新たな分野を開きました肺^14-17。生物学や小説、より具体的なムチン抗体の生成をムチン関心の高まりの結果として、我々はhereiを記述しますアガロースゲル電気泳動、ニトロセルロースに真空移送及び二色赤外蛍光検出によりムチンを分離するn個の方法。

プロトコル

1.ムチンジェルウェスタンブロッティングのためにバッファを準備

1. 50×TAE（トリス - 酢酸EDTA）緩衝液の1リットルを準備します。
   1. 蒸留水（のdH ₂ O）の700ミリリットルでトリス塩基（0.4 M）、氷酢酸（液体の重量を量る）（0.2 M）およびエチレンジアミン四酢酸（EDTA）（50 mM）のの14.61グラムの57.1グラムの242グラムを追加します。
   2. pHを8.0に調整し、 _の dH ₂ Oで1リットルにボリュームを構成します
2. 10倍のローディング緩衝液10mlを準備します。
   1. 1×TAE緩衝液5mlを準備します。これを行うために、グリセロール（50％）5mlを、ブロモフェノールブルー（0.25％）を25mg、及びドデシル硫酸ナトリウム（SDS）（1％）100mgを加えます。
3. 20倍のナトリウムクエン酸生理食塩水（SSC）バッファーの2リットルを準備します。
   1. dH ₂ Oの1.5リットルで、NaClを350.6グラム（3 M）とクエン酸三ナトリウムの176.4グラム（のNa ₃ C ₆ H ₅ O _7）（0.3 M）を追加します。 pHを7.0に調整し、 _の dH ₂ Oで2リットルにボリュームを構成します
4. 1×TAE-0.1％SDS緩衝液の1リットルを準備します。
   1. dH ₂ Oを980ミリリットルに50倍TAEの20ミリリットルを追加します。 0.1％SDS-TAE溶液を作製するためにSDSの1グラムを追加します。

2. TAE-SDSアガロースゲルの準備

1. 7ミリメートル厚のゲル- 5を作るために電子レンジ三角フラスコに1×TAE-0.1％SDS緩衝液の十分な量（ すなわち 、150ミリリットル）を注ぎます。 0.8％（1.2グラム）アガロース粉末を追加します。
2. 断続的に旋回しながら30秒間隔でマイクロ波フラスコアガロースが完全に溶解するまで（通常1から3分）。このプロセスの間にホットハンドパッドを使用してください。旋回しながら噴火沸騰に注意してください。
3. 10分 - アガロース溶液は5のために冷却することができます。注：アガロース溶液は、フラスコの底には5秒間手のひらに残すことができたときに注ぐことができるようになります。
4. テープで縁をシール位置に櫛よく配置することにより、電気泳動キャスティングトレイ（10×15センチ）を準備します。
5. トンでゆっくりとアガロース溶液を注ぎ彼は、気泡の形成を回避するために、トレイをキャスト。ピペットチップを使用して気泡を除去。冷却して完全に固化するゲルを待ちます。固化した後、吸引によってウェルを崩壊回避し、トレイの縁からテープを除去するために、ゆっくりとコームを抜き取ります。
6. ゲルボックスにアガロースゲルを置き、ゲルが完全に覆われるまで、1×TAE-0.1％SDSバッファーで電気泳動ユニットを埋めます。

3.サンプルのロードと電気泳動分離

注：当研究室では、我々は一般的に気管支肺胞洗浄液（BALF;両種）を含む、マウスおよびヒトの両方からのサンプル、使用、ヒト気管支上皮細胞（HBE）からの細胞洗浄液、およびヒト唾液や痰のサンプルを。サンプルは、収集時に6 M尿素で変性またはプロテイナーゼカクテル阻害剤を添加することによって、時間（6時間）の短い期間のために保存することができます。

1. サンプル3の（各サンプルにローディング色素を10％添加し、すなわちローディングのための試料を調製し、30μlの染料のμl）を。上下にピペッティングすることにより、サンプルをホモジナイズします。簡単に言えば、液滴を収集するために、5000 rpmでチューブをスピンダウン。
2. ウェルにサンプルを等量慎重をロードします。
   1. プリウェットヒントおよび/または粘性の高いサンプルのロードを容易にするために、容積式ピペットを使用しています。ピペット気泡を回避するために- （30μL すなわち 、27） -ゆっくり吸引80サンプル色素溶液の90％。
   2. ゆっくりウェルの底にロードし、次第に上向きにピペットチップを移動させます。ピペットの先端に取り付けられたままのサンプルについては、45°の角度で済ますとストレートだけでなく上に細長くやそっと糸粘液を破るために、ウェルの側面を使用します。井戸に負荷をかけすぎないでください。
3. 電気発電機にゲルボックスから電極を接続します。電極が正しく接続されていることを確認し、正の方に実行するために負に帯電したムチンを可能にするために（ すなわち 、鉛丹は、発電機の正の出力に差し込ま）電極。
4. 2行の間の重複を防ぐために、ダブルコームゲルのための75分 - シングルコームゲルのための90分、または60、80ボルトでゲルを実行します。
5. 発電機の電源をOFFにし、電源から電極を外してください。
6. 慎重にゲルが所定の位置に残って確保するためにキャスティングトレイのいずれかの側に片手でゲルボックスからゲルを削除します。

4.効率的なムチン転送のためのアガロースゲルを削減

1. 慎重にガラス容器にゲルを平らに置きます。 TAE-SDS緩衝液の痕跡を除去するためのdH ₂ Oでゲルを洗浄します。
2. dH ₂ Oを800ミリリットルに20×SSCの200ミリリットルを追加することにより、4倍SSC緩衝液の1リットルを準備4×SSC緩衝液200ml中に新鮮なDTTの309ミリグラムを添加することによって、10mMのジチオスレイトール（DTT）4×SSC溶液200mlを加えます。
3. DTT-4X SSC緩衝液とカバーとのゲルを浸し。ゆっくり20分（毎分10回転）のために岩。 DTTフリー4×SSC緩衝液でゲルを洗浄します。

ニトロセルロース膜へ "> 5。バキュームブロッターアセンブリおよびサンプル移送

1. 転送のために真空ブロッターを準備します。
   1. 慎重にゲル（ すなわち 、10×15センチ）よりも若干広い寸法でニトロセルロース膜をカット。
   2. dH ₂ Oで濡れた多孔質マットとブロッターにおけるスムーズなサイドアップに置きます。
   3. DTTフリー4倍のSSC緩衝液で濡れニトロセルロース膜と多孔質マットの中央に配置します。
   4. 正確にニトロセルロース膜に整列ガスケットの開口部を残して、ゴムパッキンを有する多孔質マットをカバーしています。多孔質マットがまだ表示されている場合は、慎重に隙間がガスケットと膜の間に残ってないことを確認するために膜を調整します。
2. 慎重膜の上にアガロースゲルを置きます。ガスケットとの緊密なシールとゲルのウェルを転送するための膜上に配置されたゲルフォームを確認してください。
   1. 膜とゲルの間に気泡の形成を避けます。最小化します気泡の形成は、膜上に4×SSC緩衝液の数滴を噴出し、任意の形成された気泡をフラッシュするために上から下にゲルをスライドさせます。タンパク質がすぐにブロットし始めるように膜上にゲルを移動しないでください。
3. 慎重に4×SSC緩衝液でゲルをカバーしています。
4. 吸引によりムチン転送を開始します。
   1. ON真空ブロッターを回し、40で圧力を設定 - 50ミリバール。乾燥からゲルを防ぐために10分 - ゲル上のすべての5の4倍SSC緩衝液の数滴を追加します。 90分間の転送を実行します。オプション：完了すると、オリエンテーションのための鉛筆でウェルをマーク。
5. ゲルを処分し、膜の縁にあるプラスチック製のピンセットを使用して、ニトロセルロース膜を取得します。

6.メンブレンのブロッキングと検出

1. 1×リン酸緩衝生理食塩水（PBS）ですぐに膜をすすぎます。膜を乾燥させてはいけません。
2. ROのバッファと場所をブロック3％ミルクPBS 50mlにメンブレンを浸し室温で1時間cker。インキュベーション後、ブロッキングバッファーを捨てます。
3. 1％ミルクPBS一次抗体溶液に膜を浸します。 4℃でロッカー上で一晩一次抗体溶液中で膜をインキュベートします。インキュベーションの後、一次抗体溶液を廃棄します。ブロッキング緩衝液に抗体溶液の2,000：1の比の一次抗体を希釈します。注：マウス由来のサンプルについては、我々はUNC 222ウサギ抗MUC5Bおよびヤギ抗緑色蛍光タンパク質（GFP）を使用します。人間由来のサンプルについては、我々は、H300抗MUC5Bおよび45M1抗MUC5AC一次抗体を使用しています。
4. ロッカー上で10分間、PBSで膜を3回洗浄します。
5. 1％ミルクPBS二次抗体溶液に膜を浸します。 （ 例えば 、700抗ウサギと680抗ヤギ）、ブロッキング緩衝液に抗体溶液の7,500比とロッカー上で1時間室温でインキュベート：1への二次抗体を希釈します。非透明共同でインキュベートすることにより、光から保護ntainer。 1時間後、二次抗体溶液を廃棄してください。
6. 5分間PBSで洗浄膜が3回。塩を除去するためのdH ₂ Oで膜を洗浄します。
7. 製造元の指示に従って赤外蛍光システム上の膜を読みます。

結果

我々は、マウスの肺からのBALFにおけるアガロースゲル電気泳動（ 図1）は、次式ムチンの代表的な結果を示します。この例では、Tgは、MUC5ACのマウスモデルのIL-13処置後のムチン産生のアップレギュレーションを示すために、アガロースゲルを使用しました。ウェスタンブロットは、多量体または単量体バンドシグナル強度の定量分析（ 図2）...

ディスカッション

このビデオで説明したウェスタンブロッティングをムチンのプロトコルは、タンパク質検出のための定期的な技術、 すなわち 、免疫ブロット法で、分離し、DNAなどの巨大分子を、転送するために分子生物学で使用される従来の技術を兼ね備えています。同技術は、高分子量ヒアルロン酸¹⁸の破壊のような複雑なグリコサミノグリカンの生物学を研究するために適用することが?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Tris Base	Sigma	T6060-1kg	1kg
Glacial Acetic Acid	Sigma	ARK2183-1L	1L
EDTA	Sigma	EDS-100g	100g
Glycerol	Fisher	BP229-1	1L
Bromophenol Blue	Sigma	114391-5g	5g
SDS (Sodium Dodecyl Sulfate)	Sigma	L6026-50g	50g
20X SSC (Sodium Saline Citrate) Buffer	Promega	V4261	1L
NaCl	Fisher	S271-1	1kg
Trisodium Citrate (Na3C6H5O7)	Sigma	W302600-1kg	1kg
10 mM DTT (dithiothreitol)	Sigma	D0632	25g
Milk Powder	Saco		Instant non-fat dry milk
Dulbecco Phosphate Buffered Saline (D-PBS)	Gibco lifetechnologies	14200-025	500mL
Anti-GFP Goat Primary Antibody (mouse samples)	Rockland antibodies and assays	600-101-215	1 mg
UNC 222 Anti-Muc5b Rabbit Primary Antibody (mouse samples)	UNC
H300 Anti-MUC5B Primary Antibodies (human samples)	Santa Cruz	sc-20119	200ug
45M1 Anti-MUC5AC Primary Antibodies (human samples)	Abcam	ab3649	100ug
Donkey Anti-rabbit 800CW IR Dye	LI-COR Biosciences	926-32213	0.5mg
Donkey Anti-mouse 680LT IR Dye	LI-COR Biosciences	926-68022	0.5mg
Electrophoresis Gel Box and Casting Tray	Owl Seperation Systems
Power Supply Box	Biorad	Model 200/20
Membrane Blotting Paper	Amersham	10600016
Whatman Paper and Nitrocellulose membrane	GE	10 439 196
Boekel/Appligene Vacuum Blotter 230v	Expotech USA	230600-2
Odyssey Infrared Fluorescence System	LI-COR Biosciences