Estudio in vivo de Interacción Humano-endotelial de pericitos Utilización de Plug Ensayo matriz de gel en el ratón

Resumen

Se presenta un protocolo para estudiar las interacciones del endotelio de pericitos humanos en ratón usando una variación del ensayo de angiogénesis tapón de gel de matriz.

Resumen

Angiogenesis is the process by which new blood vessels are formed from existing vessels. New vessel growth requires coordinated endothelial cell proliferation, migration, and alignment to form tubular structures followed by recruitment of pericytes to provide mural support and facilitate vessel maturation. Current in vitro cell culture approaches cannot fully reproduce the complex biological environment where endothelial cells and pericytes interact to produce functional vessels. We present a novel application of the in vivo matrix gel plug assay to study endothelial-pericyte interactions and formation of functional blood vessels using severe combined immune deficiency mutation (SCID) mice. Briefly, matrix gel is mixed with a solution containing endothelial cells with or without pericytes followed by injection into the back of anesthetized SCID mice. After 14 days, the matrix gel plugs are removed, fixed and sectioned for histological analysis. The length, number, size and extent of pericyte coverage of mature vessels (defined by the presence of red blood cells in the lumen) can be quantified and compared between experimental groups using commercial statistical platforms. Beyond its use as an angiogenesis assay, this matrix gel plug assay can be used to conduct genetic studies and as a platform for drug discovery. In conclusion, this protocol will allow researchers to complement available in vitro assays for the study of endothelial-pericyte interactions and their relevance to either systemic or pulmonary angiogenesis.

Introducción

La angiogénesis es el proceso por el que los nuevos vasos sanguíneos se forman a partir de una red vascular preexistente ¹ y es el foco de la investigación en curso a través de muchas áreas que van desde el desarrollo normal a la enfermedad. Este proceso dinámico implica la proliferación y migración de células endoteliales (EC) y el reclutamiento de pericitos para la construcción de un tubo vascular que se dirige hacia el sitio que necesita oxígeno y nutrientes ^2. Para estudiar este proceso requiere un ensayo igualmente dinámico, lo más importante que puede recapitular la naturaleza tridimensional de la formación del tubo. Los ensayos in vitro de la matriz 3D se han desarrollado para hacer frente a esta necesidad y han funcionado bien para permitir que los investigadores definir los pasos discretos en el espacio y el tiempo en el que tiene lugar la angiogénesis ^{3, 4, 5, 6.} Sin embargo, estos modelos matriciales en 3D in vitro se limitan a estudiar los vasos no perfundidos unad por lo tanto, carecen de los componentes críticos pertinentes para el proceso de angiogénesis (por ejemplo, haciendo circular el crecimiento y factores inhibidores, la tensión antinatural / fuerzas a través del lecho vascular) y dejar de simular el complejo entorno presente en el tejido vivo. Para hacer frente a esta limitación, varios ensayos de angiogénesis in vivo se han desarrollado ^7, incluyendo el ensayo de tapón de gel de matriz que será el tema central de nuestro informe ^{8, 9.}

El ensayo de tapón de gel de matriz es un ensayo de angiogénesis in vivo bien establecido que atrae a los investigadores, ya que proporciona una plataforma sólida para probar las funciones de las diferentes células y sustancias en la angiogénesis. gel Matrix es una solución de membrana basal disponibles en el mercado que es secretada por la línea celular de sarcoma de ratón de Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) que se solidifica en un material similar a un gel a 37 ° C. El gel de matriz puede mezclarse con células y / o sustancias, tales como factores de crecimiento, y injected por vía subcutánea en el ratón. El anfitrión EC invadirá el tapón de más de 14 días, formar una red vascular, y se convierten en perfusión de la sangre del huésped. Hasta la fecha, los ensayos tapón de gel de matriz se han centrado exclusivamente en el estudio del comportamiento de las células endoteliales durante la angiogénesis, sin embargo, a lo mejor de nuestro conocimiento todavía no se ha hecho ningún esfuerzo para determinar si este ensayo puede usarse células endoteliales de co-cultivo y pericitos para estudiar cómo interactúan estos dos tipos de células durante la angiogénesis. Específicamente, la comprensión de la relación entre la EC y pericitos es valioso para el estudio de enfermedades en las que la pérdida de vasos sanguíneos es patológica, incluyendo isquemia microvascular y enfermedad vascular periférica ^{10, 11, 12.}

A continuación, se describe un protocolo que introduce pericitos derivadas de seres humanos a la mezcla de gel de la matriz junto con EC humana y el factor de crecimiento de fibroblastos (bFGF). Esta mezcla luego se puede inyectar por vía subcutánea in el dorso de ratones SCID para permitir la formación de vasos híbridos, totalmente funcionales, con recubrimiento de pericitos. Nuestro protocolo se describe cómo preparar tapones de gel de matriz que contienen EC humanos, ya sea con o sin pericitos humanos, la colocación en ratones SCID y cómo analizar los cortes histológicos de los puntos finales de la angiogénesis críticos.

Protocolo

Declaración de Ética: Los procedimientos que implican sujetos animales han sido aprobados por el Cuidado de Animales institucional y el empleo de la Facultad de Medicina de la Universidad de Stanford.

NOTA: Los animales están bajo anestesia con isoflurano al 3% vaporizador y suministro de 3% de gas _O2. El uso de ungüento veterinario en los ojos puede ayudar a prevenir la sequedad, mientras que bajo anestesia.

1. Preparación de la célula

1. Crecer cultivos de células endoteliales y pericitos humanos en placas de 100 mm con 10 ml del medio de comunicación adecuado. Reemplazar 10 ml de medio fresco cada 2 - 3 días hasta que las células alcanzan 80% de confluencia.
   1. células de cultivo endoteliales (EC) en medio completo de células endoteliales (ECM) suplementado con empresa suministran 5% de suero bovino fetal (FBS), 10% de penicilina / estreptomicina y 10% de suplemento de crecimiento de células endoteliales.
   2. pericitos en los medios de cultivo de pericitos completa (PM), complementado con la compañía suministran 2% de SFB, 10% de penicilina / estreptomicina y 10% de suplemento de crecimiento de pericitos.
2. Preparar mezclas de células
   1. Calcular el número requerido de células para los grupos experimental y de control.
      NOTA: Cada tapón en el grupo experimental contiene un millón (1 x 10 ⁶⁾ EC humana y doscientos mil (2 x 10 ⁵⁾ pericitos. Para el grupo control, cada tapón contiene sólo 1,2 millones de EC humanos. El grupo de control negativo tiene gel matriz solamente. Cada grupo debe incluir al menos cuatro tapones, lo que requeriría dos ratones como los tapones se pueden inyectar en cada lado de un ratón de baja de la espalda. Tres enchufes servirían como por triplicado para el experimento y el cuarto se podrían utilizar en caso de que una falla. Preparar el 25% de células adicionales para que coincida con el volumen extra de gel.
   2. Recoger y contar las células de las placas de cultivo.
      1. Para separar las células, eliminar el medio y lavar una vez con solución salina tamponada 1x temperatura ambiente fosfato (PBS). Retirar PBS, se añade 1 ml de tripsina al 0,25% / EDTA 2,21 mM, y se incuba durante 1 min. Lavar las células de la placa mediante la adición de 2medio y recoger ml en un tubo de 15 ml.
      2. Recuento de células usando un hemocitómetro de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
      3. Centrifugar el número apropiado de células en un gránulo a 400 xg durante 5 min. Para el grupo experimental, centrifugar tanto ECs y pericitos abajo juntos en un pellet.

2. Preparación matriz de gel

1. Descongelar matriz de gel por completo a 4 ° C durante 4 horas o toda la noche para obtener una solución homogénea. No se requiere ninguna mezcla.
2. gel de alícuota de la matriz en tubos de 1,5 ml y se almacena a 4 ° C.
3. Pre-térmica del estériles tubos de 1,5 ml y 28 g jeringas de 1 cc de insulina a 4 ° C. Precaución: Mantenga gel de matriz en hielo en todo momento.
4. Mezclar gel matriz fría con bFGF a una relación en volumen de 1: 100 (concentración final de bFGF = 0,5 mg / ml; bFGF de la solución = 50 mg / ml) Después de mezclar la solución de gel de matriz pipeteando arriba y abajo varias veces, incubar en hielo durante 30 - 60 min bntes de la mezcla con las células en el paso 3.1.
   NOTA: Descongelar la población de bFGF antes de mezclar. Calcular el número de tapones necesarios para la inyección. Por ejemplo, cada tapón de gel requiere 200 l de matriz. Por lo tanto, preparar 25% de gel extra.

3. Mezclar matriz de gel con células

1. Para cada grupo, resuspender el sedimento celular (que contiene el número de células apropiado) con el volumen calculado de gel de matriz que contiene bFGF. Mezclar suavemente para evitar la formación de espuma y dejar en el tubo de 15 ml en hielo hasta que los ratones se preparan para inyección.

4. Preparación del ratón

1. Anestesie 1 ratones SCID para 5 min en 3% de isoflurano más O ₂ 3% en una cámara de inducción. Centrarse en un grupo experimental o 2 ratones, a la vez.
2. Retire el ratón desde la cámara de inducción, el lugar en un lado ventral almohadilla caliente hacia abajo y adjuntar rápidamente una boquilla de hocico a la cara del ratón a través de un sistema no re-respiración para suministrar la anestesia en todo el injeprocedimiento cción. Conmutar el flujo de gas desde la cámara de inducción al sistema sin reinspiración y bajar la presión del gas a 1,5% de isoflurano y 1,5% de O _2.
3. Eliminar el vello de ambas regiones traseras laterales (alrededor de 1 cm de diámetro) con una máquina de afeitar o crema de eliminación de pelo.
4. Limpie el área con una gasa con alcohol al 70%.
5. Devolver el ratón hacia la cámara de inducción y repita los pasos 4.2 a 4.4 con el segundo ratón.

5. matriz de gel de inyección

1. Preparar un ratón para inyección uniendo al sistema sin reinspiración y puesta en el lado ventral hacia abajo almohadilla térmica.
2. Cargar el gel de la matriz en un pre-refrigerada 28 G 1 cc jeringa de insulina de un ratón a la vez.
   1. Cargar el volumen total de 500 l de gel de matriz para dos tapones (200 l por enchufe más 25% extra) en la jeringa.
   2. Asegúrese de inyectar el gel de la matriz en los ratones dentro de 3 min de cargar las células en la jeringa para evitar que la ceLLS de depositarse en el lado de la jeringa y para evitar gel matriz se solidifique dentro de la jeringa.
3. Levante la piel de la espalda para localizar espacio subcutáneo, a continuación, inyectar 200 l de la matriz de gel de forma lenta y uniforme en el espacio subcutáneo de la parte posterior trasera de la caja torácica.
4. Retire la aguja de inyección lentamente, teniendo cuidado de evitar que la matriz de gel se escape fuera del lugar de la inyección. Una protuberancia se forma en el sitio de inyección. Limpie el lugar de inyección con un algodón con alcohol.
5. inyección repita los pasos 5.2 a 5.5 en el otro lado de la espalda del ratón, a continuación, dejar el ratón sobre su espalda durante 1 minuto para permitir la gelificación de la matriz de gel sobre la almohadilla de calor.
6. Esquema de ambos golpes utilizando un marcador permanente para identificar el bulto después de 14 días. Después de un poco de pelo vuelve a crecer, será más fácil encontrar el bache.

6. Enchufe matriz de gel de aislamiento: 14 días después de la inyección

1. La eutanasia a los ratones con humanidad mediante la exposición del animals de> 5 min de la inhalación de dióxido de carbono seguido por dislocación cervical para asegurar la muerte.
2. Retire el tapón de gel de la matriz de la espalda del ratón.
   1. Retire con cuidado cabello nuevo alrededor del sitio de la inyección, donde el tapón se encuentra repitiendo el paso 4.3. La línea de marcador indica el tamaño del bulto original bajo la piel.
   2. Escindir el enchufe junto con las capas de piel y músculo que rodea adjuntos en los lados superior e inferior de la clavija, respectivamente.
      1. Usando tijeras quirúrgicas finas, hacer una incisión en la frontera marcada de la clavija que es perpendicular a la piel y cortar a través de al músculo debajo del tapón. Luego, corte con cuidado alrededor de la periferia del tapón a lo largo del borde marcado.
      2. Retire el tapón, manteniéndolo intercalada entre las capas de la piel y el músculo. Lavar inmediatamente en un pequeño vaso de precipitado con 1x PBS para lavar el exceso de sangre. El tapón está ahora listo para ser fijado (paso siguiente, 6.3).
3. Fijar el PLUg en 4% de paraformaldehído.
   1. Toda la clavija, incluyendo las capas de piel y músculo, en un tubo de 50 ml con 25 ml de paraformaldehído al 4% durante 24 horas a temperatura ambiente sin balanceo. Al día siguiente, la transferencia de la clavija en 25 ml de etanol al 70% durante otras 24 horas antes de la inclusión en parafina.
      NOTA: Maneje con precaución paraformaldehído. Usar guantes.

7. Proceso de la matriz de gel de parafina Plug

1. Preparar el enchufe para la inclusión en parafina.
   1. Oriente la clavija como se muestra en la Figura 1a; colocar el tapón en un casete de tejido de manera que el lado de la clavija está orientada hacia arriba y tanto en las capas de piel y músculo son visibles a través de la superficie del bloque de tejido que se va a cortar durante el corte primero.
2. Parafina incrustar el tapón de acuerdo con los protocolos estándar de inclusión en parafina ^13.
3. Cortar 8 - 10 micras de espesor secciones fuera del bloque de tejido y su montaje en portaobjetos de microscopio According a los protocolos estándar de parafina seccionar ^13.
4. Almacenar las preparaciones en un lugar fresco y seco a temperatura ambiente hasta que esté listo para la tinción.

8. Las secciones se tiñen con hematoxilina y eosina (H & E) ¹³

1. De-paraffinize las secciones de tejido haciendo pasar las diapositivas a través de 100% de xileno dos veces, 100% de etanol, 95% de etanol, 70% de etanol y por último 1x PBS, cada uno durante 5 minutos a temperatura ambiente. Deja diapositivas en 1x PBS hasta el siguiente paso.
2. 100 l solución de H & E pipeta sobre la sección y se incuba durante 1 - 5 min, o hasta que hay una clara diferencia entre los núcleos y citoplasma azul rosado en una célula como se observa bajo un microscopio de luz en posición vertical a un aumento de 10X. Tenga cuidado de no dejar que cualquier solución de H & E toque el objetivo.
3. Lavar con H & E solución fuera de la corredera por meter el portaobjetos en un vaso grande de agua del grifo, a continuación, colocar el portaobjetos en un rack en el vaso de precipitados y enjuagar con agua corriente durante 2 min.
4. Mesve al paso 9.8 para montar las diapositivas.

9. Manchas otras diapositivas capilares humanos y pericitos

1. De-paraffinize las secciones de tejido haciendo pasar las diapositivas a través de 100% de xileno dos veces, 100% de etanol, 95% de etanol, 70% de etanol y por último 1x PBS, cada uno durante 5 minutos a temperatura ambiente. Deja diapositivas en 1x PBS hasta el siguiente paso.
2. Hervir las secciones de solución de recuperación de antígeno.
   1. En un vaso de 2 L, se preparan hirviendo antígeno de recuperación de solución usando tampón de citrato 1x (pH 7,0) a 95 ° C en un bloque de calentamiento.
   2. Una vez hirviendo, colocar los portaobjetos en una rejilla de metal y sumergir en la solución de recuperación de antígeno de ebullición durante 20 minutos.
   3. Retirar con cuidado el vaso de precipitados del bloque de calentamiento con las diapositivas todavía sumergidas y permita que la solución para volver lentamente a temperatura ambiente durante aproximadamente 30 minutos.
   4. Colocar los portaobjetos en PBS 1x hasta el siguiente paso.
3. Bloquear las secciones en tampón de bloqueo (PBS 1x, 5% de suero de cabra, 00,3% de Triton X-100).
   1. Dibujar un círculo hidrofóbica alrededor de los bordes de cada sección con un bolígrafo PAP.
   2. Colocar los portaobjetos en una bandeja de humedad con agua destilada en la parte inferior de la bandeja.
   3. Pipeta de tampón de bloqueo 100 l en las secciones asegurándose de que todo el tejido está cubierto por el líquido (puede requerir más de 100 l).
   4. Incubar las secciones con tampón de bloqueo durante 1 hr.
4. Incubar las secciones con el anticuerpo primario.
   1. Preparar una solución con dos anticuerpos primarios para sondear cada sección para CD31 (EC) y la actina de músculo liso (pericitos) diluido en tampón de dilución (1 x PBS, 1% BSA, 0,3% de Triton X-100).
      NOTA: Aquí, la concentración de anti-CD31 es 1:50 y la concentración de actina anti-músculo liso es 1: 300.
   2. Incubar las secciones durante la noche a 4 ° C con 100 anticuerpos primarios mu l en una bandeja de humedad que contiene agua destilada.
5. Lavar los portaobjetos tres veces en 1x PBST (1x PBS + 0,1% TWEEN20) durante 5 minutos cada lavado.
6. Incubar las secciones con anticuerpo secundario.
   1. Preparar una solución con un fluoróforo conjugado de cabra anti-conejo anticuerpo secundario para reconocer el anticuerpo de conejo anti-CD31 diluido en tampón de dilución.
      1. NOTA: El anticuerpo primario actina de músculo liso ya está conjugado con un fluoróforo Cy3, así que se necesita ninguna tinción anticuerpo secundario. conejo concentración de cabra anti anticuerpo secundario es de 1: 250.
   2. Incubar las secciones durante 1 hora con 100 l de anticuerpo secundario en la bandeja la humedad que contiene agua destilada.
7. Lavar los portaobjetos tres veces en 1x PBST durante 5 minutos cada lavado.
8. Montar las diapositivas.
   1. Pipeta 2 - 3 gotas (~ 40 - 60 l) de antifade solución de montaje con DAPI tinción nuclear en cada sección.
   2. Con cuidado, coloque un no. 1.5 cubreobjetos sobre las secciones y solución de montaje, lo que permite que el fluido se extiende a lo largo de las secciones y de los bordes dela hoja de la cubierta. utilizar suavemente un dedo para presionar las burbujas de aire que puedan estar situados sobre la sección.
   3. Deje que los portaobjetos se sequen durante al menos 1 hora antes de su uso.

Densidad capilar 10. Cuantificar y ^la Estructura ¹⁴

1. Contar el número de capilares en H & E secciones teñidas, expresado como # / ^mm2.
   1. Adquirir fotos de cuatro campos diferentes en un microscopio de luz en posición vertical bajo un aumento de 40X.
      NOTA: Los capilares se identifican como tubos llenos de células rojas de la sangre.
   2. Alternativamente, en lugar de los capilares contando manualmente, utilice el software de análisis de imágenes (por ejemplo, Wimasis Análisis de Imágenes) para cuantificar diversos parámetros de la angiogénesis, como el número buque, buque longitud media y diámetro, y los puntos de ramificación.
2. Analizar la estructura capilar en secciones teñidas de inmunofluorescencia.
   1. Adquirir fotos de cuatro campos diferentes en un microscopio de fluorescencia invertidacon el cubo de filtro FITC y TxRed.
      1. Utilice un cubo FITC a la imagen EC mediante excitación a 488 nm de longitud de onda y utilizar un cubo TxRed de pericitos imagen mediante excitación a 594 nm de longitud de onda.

Resultados

Representante tinción H & E y de inmunofluorescencia de secciones tapón de gel de la matriz se muestran en la Figura 2. Secciones de la CE únicamente las clavijas muestran algunos vasos que en su mayoría no son perfundidos con sangre (Figura 2 arriba a la izquierda, flechas negras), mientras que los tapones que contienen tanto las EC y los pericitos mostrar varios perfundidos vasos de mayor diámetro y la cobertura de pericitos completa, como se ...

Discusión

El ensayo de tapón de gel de matriz ha demostrado ser un método conveniente y potente para evaluar la regulación de genes en la angiogénesis, los compuestos angiogénicos y antiangiogénicos en vivo, y como complemento a las pruebas in vitro. A continuación, describimos en detalle un nuevo ensayo tapón de gel de la matriz de la angiogénesis humana que investiga la interacción entre las células endoteliales y pericitos durante la formación de los vasos.

Ha...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
PBS (Phosphate buffered saline)	Corning	21-031-CV
0.25% Trypsin/0.53 mM EDTA	Corning	25-053-CI
Endothelial Cell Media (ECM) kit	Sciencell	1001	includes media, EC growth supplement, and penicillin/streptomycin, each supplied at the appropriate volume for easy mixing
Pericyte Media (PM) kit	Sciencell	1201	includes media, Pericyte growth supplement, and penicillin/streptomycin, each supplied at the appropriate volume for easy mixing
primary human pulmonary microvascular endothelial cells	Pulmonary Hypertension Breakthrough Initiative		this cell type is also available commercially. Cells used at passage 1-4
primary human pulmonary pericytes	Pulmonary Hypertension Breakthrough Initiative		this cell type is not available commercially, but brain paricytes are.  Cells used at passage 1-4
bFGF (basic Fibroblast Growth Factor)	Peprotech	100-18B	stock solution is 50 μg/ml in 0.1% BSA in PBS, aliquots at 50 μl and stored at -20 degrees
Matrigel Basement Membrane Matrix	BD	356237
28 G 1 cc Insluin Syringe	BD	329410
SCID (Severe Combined Immune Deficiency) mice	The Jackson Laboratory	5557	NOD.SCID IL2R gamma knockout strain is the best strain; 4-6 weeks of age
1.5 ml microcentrifuge tubes, sterile	Thermo Fisher Scientific	05-408-129
15 ml screw top tubes, sterile	BD Biosciences	352096
PAP pen	Life Technologies	8899
hemocytometer	ThermoFisher Scientific	02-671-6
Nair hair removal cream	Walmart
anti-human CD31 primary antibody	LifeSpan Biosciences	LS-B4737	working solution is 1:50
anti-human Smooth Muscle actin CY3 primary fluorescent antibody	Sigma	C6198	working solution is 1:300
goat anti-rabbit secondary antibody; 488/green	ThermoFisher Scientific	A-11008	working solution is 1:250
Prolong Gold DAPI solution	Cell Signaling	8961S
microscope slides	VWR	48300-047
no. 1.5 cover slips	Thermo Fisher Scientific	12-544-D
citrate buffer 10x	Millipore	21545
extra fine surgical scissors	Fine Science Tools	14084-08
Formalin (paraformaldehyde)	Thermo Fisher Scientific	245-685
Tissue cassettes	Simport	M492-12
goat serum	Dako	X0907