Муцин Электрофорез в агарозном геле: Вестерн блот для высокой молекулярной массой гликопротеинов

Резюме

Mucins are high-molecular-weight glycoconjugates, with size ranging from 0.2 to 200 megadalton (MDa). As a result of their size, mucins do not penetrate conventional polyacrylamide gels and require larger pores for separation. We provide a detailed protocol for mucin agarose gel electrophoresis to assess relative quantification and study polymer assembly.

Аннотация

Муцины, что сильно гликозилированные белки, выстилающих поверхности слизистой оболочки, эволюционировали в качестве ключевого компонента врожденной защиты, защищая эпителий от вторжения патогенов. Основная роль этих макромолекул, чтобы облегчить улавливание частиц и зазор, продвигая смазывание слизистой оболочки. В процессе синтеза белков, муцинов претерпевают интенсивную О-гликозилирование и мультимеризацию, что значительно увеличивают массу и размер этих молекул. Эти посттрансляционные модификации являются критически важными для вязкоупругих свойств слизи. В результате сложного биохимического и биофизической природы этих молекул, работая с муцин обеспечивает множество проблем, которые не могут быть преодолены с помощью традиционных методов анализа белков. Например, их высокой молекулярной массы предотвращает электрофоретической миграции через регулярные полиакриламидном геле и их липкая природа вызывает адгезию к экспериментальному НКТ. Однако, исследуя роль муцинах в области здравоохранения(Например., Поддержание целостности слизистых оболочек) и болезни (например., Hyperconcentration, mucostasis, рак) в последнее время приобрел интерес и муцинов исследуются в качестве терапевтической мишени. Лучшее понимание производства и функции макромолекул муцин может привести к новым фармацевтическим подходам, например, ингибиторы муцина экзоцитоза гранул и / или муколитических агентов. Таким образом, последовательные и надежные протоколы для исследования муцин биологии имеют решающее значение для научного прогресса. Здесь мы описываем обычные методы для разделения муцин макромолекул электрофореза в агарозном геле, белка-переносчика в нитроцеллюлозную мембрану, и детектировать сигнал с муцин-специфических антител, а также инфракрасный считыватель флуоресцентный гель. Эти методы широко применяются для определения муцина, мультимеризацию количественный и испытать влияние фармакологических соединений на муцин.

Введение

Муцины обычно получают поверхности слизистых оболочек, выстилающих полости подвергаются воздействию внешней среды (например., Органов дыхания, пищеварения, репродуктивная, поверхности глазного яблока), а также внутренних органов (например, поджелудочной железы, желчного пузыря, молочных желез). Присутствие этих гликопротеинов поддерживает гидратации поверхности и образует физический барьер против патогенов. Несмотря на то, муцин производства имеет важное значение для здоровья слизистых оболочек, муцина hyperconcentration и / или отклоняющиеся свойства слизи может привести к непроходимости протоков, бактериальной колонизации и хроническое воспаление, которое может привести к повреждению тканей необратимым. Подобный каскад событий , наблюдаются при некоторых заболеваниях, например., Муковисцидоз ^1, хронический средний отит ² и цервиковагинальными инфекции ^3. Поэтому важно понять роль муцинах в отношении здоровья и болезни и установить обычные протоколы для идентификации белков.

Встретиться, 19 генов муцины были идентифицированы и кодируют для крупных полипептидных цепей в диапазоне от 1200 (например., MUC1) до 22000 (например, MUC16) аминокислоты. Муцина семейство генов можно разделить на два подтипа: мембрана-ассоциированной муцинов, участвующих в клеточной сигнализации и защиты поверхности, а также гелеобразующих муцинов, отвечает за вязкоупругих свойств слизи гелей. Ассоциированных с мембранами муцинов в основном мономерный и прикрепляются к поверхности клеток посредством гидрофобного трансмембранный домен. В противоположность этому, гелеобразующих муцинов обладают несколькими фактора фон Виллебранда (ФВ) -как и богатых цистеином домены, которые имеют важное значение для формирования динамических полимерных сетей. Большие гликаны прикреплены к серина и треонина, распределенных по всему apomucin. Эти плотные О-связанных олигосахаридов , может достигать до 80% от молекулярной массы ^4. Внутри- и межмолекулярные дисульфидные связи, соединяющие муцин мономеры обеспечивают целостность муцин геля Networк. В результате тяжелой гликозилирования и мультимеризацию, муцинов являются одними из крупнейших молекул в животном мире и не могут быть проанализированы с помощью стандартного гель-электрофореза с использованием обычного геля ДСН-ПААГ-электрофорез в полиакриламидном и стандартные белковые лестницы. Эти методы решения / отдельные белки с молекулярными массами ниже 250 кДа, в то время как муцин мономеры могут доходить до 2 МДА в случае MUC16. Тем не менее, с высокой молекулярной массе белка лестницы могут быть использованы для изучения малых мономеров муцина (т.е.., MUC1).

Различные методы могут быть применены для изучения муцин размер, конформации и взаимодействия. Традиционно, получение биохимических характеристик муцинов осуществляется путем муцина развязки через изопикнического градиенте плотности центрифугирования в денатурирующем буфере, а затем гель- фильтрационной хроматографии и эксклюзионной иммунологического (например., Слот - блоттинга) ^5. Динамические и / или рассеяния света многоугольных предоставляют информацию о олигомерного состояния муцина богатых образцов ^{1. Кроме того, скорость-зональному центрифугированию в сочетании с иммунологического и просвечивающей электронной микроскопии, как правило , используются для определения макромолекулярную конформацию муцинами 6. Масс - спектрометрия также используется для количественного определения муцины, обнаружения протеолитического расщепления и анализа олигосахаридов состава 1,7,8. Такие методы требуют больших затрат, отнимает много времени и часто требуют больших объемов и / или высокие концентрации образца. Методика описана в данном документе, то есть., Муцин разделение с помощью электрофореза, воспроизводима, низкая стоимость и может быть использовано в исследованиях с высокой пропускной способностью, чтобы обеспечить относительную муцина и количественного изучения полимера в сборе. Тем не менее, этот анализ требует высокого сродства, высокой специфичности муцина антитела , которые не могут быть доступны для редких муцинах (например., MUC19) или некоторые виды (например., Свинья, хорек).}

Агарозном вестерн-блоттинга подходит для решения широкого спектра муцин богатых образцов с Concentraции в диапазоне от 50 мкг / мл (например., Cell оврагам) до 5 мг / мл (например., мокрота). Этот анализ был введен в 1990 - е годы и была проведена лишь в нескольких специализированных лабораториях ^9,10. Изначально этот метод позволил выявить субпопуляции мономеров муцина в дыхательных путей человека ^11,12 и подтвердили процесса олигомеризации в бокаловидных клеток, которая состоит из димеров в эндоплазматической сети с последующим димера мультимеризацию в аппарате ¹³ Гольджи. Совсем недавно, поколение поликлональных антител против мышиных муцинах способствовали исследования на небольших животных моделях (например., Муцин несовершенные, βENaC, OVA-оспариваемые модели мыши) и открыли новую область исследований для проведения доклинических исследований тестирования фармакологических препаратов , направленных на удаление слизи из легкие ^{14-17 лет.} В результате растущего интереса к биологии муцина и поколение романа, более специфические антитела муцин, мы опишем hereiп методология для разделения муцины с помощью электрофореза в агарозном геле, передачи вакуума к нитроцеллюлозы и двухцветной обнаружения инфракрасного флуоресцентного.

протокол

1. Подготовка буфера для муцин гель Вестерн-блоттинга

1. Готовят 1 литр 50x TAE (Трис-ацетат-ЭДТА) буфере.
   1. В 700 мл дистиллированной воды (дН ₂ O) добавляют 242 г трис - основания (0,4 м), 57,1 г ледяной уксусной кислоты (взвешивать жидкость) (0,2 М) и 14,61 г этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА) (50 мМ).
   2. Отрегулируйте рН до 8,0 и сделать объем до 1 л с дН ₂ O.
2. Приготовьте 10 мл 10-кратного буфера для загрузки.
   1. Приготовьте 5 мл буфера 1х ТАЕ. Для этого добавляют 5 мл глицерина (50%), 25 мг бромофенолового синего (0,25%), и 100 мг додецилсульфата натрия (SDS) (1%).
3. Подготовьте 2 литра буфера 20x натрия физиологический раствор цитрата (SSC).
   1. В 1,5 л дН ₂ O, добавляют 350,6 г NaCl (3 М) и 176,4 г тринатрийцитрата (Na ₃ C ₆ H ₅ O ₇₎ (0,3 М). Отрегулируйте рН до 7,0 и составляют объем до 2 л с дН ₂ O.
4. Готовят 1 л буфера 1 x TAE-0,1% SDS.
   1. Добавьте 20 мл 50x TAE до 980 мл дН ₂ O. Добавляют 1 г SDS, чтобы сделать 0,1% раствора SDS-ТАЕ.

2. TAE-SDS агарозном геле Подготовка

1. (Т. Е, 150 мл) Налейте достаточный объем 1x TAE-0,1% SDS буфера в Microwavable коническую колбу , чтобы сделать 5 - мм толщиной гель 7. Добавить 0,8% (1,2 г) в агарозном порошка.
2. Микроволновая колбу в 30-секундными интервалами с прерывистым закрученной до агарозном полностью не растворится (обычно 1 - 3 мин). Используйте горячие подушечки для рук во время этого процесса. Будьте осторожны с кипению в то время как закрученной.
3. Дайте агарозу раствор остыть в течение 5 - 10 мин. Примечание: Решение агарозы будет готов заливать, когда дно колбы можно оставить на ладони в течение 5 сек.
4. Подготовить электрофорез литья лоток (10 х 15 см), запечатывая края с лентой и размещения хорошо расчесать в положении.
5. Налейте раствор агарозы медленно в тон литье лоток, чтобы избежать образования пузырьков. Удалите пузырьки с помощью пипетки. Подождите, пока гель для охлаждения и полностью затвердевает. После затвердевания удалить гребень медленно, чтобы избежать разрушения скважин с помощью отсоса и удалите ленту с краев лотка.
6. Поместите агарозный гель в коробку геля и заполнить блок электрофорез с 1x TAE-буфера 0,1% SDS, пока гель не будет полностью покрыта.

3. Образец Загрузка и электрофорез Разделение

Примечание: В нашей лаборатории, мы обычно используем образцы от мыши, так и человека, в том числе БАЛ (БАЛ, оба вида), клеточные стирок из бронхиальных эпителиальных клеток человека (HBE) и слюне и мокроте образцов человека. Образцы могут быть денатурированный в 6 М мочевине при сборе или хранить в течение коротких периодов времени (6 ч) путем добавления ингибитора протеиназы коктейль.

1. Приготовьте образцы для загрузки путем добавления 10% красителем для каждого образца (то есть., 30 мкл образца и 3мкл красителя). Однородный образцы с помощью пипетки вверх и вниз. Кратко спином вниз трубы при 5000 оборотов в минуту для сбора капель.
2. Тщательно загрузить равный объем образцов в лунки.
   1. Предварительно влажные советы и / или использовать положительные пипеток смещения, чтобы облегчить загрузку высоковязких образцов. Медленно аспирата 80 - 90% раствора образца красителя (т.е. 27 - 30 мкл) , чтобы избежать пузырей пипетирования.
   2. Медленно загрузки в нижней части лунки и постепенно переместить вверх кончик пипетки. Для образцов, которые остаются прикрепленными к кончику пипетки, обойтись под углом 45 ° и вытянутые прямо над колодцем или осторожно использовать сторону колодца, чтобы разорвать тягучий слизь. Не перегружайте скважин.
3. Подключите электроды из коробки гель-электрофорез генератора мощности. Убедитесь , что электроды подключены правильно (то есть., Красный провод подключен к положительному выходу генератора) , чтобы отрицательно заряженные муцины бежать к положительным электрод.
4. Выполнить гель при 80В в течение 90 мин для одного геля расческой, или 60 - 75 мин в течение двойного геля гребенки для предотвращения перекрытия между двумя рядами.
5. Включите генератор питание и отсоедините электроды от источника питания.
6. Осторожно удалите гель из коробки гель с одной стороны, по обе стороны лотка для литья, чтобы обеспечить гель остается на месте.

4. Уменьшить агарозном геле для эффективного муцин Transfer

1. Аккуратно положите плоскую гель в стеклянной таре. Промыть гель с дН ₂ O , чтобы удалить следы буфера ТАЕ-SDS.
2. Приготовьте 1 литр буфера 4x SSC путем добавления 200 мл 20x SSC в 800 мл дН ₂ O. Сделать 200 мл 10 мМ дитиотреитола (DTT) 4x SSC раствора добавлением 309 мг свежего DTT в 200 мл буфера 4x SSC.
3. Замочить гель с DTT-4x SSC буфером и крышкой. Осторожно покачайте в течение 20 мин (10 оборотов в минуту). Промойте гель с DTT-свободным буфером 4x SSC.

"> 5. Вакуумные Промокашка Ассамблеи и образца переноса на нитроцеллюлозную мембрану

1. Подготовить вакуумный папье для передачи.
   1. Аккуратно вырежьте нитроцеллюлозную мембрану на размеры немного шире , чем гель (то есть., 10 х 15 см).
   2. Влажные пористый мат с дН ₂ O и поместите его гладкой стороной вверх в промокашки.
   3. Мокрый нитроцеллюлозную мембрану с ДТТ свободной 4x SSC буфера и поместить его в центре пористого мата.
   4. Накройте пористый мат с резиновой прокладкой, в результате чего отверстие прокладки точно совмещенным с нитроцеллюлозной мембраной. Если пористый мат еще виден, тщательно отрегулировать мембрану для обеспечения нет зазора остается между прокладкой и мембраной.
2. Осторожно поместите агарозу на верхней стороне мембраны. Обеспечить гель образует герметичное уплотнение с прокладкой и лунки геля расположены на мембране для переноса.
   1. Во избежание образования пузырьков между мембраной и гелем. Для того, чтобы минимизироватьобразование пузырей, впрыснуть несколько капель 4x SSC буфера на мембране и сдвиньте гель сверху вниз, чтобы смыть любые образовавшиеся пузырьки. Избегайте перемещения геля на мембране, как белки начнут немедленно промокните.
3. Осторожно закрывают гель с буфером 4x SSC.
4. Начните муцин передачу путем всасывания.
   1. Включите вакуумный папье и установите давление на 40 - 50 мбар. Добавьте несколько капель буфера 4x SSC на геле каждые 5 - 10 минут, чтобы предотвратить гель от высыхания. Запуск передачи в течение 90 мин. Дополнительно: После завершения, отметьте лунки карандашом для ориентации.
5. Утилизацию геля и извлечения нитроцеллюлозную мембрану с использованием пластиковых пинцет на краю мембраны.

6. Мембрана блокировка и обнаружение

1. Промыть мембрану сразу с 1x фосфатно-буферном солевом растворе (PBS). Не позволяйте мембраны высохнуть.
2. Погрузите мембрану в 50 мл 3% -ного молока-PBS блокирующего буфера и место на роcker при комнатной температуре в течение 1 часа. После инкубации, удалите блокирующий буфер.
3. Погрузите мембрану в 1% растворе первичного антитела молока PBS. Инкубируйте мембраны в растворе первичного антитела в течение ночи на качалке при температуре 4 ° С. После инкубации, вылейте раствор первичного антитела. Развести первичных антител к соотношении 1: 2000 раствора антител в блокирующий буфер. Примечание: Для получения образцов, происходящих из мышей, мы используем UNC 222 кролика против Muc5b и козы против зеленого флуоресцентного белка (GFP). Для образцов, поступающих от людей, мы используем H300 анти-MUC5B и 45M1 анти-MUC5AC первичных антител.
4. Промыть мембрана 3 раза PBS в течение 10 мин на качалку.
5. Погрузите мембрану в 1% растворе вторичного антитела молочно-PBS. Разведите вторичные антитела к соотношении 1: 7500 раствора антител к блокирующим буфером и инкубируют при комнатной температуре в течение 1 ч на качалку (например, 700 анти-кролик и 680 анти-козел.). Защита от света путем инкубирования в непрозрачном сотрудничествеntainer. Отменить решение вторичного антитела после 1 часа.
6. Промыть мембрана 3 раза PBS в течение 5 мин. Промойте мембрану с дН ₂ O , чтобы удалить соль.
7. Прочитайте мембрану на инфракрасной системе флуоресценции в соответствии с инструкциями изготовителя.

Результаты

Мы показываем репрезентативные результаты муцина экспрессии после электрофореза в агарозном геле в БАЛ из легких мышей (рисунок 1). В этом примере мы использовали агарозный гель, чтобы показать положительную регуляцию муцина производства следующих IL-13 обраб...

Обсуждение

Протокол муцина Вестерн - блоттинга , описанного в этом видео сочетает в себе традиционные методы , используемые в молекулярной биологии для разделения и передачи больших макромолекулы, такие как ДНК, с регулярными методами для обнаружения белка, то есть., Иммуноблоттинга. Тот же м?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Tris Base	Sigma	T6060-1kg	1kg
Glacial Acetic Acid	Sigma	ARK2183-1L	1L
EDTA	Sigma	EDS-100g	100g
Glycerol	Fisher	BP229-1	1L
Bromophenol Blue	Sigma	114391-5g	5g
SDS (Sodium Dodecyl Sulfate)	Sigma	L6026-50g	50g
20X SSC (Sodium Saline Citrate) Buffer	Promega	V4261	1L
NaCl	Fisher	S271-1	1kg
Trisodium Citrate (Na3C6H5O7)	Sigma	W302600-1kg	1kg
10 mM DTT (dithiothreitol)	Sigma	D0632	25g
Milk Powder	Saco		Instant non-fat dry milk
Dulbecco Phosphate Buffered Saline (D-PBS)	Gibco lifetechnologies	14200-025	500mL
Anti-GFP Goat Primary Antibody (mouse samples)	Rockland antibodies and assays	600-101-215	1 mg
UNC 222 Anti-Muc5b Rabbit Primary Antibody (mouse samples)	UNC
H300 Anti-MUC5B Primary Antibodies (human samples)	Santa Cruz	sc-20119	200ug
45M1 Anti-MUC5AC Primary Antibodies (human samples)	Abcam	ab3649	100ug
Donkey Anti-rabbit 800CW IR Dye	LI-COR Biosciences	926-32213	0.5mg
Donkey Anti-mouse 680LT IR Dye	LI-COR Biosciences	926-68022	0.5mg
Electrophoresis Gel Box and Casting Tray	Owl Seperation Systems
Power Supply Box	Biorad	Model 200/20
Membrane Blotting Paper	Amersham	10600016
Whatman Paper and Nitrocellulose membrane	GE	10 439 196
Boekel/Appligene Vacuum Blotter 230v	Expotech USA	230600-2
Odyssey Infrared Fluorescence System	LI-COR Biosciences