Mucina Agarose Gel Eletroforese: Western Blotting para glicoproteínas alta peso molecular

Resumo

Mucins are high-molecular-weight glycoconjugates, with size ranging from 0.2 to 200 megadalton (MDa). As a result of their size, mucins do not penetrate conventional polyacrylamide gels and require larger pores for separation. We provide a detailed protocol for mucin agarose gel electrophoresis to assess relative quantification and study polymer assembly.

Resumo

Mucinas, as proteínas altamente glicosiladas que revestem as superfícies das mucosas, evoluíram como um componente chave da defesa inata, protegendo o epitélio contra patógenos invasores. O principal papel destas macromoléculas é facilitar aprisionamento de partículas e ao promover a lubrificação depuração da mucosa. Durante a síntese de proteínas, mucinas submetidos a intensa O-glicosilação e multimerização, o que aumenta drasticamente a massa e tamanho destas moléculas. Estas modificações pós-translacionais são essenciais para as propriedades viscoelásticas do muco. Como um resultado da natureza bioquímicas e biofísicas complexo destas moléculas, que trabalha com mucinas fornece muitos desafios que não podem ser superadas por meio de métodos convencionais de análise de proteína. Por exemplo, o seu elevado peso molecular evita a migração electroforética através de géis de poliacrilamida regulares e a sua natureza pegajosa promove a adesão a uma tubagem experimental. No entanto, a investigar o papel de mucinas na saúde(Por ex., Manter a integridade da mucosa) e doenças (por ex., Hiper-concentração, mucostasis, cancro) recentemente ganhou interesse e mucinas estão a ser investigados como um alvo terapêutico. Uma melhor compreensão da função e produção de mucina macromoléculas pode conduzir a novas abordagens farmacêuticas, por exemplo, inibidores da exocitose da mucina do grânulo e / ou agentes mucolíticos. Portanto, protocolos consistentes e confiáveis ​​para investigar a biologia mucina são fundamentais para o avanço científico. Aqui, descrevemos métodos convencionais para separar macromoléculas de mucina por electroforese usando um gel de agarose, a transferência de proteínas para uma membrana de nitrocelulose, e detectar o sinal com anticorpos específicos de mucina, bem como leitor de gel fluorescente no infravermelho. Estas técnicas estão amplamente aplicável para determinar a quantificação de mucina, a multimerização e para testar os efeitos dos compostos farmacológicos sobre mucinas.

Introdução

As mucinas são normalmente produzidos por superfícies mucosas que revestem as cavidades expostas ao ambiente exterior (por exemplo., Respiratório, digestivo, reprodutivo, extensões da superfície ocular), bem como os órgãos internos (por exemplo, pâncreas, vesícula biliar, glândulas mamárias). A presença destas glicoproteínas mantém a hidratação da superfície e forma uma barreira física contra os agentes patogénicos. Embora a produção de mucina é essencial para a saúde das mucosas, hiper-concentração de mucina e / ou as propriedades do muco aberrantes pode conduzir a obstrução do canal, a colonização bacteriana e inflamação crónica, o que pode causar danos irreversíveis. Uma cascata semelhante de eventos são observados em várias doenças, por exemplo., Fibrose cística ^1, otite média crônica ² e infecção ^cérvico-3. Portanto, é importante para entender o papel de mucinas na saúde e na doença e para estabelecer protocolos de rotina para a identificação de proteínas.

A data, 19 genes mucinas foram identificados e codificam para cadeias polipeptídicas grandes que variam de 1.200 (por exemplo., MUC-1) a 22.000 (por exemplo, MUC16) aminoácidos. A família de genes de mucina pode ser dividido em dois subtipos: as mucinas associadas a membranas, envolvidas na sinalização celular e a superfície de blindagem, e as mucinas de formação de gel, responsáveis ​​pelas propriedades viscoelásticas dos geles de muco. mucinas associadas a membranas são principalmente monomérico e atribuem às superfícies das células através de um domínio que atravessa a membrana hidrofóbica. Em contraste, as mucinas de formação de gel possui vários domínios -como e rica em cisteína do factor de von Willebrand (vWF), que são essenciais para a formação de redes poliméricas dinâmicas. Grandes glicanos estão ligados a serina e treonina distribuídos por todo o apomucin. Estes oligossacáridos ligados em O densas pode contribuir-se para 80% do peso molecular ^4. Intra- e inter-molecular de ligações dissulfureto que ligam os monómeros de mucina assegurar a integridade do gel de mucina network. Como resultado de glicosilação pesada e multimerização, mucinas encontram-se entre as moléculas maiores no mundo animal e não podem ser analisados ​​por electroforese em gel padrão através de gel de SDS-PAGE de poliacrilamida convencional e escadas de proteína padrão. Estes métodos / resolver proteínas separadas com pesos moleculares menores do que 250 kDa, enquanto os monómeros de mucina pode atingir até 2 MDa no caso de MUC16. No entanto, as escadas de proteína de alto peso molecular podem ser utilizados para estudar pequenas monómeros de mucina (isto é., A MUC1).

Uma variedade de técnicas pode ser aplicado para estudar tamanho mucina, conformação e interacção. Tradicionalmente, a caracterização bioquímica das mucinas é realizado por mucina isolamento através de centrifugação isopícnica em gradiente de densidade em tampão de desnaturação, seguida de cromatografia de exclusão de tamanho e imunodetecção (por ex., Slot blotting) ^5. e / ou dispersão de luz multi-ângulo dinâmico fornecer informações sobre o estado oligomérico de amostras ricas em mucina ^{1. Além disso, uma centrifugação zonal acoplado com imunodetecção e microscopia electrónica de transmissão são comumente usados ​​para determinar a conformação de macromoléculas de mucinas 6. A espectrometria de massa é também utilizado para quantificar as mucinas, detectar a clivagem proteolítica e analisar a composição 1,7,8 oligossacárido. Tais técnicas são dispendiosas, demoradas e frequentemente exigem grandes volumes e / ou altas concentrações de amostra. A metodologia aqui descrita, isto é., Mucina separação por electroforese, é reprodutível, de baixo custo e pode ser utilizado em estudos de alto rendimento para fornecer quantificação relativa e mucina investigar montagem polímero. No entanto, este ensaio necessita de alta afinidade, anticorpos de mucina de alta especificidade que pode não estar disponível para mucinas raras (ex., MUC19) ou certas espécies (por exemplo., Porco, furão).}

Western blotting de agarose é adequado para resolver uma grande variedade de amostras ricas em mucina com Concentrações que variam de 50 ug / ml (por exemplo., células de lavagens) a 5 mg / ml (por exemplo., expectoração). Este ensaio foi introduzida nos anos 1990 e só foi efectuado em alguns laboratórios especializados ^9,10. Inicialmente, esta técnica permitiu identificar subpopulações de monómeros de mucina nas secreções respiratórias humanas ^11,12 e confirmou o processo de oligomerização de células caliciformes, que consiste de formação de dímeros no retículo endoplasmático seguido por dímero de multimerização no aparelho de Golgi ^13. Mais recentemente, a geração de anticorpos policlonais contra mucinas murino facilitou os estudos em modelos animais pequenos (por exemplo., Mucina modelos de ratos deficientes, βENaC, OVA-desafiado) e abriu um novo campo de pesquisa para estudos pré-clínicos compostos de teste farmacológico destinadas a remover o muco os pulmões ^14-17. Como resultado de um crescente interesse em biologia mucina e a geração de novos, os anticorpos de mucina mais específicos, descrevemos herein a metodologia para separar mucinas por electroforese em gel de agarose, transferência para nitrocelulose e vácuo de duas cores detecção fluorescente no infravermelho.

Protocolo

1. Prepare tampões para mucina Gel Western Blotting

1. Prepare 1 litro de tampão 50x TAE (Tris-acetato-EDTA).
   1. Em 700 ml de água destilada _(dH2O) adicionar 242 g de Tris base (0,4 M), 57,1 g de ácido acético glacial (peso líquido) (0,2 M) e 14,61 g de ácido etilenodiaminotetracético (EDTA) (50 mM).
   2. Ajustar o pH para 8,0 e perfazer o volume a 1 litro com _dH2O
2. Preparar 10 ml de 10x tampão de carga.
   1. Prepare 5 ml de tampão 1 x TAE. Para fazer isso, adicionar 5 ml de glicerol (50%), 25 mg de azul de bromofenol (0,25%), e 100 mg de sulfato de dodecilo de sódio (SDS) (1%).
3. Prepare 2 litros de tampão 20x citrato de sódio solução salina (SSC).
   1. Em 1,5 litros de _dH2O, adicionar 350,6 g de NaCl (3 M) e 176,4 g de citrato trissódico (Na ₃ C ₆ H ₅ O ₇₎ (0,3 M). Ajustar o pH para 7,0 e levar o volume a 2 litros com dH ₂ O.
4. Prepare 1 litro de tampão 1 x TAE-SDS a 0,1%.
   1. Adicionar 20 ml de 50x TAE a 980 ml ​​de dH ₂ O. Adicionar 1 g de SDS para fazer uma solução de SDS-TAE a 0,1%.

2. TAE-SDS Agarose Gel de Preparação

1. (. Isto é, 150 ml) Pour volume suficiente de TAE 1X-SDS a 0,1% de tampão em um balão de Erlenmeyer de microondas para fazer uma 5 - gel de sete milímetros de espessura. Adicionar 0,8% (1,2 g) pó de agarose.
2. frasco de micro-ondas em intervalos de 30 seg com agitação intermitente, até estar completamente dissolvido de agarose (normalmente 1-3 minutos). Use almofadas de mão quentes durante este processo. Tenha cuidado com a fervura enquanto agita.
3. Permitir que a solução de agarose para esfriar por 5 - 10 min. Nota: A solução de agarose estará pronto para ser derramado quando fundo do balão pode ser deixado na palma da mão durante 5 seg.
4. Prepare a bandeja de fundição de electroforese (10 x 15 cm) por meio de selagem com as arestas da fita e colocando assim pentear em posição.
5. Pour solução de agarose lentamente em tele fundição bandeja para evitar a formação de bolhas. Remova as bolhas usando uma ponteira. Aguarde até que o gel para esfriar e completamente solidificar. Uma vez solidificado, remover o pente lentamente para evitar o colapso dos poços por sucção e remova a fita a partir das bordas do tabuleiro.
6. Coloque gel de agarose na caixa de gel e encher a unidade de electroforese com tampão% SDS 1x-0,1 TAE até que o gel é totalmente coberto.

3. Amostra de carga e Eletroforese Separação

Nota: Em nosso laboratório, nós geralmente usam amostras de mouse e os seres humanos, incluindo fluido de lavado broncoalveolar (LBA; ambas as espécies), lavagem de células a partir de células humanas epiteliais brônquicas (HBE), e amostras de saliva e escarro humanos. As amostras podem ser desnaturada em ureia 6 M no momento da recolha ou armazenada por curtos períodos de tempo (6 horas) por adição de cocktail inibidor de proteinase.

1. Preparar as amostras para carregar pela adição de 10% de corante de carregamento de cada amostra (isto é., 30 ul de amostra e trêsul de corante). Homogeneizar amostras pipetando cima e para baixo. Resumidamente girar tubos a 5000 rpm para recolher gotas.
2. carregar cuidadosamente igual volume de amostras nas cavidades.
   1. dicas pré-molhados e / ou utilizar pipetas de deslocamento positivo para facilitar o carregamento de amostras altamente viscosas. Lentamente aspirado de 80 - 90% de solução de amostra-corante (ou seja, 27-30 ul) para evitar bolhas de pipetagem.
   2. carregar lentamente no fundo dos poços e mover progressivamente a ponta da pipeta para cima. Para as amostras que permanecem ligados à ponta da pipeta, dispensar a um ângulo de 45 ° e alongar linear acima do poço ou suavemente usar o lado do poço para quebrar o muco viscoso. Não sobrecarregue os poços.
3. Ligar os eléctrodos a partir da caixa do gel para o gerador de energia electroforese. Assegurar que os eletrodos estão ligados correctamente (ie., Chumbo vermelho ligado à saída positiva do gerador) para permitir carregados negativamente mucinas a correr para o lado positivo eléctrodo.
4. Submeter o gel a 80 volts durante 90 min para um único gel de pente, ou 60-75 minutos para um gel de pente duplo para evitar sobreposição entre as duas linhas.
5. Desligue a alimentação do gerador e desconectar os eletrodos da fonte de alimentação.
6. remover cuidadosamente o gel a partir da caixa do gel com uma mão em cada lado da bandeja de vazamento para assegurar o gel permanece no lugar.

4. Reduzir Agarose Gel para Transferência de mucina Eficiente

1. Com cuidado, coloque o apartamento gel em um recipiente de vidro. Lavar o gel com _dH2O para remover vestígios de tampão TAE-SDS.
2. Prepare 1 litro de tampão SSC 4x por adição de 200 ml de 20x SSC em 800 ml de dH ₂ O. Adicione 200 ml de 10 mM de ditiotreitol (DTT) 4x SSC solução por adição de 309 mg de DTT fresco em 200 ml de tampão SSC 4x.
3. Mergulhe o gel com tampão e cobertura TDT-4x SSC. Agite suavemente durante 20 minutos (10 rotações por minuto). Lavar o gel com tampão de 4x SSC TDT-free.

"> 5. Vácuo Assembleia Blotter e Transferência de exemplo a um Nitrocellulose Membrane

1. Prepare mata-borrão de vácuo para a transferência.
   1. Cuidadosamente corte membrana de nitrocelulose em dimensões ligeiramente maior do que o gel (ie., 10 x 15 cm).
   2. Esteira porosa molhado com _dH2O e colocá-lo liso-lado-up no mata-borrão.
   3. membrana de nitrocelulose molhado com tampão SSC 4x DTT-livre e colocá-lo no centro do tapete poroso.
   4. Cubra a esteira porosa com a junta de borracha, deixando a abertura da junta precisamente alinhada com a membrana de nitrocelulose. Se esteira porosa é ainda visível, ajuste cuidadosamente a membrana para garantir que não haja lacuna permanece entre a junta e membrana.
2. Coloque cuidadosamente o gel de agarose na parte superior da membrana. Certifique-se de formas de gel de uma vedação estanque com a junta e os poços do gel estão posicionados sobre a membrana de transferência.
   1. Evitar a formação de bolhas entre a membrana e o gel. Para minimizar oformação de bolhas, esguiche algumas gotas de 4x SSC tampão sobre a membrana e o gel deslizar de cima para baixo para lavar quaisquer bolhas formadas. Evitar mover o gel na membrana como proteínas começarão a blot imediatamente.
3. cobrir cuidadosamente o gel com tampão de 4x SSC.
4. Comece a transferência de mucina por sucção.
   1. Vire mata-borrão de vácuo ON e pressão fixado em 40 - 50 mbar. Adicionar algumas gotas de tampão SSC 4x no gel a cada 5-10 minutos para evitar que o gel seque. transferência de correr por 90 min. Opcional: Após a conclusão, marque os poços com um lápis para orientação.
5. Elimine o gel e recuperar membrana de nitrocelulose usando uma pinça de plástico na extremidade da membrana.

6. O bloqueio da membrana e Detecção

1. Lavar membrana imediatamente com solução salina tamponada 1x com fosfato (PBS). Não deixe que a membrana secar.
2. Imergir a membrana em 50 mL de 3% de leite-PBS, tampão e o local de bloqueio numa rocker à temperatura ambiente durante 1 h. Após a incubação, descartar o tampão de bloqueio.
3. Mergulhe membrana na solução de anticorpo primário 1% de leite-PBS. Incubar a membrana na solução de anticorpo primário durante a noite num agitador rotativo a 4 ° C. Após a incubação, descartar a solução de anticorpo primário. Dilui-se os anticorpos primários para uma proporção de 1: 2000 de uma solução de anticorpo de tampão de bloqueio. Nota: Para as amostras provenientes de ratinhos, usamos UNC 222 de coelho anti-MUC5B e de cabra anti-Proteína Fluorescente Verde (GFP). Para amostras provenientes de seres humanos, usamos anticorpos primários H300 anti-MUC5B e 45M1 anti-MUC5AC.
4. membrana Lavar 3 vezes com PBS durante 10 min num agitador rotativo.
5. Imergir membrana em solução de anticorpo secundário 1% de leite-PBS. Dilui-se a anticorpos secundários para uma proporção de 1: 7500 de solução de anticorpo para tampão de bloqueamento e incubar à temperatura ambiente durante 1 hora num agitador rotativo (por exemplo, 700 anti-coelho e anti-cabra 680.). Proteger da luz através da incubação de uma co não transparententainer. Descartar a solução de anticorpo secundário após 1 h.
6. membrana Lavar 3 vezes com PBS durante 5 min. Enxágüe membrana com _dH2O para remover o sal.
7. Leia a membrana de um sistema de fluorescência de infravermelhos de acordo com as instruções do fabricante.

Resultados

Nós mostramos resultados representativos de expressão de mucina a seguir a electroforese em gel de agarose na LBA dos pulmões de ratinhos (Figura 1). Neste exemplo, utilizou-se o gel de agarose a mostrar sobre-regulação de produção de mucina na sequência de IL-13 de tratamento do modelo de ratinho Tg-MUC5AC. O Western blot mostra uma representação visual de expressão de mucina, o qual pode ser usado para a análise quantitativa de multímero ou intensidade de ...

Discussão

O protocolo de mucina transferência de Western descrito neste vídeo combina técnicas convencionais utilizados em biologia molecular para separar e transferir grandes macromoléculas, tais como ADN, com técnicas normais para a detecção da proteína, isto é., Imunotransferência. A mesma técnica pode ser aplicada para estudar a biologia dos glicosaminoglicanos complexas, tais como a desagregação de alta peso molecular do ácido hialurónico ^18. Embora esta técnica poderia ser utilizada numa ...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Tris Base	Sigma	T6060-1kg	1 kg
Glacial Acetic Acid	Sigma	ARK2183-1L	1 L
EDTA	Sigma	EDS-100g	100 g
Glycerol	Fisher	BP229-1	1 L
Bromophenol Blue	Sigma	114391-5g	5 g
SDS (Sodium Dodecyl Sulfate)	Sigma	L6026-50g	50 g
20x SSC (Sodium Saline Citrate) Buffer	Promega	V4261	1 L
NaCl	Fisher	S271-1	1 kg
Trisodium Citrate (Na3C6H5O7)	Sigma	W302600-1kg	1 kg
10 mM DTT (dithiothreitol)	Sigma	D0632	25 g
Milk Powder	Saco		Instant non-fat dry milk
Dulbecco Phosphate Buffered Saline (D-PBS)	Gibco lifetechnologies	14200-025	500 ml
Anti-GFP Goat Primary Antibody (mouse samples)	Rockland antibodies and assays	600-101-215	1 mg
UNC 222 Anti-Muc5b Rabbit Primary Antibody (mouse samples)	UNC
H300 Anti-MUC5B Primary Antibodies (human samples)	Santa Cruz	sc-20119	200 μg
45M1 Anti-MUC5AC Primary Antibodies (human samples)	Abcam	ab3649	100 μg
Donkey Anti-rabbit 800CW IR Dye	LI-COR Biosciences	926-32213	0.5 mg
Donkey Anti-mouse 680LT IR Dye	LI-COR Biosciences	926-68022	0.5 mg
Electrophoresis Gel Box and Casting Tray	Owl Seperation Systems
Power Supply Box	Biorad	Model 200/20
Membrane Blotting Paper	Amersham	10600016
Whatman Paper and Nitrocellulose membrane	GE	10 439 196
Boekel/Appligene Vacuum Blotter 230 v	Expotech USA	230600-2
Odyssey Infrared Fluorescence System	LI-COR Biosciences