Mucin Agarose ג'ל אלקטרופורזה: מערבי סופג עבור גליקופרוטאינים גבוה בעל משקל מולקולרי

Summary

Mucins are high-molecular-weight glycoconjugates, with size ranging from 0.2 to 200 megadalton (MDa). As a result of their size, mucins do not penetrate conventional polyacrylamide gels and require larger pores for separation. We provide a detailed protocol for mucin agarose gel electrophoresis to assess relative quantification and study polymer assembly.

Abstract

מוקיוס, החלבונים הריריים משטחים ריריים-glycosylated בכבדות, התפתחו כמרכיב מרכזי של הגנה מולדת ידי גינה האפיתל נגד פתוגנים פולשים. תפקידה המרכזי של מולקולות אלו הוא להקל השמנת חלקיקים ופינוי תוך קידום שימון של הרירית. במהלך סינתזת החלבון, מוקיוס לעבור O-glycosylation ו multimerization אינטנסיבי, אשר להגדיל באופן משמעותי את מסת וגודל המולקולות האלה. שלאחר translational שינויים אלה הם קריטיים עבור מאפייני viscoelastic של ריר. כתוצאת האופי ביוכימיות biophysical המורכבת של מולקולות אלה, עובדים עם מוקיוס מספק אתגרים רבים כי לא ניתן להתגבר על ידי שיטות ניתוח חלבון קונבנציונליות. למשל, גבוה בעל המשקל המולקולרי שלהם מונע גירת electrophoretic באמצעות ג'ל polyacrylamide הקבוע והטבע הדביק שלהם גורם הידבקות צינורות הניסיונות. עם זאת, חוקרים את התפקיד של מוקיוס בבריאות(למשל., שמירה על שלמות רירית) ומחלות (למשל., Hyperconcentration, mucostasis, הסרטן) צבר לאחרונה עניין מוקיוס נחקרים כיעד טיפולי. הבנה טובה יותר של הייצור והתפקוד של מקרומולקולות mucin עלולה להוביל לגישות פרמקולוגיות רומן, למשל, מעכבי exocytosis גרגיר mucin ו / או סוכני mucolytic. לכן, פרוטוקולים עקבי ואמין לחקור ביולוגיה mucin הן קריטיות בהתקדמות המדע. כאן אנו מתארים שיטות קונבנציונליות להפריד מקרומולקולות mucin ידי אלקטרופורזה באמצעות ג'ל agarose, להעביר החלבון לתוך קרום nitrocellulose, וכדי לזהות אותות עם נוגדנים ספציפיים mucin וכן הקורא ג'ל ניאון אינפרא אדום. טכניקות אלה חלות נרחבים כדי לקבוע quantitation mucin, multimerization וכדי לבדוק את ההשפעות של תרכובות תרופתיות על מוקיוס.

Introduction

מוקיוס מיוצר בדרך כלל על ידי משטחים ריריים המרפדים חללים חשופים לסביבה החיצונית (למשל., נשימה, עיכול, קטעי רבייה, משטח עין), כמו גם איברים פנימיים (למשל, לבלב, כיס מרה, בלוטות חלב). הנוכחות של גליקופרוטאינים אלה שומר הידרציה שטח מהווה מכשול פיזי מפני פתוגנים. למרות הייצור mucin חיוני הרירית בריאות, mucin hyperconcentration ו / או נכסים ריר סוטה יכול להוביל הפרעות בצינור, קולוניזציה חיידקית ודלקת כרונית, אשר יכול לגרום נזק לרקמות בלתי הפיך. מפל דומה של אירועים הם נצפו במחלות כמה, למשל., סיסטיק פיברוזיס ^1, דלקת אוזן תיכונה כרונית ² ו הצרויקו זיהום ^3. לכן, חשוב להבין את התפקיד של מוקיוס בבריאות ובחולי ולהקים פרוטוקולים שיגרתי לזיהוי חלבונים.

עד כה19 גני מוקיוס, זוהו לקודד עבור רשתות פוליפפטיד גדולות החל מ- 1,200 (למשל., MUC1) 22,000 (למשל, MUC16) חומצות אמינו. משפחת גנים mucin ניתן לחלק לשתי תת: את מוקיוס קרום הקשורים, מעורב מיגון איתות פני התא, ואת מוקיוס יוצרי ג'ל, אחראי המאפיינים viscoelastic של ג'לים ריר. מוקיוס קרום הקשורים ברובם monomeric ולצרף אל משטחי תא באמצעות תחום קרום פורש הידרופובי. לעומת זאת, מוקיוס יוצרי ג'ל להחזיק מספר גורם פון Willebrand (vWF)-כמו ציסטאין עשיר תחומים חיוניים להיווצרות רשתות פולימריות דינמית. גליקנים גדולים המחוברים סרין ושאריות תראונין מופצים ברחבי apomucin. אוליגוסכרידים O צמודים הצפופים אלה יכולים לתרום עד 80% של המשקל המולקולרי ^4. תוך אג"ח דיסולפיד הבין-מולקולרי חיבור מונומרים mucin להבטיח את תקינותו של רשתות ג'ל mucink. כתוצאה glycosylation ו multimerization כבד, מוקיוס הם בין המולקולות הגדולות בעולם החי ולא יכול להיות מנותח על ידי ג'ל אלקטרופורזה רגיל באמצעות ג'ל polyacrylamide SDS-PAGE קונבנציונאלי וסולמות חלבון סטנדרטי. שיטות אלה נפתרות / חלבונים נפרדים עם משקל מולקולרי נמוך מ -250 kDa בעוד מונומרים mucin יכולים להגיע עד 2 מד"א במקרה של MUC16. עם זאת, סולמות חלבון גבוה משקל מולקולרי יכולים לשמש כדי לחקור מונומרים mucin קטנים (כלומר., MUC1).

מגוון של טכניקות ניתן ליישם ללמוד גודל mucin, קונפורמציה ואינטראקציה. באופן מסורתי, אפיון ביוכימי של מוקיוס מושגת על ידי mucin בידוד באמצעות צנטריפוגה צפיפות שיפוע isopycnic חיץ denaturing, ואחריו כרומטוגרפיה בגודל הדרה ו immunodetection (למשל., סופג חריץ) ^5. דינמי ו / או פיזור אור רב-זווית לספק מידע על מצב oligomeric של דגימות mucin עשירי ^{1. בנוסף, צנטריפוגה אזורי-שיעור בשילוב עם immunodetection מיקרוסקופית אלקטרונים חודרת משמשים בדרך כלל כדי לקבוע את הקונפורמציה macromolecular של מוקיוס 6. ספקטרומטריית מסה משמשת גם לכמת מוקיוס, לזהות מחשוף פרוטאוליטים ולנתח 1,7,8 רכב oligosaccharide. שיטות אלו הן יקרות, זמן רב ולעתים קרובות דורשים כמויות גדולות ו / או ריכוזים גבוהים של מדגם. המתודולוגיה המתוארת במסמך זה, כלומר., Mucin הפרדה על ידי אלקטרופורזה, ניתנת לשחזור, בעלות נמוכה והוא יכול לשמש במחקרי תפוקה גבוהה כדי לספק quantitation mucin ביחס ולחקור הרכבת פולימרים. עם זאת, assay זה דורש נוגדנים גבוהה זיקה גבוהה סגולי mucin כי לא יהיו זמין עבור מוקיוס נדיר (למשל., MUC19) או מינים מסוימים (לדוגמא., חזיר, חמוס).}

המערבי סופג Agarose מתאים לפתרון מגוון רחב של דוגמאות עשיר mucin עם Concentraהמשא הנעים בין 50 מיקרוגרם / מ"ל (למשל., שטיפות התא) עד 5 מ"ג / מ"ל (למשל., ליחה). Assay זה הוצג בשנת 1990 בוצע רק כמה מעבדות מיוחדות ^9,10. בתחילה, טכניקה זו סייעה לזהות תת-אוכלוסיות של מונומרים mucin בהפרשות אדם הנשימה ^11,12 ואישר את תהליך oligomerization בתאים הגביע, אשר מורכב של היווצרות dimer ב reticulum endoplasmic ואחריו דימר multimerization במנגנון Golgi ^13. לאחרונה, הדור של נוגדנים polyclonal נגד מוקיוס murine הקל מחקרים על במודלים של בעלי חיים קטנים (למשל., Mucin לקוי, βENaC, במודלים של עכברים OVA מאותגרי) ופתח תחום חדש של מחקר מחקרים פרה תרכובות תרופתי בדיקות שמטרתן הסרת ריר מ הריאות ^14-17. כתוצאה עניין גובר mucin ביולוגיה הדור של הרומן, נוגדנים mucin ספציפי יותר, אנו מתארים herein המתודולוגיה להפריד מוקיוס ידי ג'ל אלקטרופורזה agarose, ואקום העברת nitrocellulose וזיהוי פלורסנט אינפרא אדום בשני צבעים.

Protocol

1. הכינו חוצצים עבור סופג mucin ג'ל המערבי

1. כן 1 ליטר של 50x טה (טריס-תצטט-EDTA) חיץ.
   1. בשנת 700 מ"ל של מים מזוקקים (O DH ₂₎ להוסיף 242 גרם של בסיס טריס (0.4 M), 57.1 גרם של חומצה אצטית קרחונית (שוקל נוזלי) (0.2 M) ו 14.61 גרם של חומצה ethylenediaminetetraacetic (EDTA) (50 מ"מ).
   2. התאם ל- pH 8.0 ולעשות את נפח עד 1 ליטר עם DH ₂ O.
2. הכן 10 מ"ל של חיץ טעינת 10x.
   1. הכן 5 מ"ל של חיץ 1x טה. לשם כך, להוסיף 5 מ"ל של גליצרול (50%), 25 מ"ג של כחול bromophenol (0.25%), ו -100 מ"ג של סולפט dodecyl נתרן (SDS) (1%).
3. כן 2 ליטר ציטראט מלוח 20x נתרן (SSC) החיץ.
   1. ב 1.5 ליטר של DH ₂ O, להוסיף 350.6 גרם של NaCl (3 M) ו 176.4 גרם של ציטראט Trisodium (Na ₃ C ₆ H ₅ O ₇₎ (0.3 M). התאם ל- pH 7.0 ולעשות את הווליום עד 2 ליטר עם DH ₂ O.
4. כן 1 ליטר של חיץ 1x טה-0.1% SDS.
   1. הוסף 20 מ"ל של 50x TAE כדי 980 מ"ל של DH ₂ O. הוסף 1 גרם של SDS לבצע פתרון 0.1% SDS-טה.

2. טה-SDS Agarose ג'ל הכנה

1. (. כלומר, 150 מ"ל) יוצקים נפח מספיק של חיץ 1x טה-0.1% SDS בבקבוק Erlenmeyer במיקרוגל לבצע 5 - ג'ל 7 מ"מ בעובי. להוסיף 0.8% (1.2 גרם) אבקת agarose.
2. בקבוק המיקרוגל ב 30 מרווחי שניות עם מתערבל לסירוגין עד agarose נמס לגמרי (בדרך כלל 1 - 3 דקות). השתמש כריות יד חמות במהלך תהליך זה. היזהר של רתיחה המתפרץ בעוד מתערבל.
3. אפשר פתרון agarose להתקרר למשך 5 - 10 דקות. הערה: פתרון agarose יהיה מוכן להיות שפך כאשר החלק תחתון של הבקבוק ניתן להשאיר על הכף במשך 5 שניות.
4. הכן מגש הליהוק אלקטרופורזה (10 x 15 ס"מ) על ידי הדבקת שולי עם קלטת והצבת גם מסרק בעמדה.
5. יוצקים פתרון agarose לאט tהוא הליהוק מגש כדי למנוע היווצרות של בועות. הסר בועות באמצעות קצה פיפטה. חכו ג'ל לקירור לחזק לחלוטין. לאחר הקרושה, להסיר את המסרק לאט, כדי למנוע התמוטטות הבארות על ידי יניקה והסר את הסרט מקצות המגש.
6. מניחים ג'ל agarose לתוך תיבת ג'ל ולמלא את יחידת אלקטרופורזה עם חיץ 1x טה-0.1% SDS עד הג'ל מכוסות במלואן.

3. טוענים לדוגמא והפרדת אלקטרופורזה

הערה: במעבדה שלנו, אנו משתמשים בדרך כלל דגימות משני עכבר ובני אדם, כולל נוזל השטיפה ברונכואלוואולרית (BALF; שני מינים), כביסות תא מתאי אפיתל סימפונות אדם (HBE), דגימות רוק כיח אדם. דוגמאות ניתן מפוגלות ב 6 M אוריאה על בסיס גבייה או מאוחסנות במשך פרקי זמן קצרים (6 שעות) על ידי הוספת מעכבי קוקטייל proteinase.

1. הכינו דגימות לטעינה באמצעות הוספת 10% של צבע טעינת מדגם זה (כלומר., 30 μl של מדגם ו -3μl של צבע). Homogenize דגימות ידי pipetting למעלה ולמטה. בקצרה ספין למטה צינורות ב 5000 סל"ד כדי לאסוף טיפות.
2. בזהירות לטעון נפח שווה של דגימות לתוך הבארות.
   1. טיפים טרום רטובים ו / או להשתמש טפטפות תזוזה חיוביות כדי להקל העמסת דגימות צמיגות מאוד. לאט לשאוב 80 - 90% של פתרון המדגם-צבע (כלומר, 27 - 30 μl) כדי למנוע בועות pipetting.
   2. לאט לטעון בתחתית בארות בהדרגה להזיז את קצה pipet כלפי מעלה. לקבלת דוגמיות כי נשארים מחוברים קצה פיפטה, לוותר בזווית של 45 מעלות ו להאריך ישר מעל הבאר או בעדינות להשתמש בצד של הבאר לשבור את הליחה הצמיגה. אין להעמיס על הבארות.
3. חברו את האלקטרודות מתיבת ג'ל אל הגנרטור כוח אלקטרופורזה. ודא אלקטרודות מחוברות כראוי (כלומר., עופרת אדומה הפקוקה אל התוצר החיובי של הגנרטור) כדי לאפשר מטען שלילי מוקיוס לרוץ לעבר חיובי אֶלֶקטרוֹדָה.
4. הפעל את הג'ל על 80 וולט למשך 90 דקות עבור ג'ל מסרק יחיד, או 60 - 75 דקות עבור ג'ל מסרק כפול כדי למנוע חפיפה בין שתי השורות.
5. כבה כוח גנרטור ולנתק את האלקטרודות ממקור החשמל.
6. מוציאים בזהירות את הג'ל מתיבת ג'ל ביד אחת משני צדי המגש הליהוק כדי להבטיח את הג'ל נשאר במקום.

4. להפחית ג'ל Agarose עבור העברת mucin יעילה

1. בזהירות במקום בדירה ג'ל במיכל זכוכית. שוטפים את הג'ל עם DH ₂ O כדי להסיר עקבות של חיץ טה-SDS.
2. הכן 1 ליטר של חיץ 4x SSC על ידי הוספת 200 מ"ל של 20x SSC לתוך 800 מ"ל של DH ₂ O. להרוויח 200 מ"ל של 10 מ"מ dithiothreitol (DTT) פתרון 4x SSC על ידי הוספת 309 מ"ג של DTT טרי לתוך 200 מ"ל של חיץ 4x SSC.
3. משרים את הג'ל עם DTT-4x SSC חיץ ומכסים. נער בעדינות במשך 20 דקות (10 סיבובים לדקה). לשטוף ג'ל עם חיץ 4x SSC DTT-חינם.

"> 5. שאב סופג הרכבת העברת מדגם קרום nitrocellulose

1. הכין נייר סופג ואקום להעברה.
   1. בזהירות לחתוך קרום nitrocellulose ממדי מעט רחב יותר מאשר הג'ל (כלומר., 10 x 15 ס"מ).
   2. מחצלת נקבובית רטובה עם DH ₂ O ולמקם אותו החלקה בצד למעלה ב הסופג.
   3. קרום nitrocellulose רטוב עם חיץ SSC 4x DTT ללא ולמקם אותו במרכז המזרן נקבובי.
   4. מכסה את המחצלת הנקבובית עם אטם הגומי, כשעזב את הפתיחה של האטם מיושר במדויק עם קרום nitrocellulose. אם המחצלת נקבובית עדיין גלויה, בזהירות להתאים את הממברנה כדי להבטיח שאין פער נשאר בין אטם קרום.
2. בזהירות במקום הג'ל agarose על גבי הממברנה. ודא צורות ג'ל חותם חזק עם אטם ואת הבארות של ג'ל מוצבים על הממברנה עבור ההעברה.
   1. למנוע היווצרות של בועות בין הממברנה ואת ג'ל. כדי למזער אתהיווצרותן של בועות, להשפריץ כמה טיפות של 4x SSC חיץ על הממברנה וחלק הג'ל מלמעלה למטה כדי לשטוף כל בועות נוצרות. הימנע מלהזיז את הג'ל על הממברנה חלבונים יתחילו למחוק מיד.
3. בזהירות לכסות את הג'ל עם חיץ 4x SSC.
4. בגין העברת mucin ידי יניקה.
   1. הפעל סופג ואקום ON ולחץ שקיעה ב- 40 - 50 mbar. הוסף כמה טיפות של חיץ 4x SSC על הג'ל כל 5 - 10 דקות כדי למנוע את הג'ל מהתייבשות. הפעל העברה של 90 דקות. אופציונלי: בסיום, לסמן את הבארות עם עיפרון להתמצאות.
5. השלך את הג'ל ולאחזר קרום nitrocellulose באמצעות פינצטה פלסטיק על שפת הממברנה.

6. חסימת ממברנה וזיהוי

1. לשטוף קרום מיד עם בופר פוספט 1x (PBS). אל תתנו הממברנה להתייבש.
2. לטבול את הממברנה לתוך 50 מיליליטר של חלב 3%-PBS חיץ חסימה ומניח על rocker בטמפרטורת החדר למשך שעה 1. לאחר דגירה, לבטל את חיץ החסימה.
3. לטבול קרום 1% פתרון ראשוני נוגדנים בחלב-PBS. דגירה הממברנה בפתרון הנוגדן הראשוני לילה על כיסא נדנדה ב 4 ° C.. לאחר דגירה, להשליך את פתרון הנוגדן הראשוני. לדלל את הנוגדנים הראשוניים כדי יחס של 1: 2,000 של פתרון נוגדנים כדי חסימת חיץ. הערה: לקבלת דוגמיות שמקורם עכברים, אנו משתמשים UNC 222 ארנב חלבון אנטי Muc5b ו עז נגד גרין פלורסנט (GFP). לקבלת דוגמיות שמקורם בבני אדם, אנו משתמשים נוגדנים נגד MUC5B ו 45M1 אנטי MUC5AC העיקרי H300.
4. הממברנה לשטוף 3 פעמים עם PBS במשך 10 דקות על כיסא נדנדה.
5. לטבול קרום 1% פתרון משני נוגדן חלב-PBS. לדלל את הנוגדנים המשניים ביחס של 1: 7,500 של פתרון נוגדנים כדי חסימת חיץ דגירה בטמפרטורת חדר למשך שעה 1 על כיסא נדנדה (למשל, 700 ארנבת אנטי ו 680 אנטי-עז.). להגן מפני אור על ידי דוגרי שותף שאינו שקוףntainer. מחק את פתרון נוגדנים משני לאחר 1 שעה.
6. הממברנה לשטוף 3 פעמים עם PBS במשך 5 דקות. לשטוף הממברנה עם DH ₂ O להסיר מלח.
7. קראו את הקרום על מערכת קרינה האינפרא-אדומה על פי הוראות היצרן.

תוצאות

אנו מציגים תוצאות נציגי ביטוי mucin הבאים ג'ל אלקטרופורזה agarose ב BALF מהריאות של עכברים (איור 1). בדוגמא זו, השתמשנו ג'ל agarose להראות גברת ביטוי של mucin ייצור הבא IL-13 לטיפול במודל עכבר TG-Muc5ac. הכתם המערבי מראה ייצוג חזותי של ביטוי mucin, אשר ניתן להשתמ?...

Discussion

הפרוטוקול של mucin מערבי סופג מתוארת וידאו זה משלב טכניקות קונבנציונליות המשמשות ביולוגיה מולקולרית להפריד ולהעביר מקרומולקולות גדולות, כגון דנ"א, עם טכניקות קבועות לגילוי חלבון, כלומר., Immunoblotting. באותה הטכניקה יכולה להיות מיושמת כדי ללמוד את הביולוגיה של glycosamin...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Tris Base	Sigma	T6060-1kg	1 kg
Glacial Acetic Acid	Sigma	ARK2183-1L	1 L
EDTA	Sigma	EDS-100g	100 g
Glycerol	Fisher	BP229-1	1 L
Bromophenol Blue	Sigma	114391-5g	5 g
SDS (Sodium Dodecyl Sulfate)	Sigma	L6026-50g	50 g
20x SSC (Sodium Saline Citrate) Buffer	Promega	V4261	1 L
NaCl	Fisher	S271-1	1 kg
Trisodium Citrate (Na3C6H5O7)	Sigma	W302600-1kg	1 kg
10 mM DTT (dithiothreitol)	Sigma	D0632	25 g
Milk Powder	Saco		Instant non-fat dry milk
Dulbecco Phosphate Buffered Saline (D-PBS)	Gibco lifetechnologies	14200-025	500 ml
Anti-GFP Goat Primary Antibody (mouse samples)	Rockland antibodies and assays	600-101-215	1 mg
UNC 222 Anti-Muc5b Rabbit Primary Antibody (mouse samples)	UNC
H300 Anti-MUC5B Primary Antibodies (human samples)	Santa Cruz	sc-20119	200 μg
45M1 Anti-MUC5AC Primary Antibodies (human samples)	Abcam	ab3649	100 μg
Donkey Anti-rabbit 800CW IR Dye	LI-COR Biosciences	926-32213	0.5 mg
Donkey Anti-mouse 680LT IR Dye	LI-COR Biosciences	926-68022	0.5 mg
Electrophoresis Gel Box and Casting Tray	Owl Seperation Systems
Power Supply Box	Biorad	Model 200/20
Membrane Blotting Paper	Amersham	10600016
Whatman Paper and Nitrocellulose membrane	GE	10 439 196
Boekel/Appligene Vacuum Blotter 230 v	Expotech USA	230600-2
Odyssey Infrared Fluorescence System	LI-COR Biosciences