В Vivo Изучение человеческого взаимодействия Эндотелиальная-перицитов Использование гелевой матрицы штепсельной вилки пробирного мыши

Резюме

Мы представляем протокол для изучения взаимодействия эндотелиальной-перицитов человека в мыши с помощью изменения гелевой матрицы плагин ангиогенеза анализа.

Аннотация

Angiogenesis is the process by which new blood vessels are formed from existing vessels. New vessel growth requires coordinated endothelial cell proliferation, migration, and alignment to form tubular structures followed by recruitment of pericytes to provide mural support and facilitate vessel maturation. Current in vitro cell culture approaches cannot fully reproduce the complex biological environment where endothelial cells and pericytes interact to produce functional vessels. We present a novel application of the in vivo matrix gel plug assay to study endothelial-pericyte interactions and formation of functional blood vessels using severe combined immune deficiency mutation (SCID) mice. Briefly, matrix gel is mixed with a solution containing endothelial cells with or without pericytes followed by injection into the back of anesthetized SCID mice. After 14 days, the matrix gel plugs are removed, fixed and sectioned for histological analysis. The length, number, size and extent of pericyte coverage of mature vessels (defined by the presence of red blood cells in the lumen) can be quantified and compared between experimental groups using commercial statistical platforms. Beyond its use as an angiogenesis assay, this matrix gel plug assay can be used to conduct genetic studies and as a platform for drug discovery. In conclusion, this protocol will allow researchers to complement available in vitro assays for the study of endothelial-pericyte interactions and their relevance to either systemic or pulmonary angiogenesis.

Введение

Ангиогенез представляет собой процесс , посредством которого образуются новые кровеносные сосуды из предварительно существующей сосудистой сети ¹ и является предметом текущих исследований во многих областях , начиная от нормального развития болезни. Этот динамический процесс включает пролиферацию и миграцию эндотелиальных клеток (ЭКС) и набор перицитов построить сосудистую трубку, которая направлена в сторону участка , который нуждается в кислороде и доставку питательных веществ ^2. Для изучения этого процесса требует столь же динамический анализ, самое главное тот, который может резюмировать трехмерную природу формирования трубки. В пробирке 3D матричные анализы были разработаны для удовлетворения этой потребности и работали хорошо , чтобы позволить исследователям определить дискретные шаги в пространстве и времени , в котором ангиогенез имеет место ^{3, 4, 5, 6.} Тем не менее, эти модели в пробирке 3D матрицы ограничиваются изучением не-перфузию сосудов наd поэтому не имеют критических компонентов , имеющих отношение к процессу ангиогенеза (например, циркулирующей роста и ингибирующие факторы, неестественное напряжение / силы через сосудистого русла) и не в состоянии смоделировать сложную среду , присутствующей в живой ткани. Для устранения этого ограничения, несколько в естественных условиях анализов ангиогенеза были разработаны ^7, включая пробки анализа матрицы геля , которая будет находиться в центре нашего доклада ^{8, 9.}

Анализ гелевая матрица штепсель хорошо налаженные естественных условиях ангиогенез анализа в который обращается к исследователям , поскольку она обеспечивает надежную платформу для тестирования роли различных клеток и веществ в ангиогенеза. Матрица гель представляет собой коммерчески доступный раствор базальная мембрана, которая секретируется Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) линии клеток мыши саркомы, которая затвердевает в виде материала гелеобразную при 37 ° С. Гель матрица может быть смешана с клетками и / или веществ, таких как факторы роста, а также ИнджеИДКТК подкожно в мышь. Хозяин КЭ вторгнутся пробку в течение 14 дней, образуют сосудистую сеть, и стать перфузии кровью хозяина. На сегодняшний день, подключаемые анализы матрицы геля были сосредоточены исключительно на изучении поведения эндотелиальных клеток во время ангиогенеза, однако, насколько нам известно, никаких усилий не было сделано, чтобы определить, является ли этот анализ может быть использован для совместного культивирования эндотелиальных клеток и перицитов изучить, каким образом эти два типа клеток взаимодействуют во время ангиогенеза. В частности, понимание взаимосвязи между КЭ и перицитов является ценным для изучения заболеваний , где потеря кровеносных сосудов патологическое, в том числе микрососудистой ишемии и болезни периферических сосудов ^{10, 11, 12.}

Здесь мы опишем протокол, который вводит человека полученный перицитов к смеси гелевой матрице наряду с человеческим КЧС и фактор роста фибробластов (bFGF). Затем эту смесь можно вводить подкожно яп спинке мышей SCID, чтобы обеспечить образование полностью функциональным, перицитов покрытием, гибридные сосуды. Наш протокол описывает, как подготовить матрицу геля пробки, содержащие человеческие ECs с или без человеческих перицитов, помещение в SCID мышей и как анализировать гистологических срезов для критических ангиогенеза конечных точек.

протокол

Этика Заявление: Процедуры с участием субъектов животных были одобрены Институциональные уходу и использованию животных комитета в Стэнфордском университете в Школе медицины.

ПРИМЕЧАНИЕ: Животные находятся под обезболиванием с 3% изофлуран испарителя и поставки газа O ₂ 3%. Использование ветеринарную мазь на глаз может помочь предотвратить сухость под наркозом.

1. Подготовка сотового

1. Grow эндотелиальные и перицитов культур клеток человека в 100-мм чашках с 10 мл соответствующего средства массовой информации. Заменить 10 мл свежей среды каждые 2 - 3 дня до клетки достигают 80% слияния.
   1. Культура эндотелиальные клетки (ПАУ) в полной среде эндотелиальных клеток (ECM), дополненной компанией поставляется 5% фетальной бычьей сыворотки (FBS), 10% пенициллина / стрептомицина и 10% дополнительно роста эндотелиальных клеток.
   2. Культура перицитов в полной перицитов средах (ПМ), дополненной компания поставила 2% FBS, 10% пенициллин / стрептомицин и 10% роста добавки перицитов.
2. Готовят смеси клеток
   1. Рассчитать необходимое количество ячеек для экспериментальной и контрольной групп.
      Примечание: Каждый модуль в экспериментальной группе содержит один миллион (1 х 10 ⁶⁾ человека ЭКС и двести тысяч (2 х 10 ⁵⁾ перицитов. В контрольной группе, каждый плагин содержит только 1,2 миллиона человеческих ECs. Группа отрицательного контроля имеет только гелевую матрицу. Каждая группа должна включать, по меньшей мере, четыре заглушки, которые требовали бы двух мышей, как штекеры могут быть введены в каждую сторону от нижней на мыши обратно. Три пробки будет служить в качестве трех повторностях для эксперимента, а четвертый может быть использован в случае, если один терпит неудачу. Приготовьте 25% дополнительные ячейки, чтобы соответствовать дополнительный объем геля.
   2. Сбор и подсчет клеток из культуры пластин.
      1. Для того, чтобы отделить клетки, удалить носитель и мыть один раз с комнатной температуры 1x фосфатном буферном солевом растворе (PBS). Удалить PBS, добавляют 1 мл 0,25% трипсина / 2,21 мМ ЭДТА, и инкубируют в течение 1 мин. Вымойте клетки от пластины путем добавления 2мл среды и собирают в 15 мл пробирку.
      2. Подсчета клеток с помощью гемоцитометра в соответствии с инструкциями изготовителя.
      3. Центрифуга соответствующее количество клеток в гранулы при 400 х г в течение 5 мин. Для экспериментальной группы, центрифугу и ЭКС и перицитов вниз вместе в одну гранулу.

2. Матрица геля Приготовление

1. Оттаять гелевую матрицу полностью при температуре 4 ° С в течение 4 часов или в течение ночи, чтобы получить гомогенный раствор. Смешивание не требуется.
2. гелевую матрицу аликвоты в 1,5 мл пробирки и хранят при температуре 4 ° С.
3. Предварительно охлажденные стерильные 1,5 мл пробирки и 28 G 1 куб.см инсулиновые шприцы при температуре 4 ° С. Внимание: Хранить матрицу геля на льду во все времена.
4. Смешайте гелевую матрицу холодной с bFGF в объемном соотношении 1: 100 (конечная концентрация bFGF = 0,5 мкг / мл; bFGF маточного раствора = 50 мкг / мл) после смешивания раствора гелевую матрицу пипетированием вверх и вниз несколько раз, инкубировать на льду в течение 30 - 60 мин бEfore смешивания с клетками на этапе 3.1.
   Примечание: Разморозить запаса bFGF перед смешиванием. Подсчитайте число заглушек, необходимых для инъекций. Например, каждый плагин требует 200 мкл матричного геля. Таким образом, подготовить 25% дополнительного геля.

3. Перемешать Матрица Гель с клетками

1. Для каждой группы, ресуспендируют осадок клеток (содержащий соответствующее количество клеток) с расчетного объема матричного геля, содержащего bFGF. Осторожно перемешать, чтобы избежать пенообразования и оставить в 15 мл пробирку на льду, пока мыши не подготовлены для инъекций.

4. Подготовка мыши

1. Обезболить 1 SCID мышей в течение 5 мин в 3% Isoflurane плюс 3% O ₂ в индукционной камере. Фокус на одной экспериментальной группе, или 2-х мышей, в то время.
2. Отключив мышь от индукции камеры, место на грелку вентральной стороной вниз и быстро прикрепить морду насадку к лицу мыши через систему без возвратного дыхания для подачи анестезии по всей ИнджеПроцедура фикция. Переключение газового потока из индукционной камеры к системе без возвратного дыхания и понижают давление газа до 1,5% изофлуран и 1,5% O _2.
3. Удалить волосы с обеих боковых областей задних (около диаметром 1 см) с кремом для удаления волос или бритвы.
4. Протрите участок кожи с спиртовым тампоном на 70%.
5. Возвращение мышь к индукции камеры и повторите шаги 4.2 - 4.4 со второй мыши.

5. Матрица Гель для инъекций

1. Подготовьте одну мышь для инъекций путем присоединения к системе без возвратного дыхания и размещения на грелку вентральной стороной вниз.
2. Нагрузка матричного геля в предварительно охлажденный 28 G 1 куб.см инсулиновый шприц одной мыши в то время.
   1. Загрузить полный объем 500 мкл матричного геля для двух вилок (200 мкл на штекер плюс 25% за дополнительную плату) в шприц.
   2. Убедитесь, чтобы придать гелевой матрицы в мышей в течение 3 мин после загрузки клеток в шприц, чтобы предотвратить CELLS оседать на боковой стороне шприца и чтобы предотвратить гелевую матрицу затвердевание внутри шприца.
3. Поднимите заднюю кожу, чтобы определить местонахождение подкожное пространство, а затем вводят 200 мкл геля матрицы медленно и равномерно в подкожное пространство задней задней части грудной клетки.
4. Удалить инъекционную иглу медленно, соблюдая осторожность, чтобы не допустить гелевую матрицу от утечки из места инъекции. Буферный сформирует в месте инъекции. Протрите место инъекции с спиртовым тампоном.
5. Повторите инъекции шаги 5.2 - 5.5 на другой стороне задней части мыши, а затем оставить мышь на спине в течение 1 мин, чтобы позволить гелеобразование геля матрицы на тепловой площадку.
6. Outline обе ударах с использованием постоянного маркера для идентификации шишка через 14 дней. После того, как некоторые волосы вырастают снова, это будет легче найти шишку.

6. Матрица геля штепсельной вилки Изоляция: через 14 дней после инъекции

1. Эвтаназии мышей гуманно, подвергая животноес до> 5 мин ингаляции диоксида углерода с последующим смещением шейных позвонков, чтобы гарантировать смерть.
2. Удалите матрицу геля вилку из спины мыши.
   1. Аккуратно удалите отросших волос вокруг места инъекции, где пробка расположена, повторив шаг 4.3. Маркер линия указывает размер оригинального бугорок под кожей.
   2. Акцизный пробку вместе с окружающими слоями кожи и мышц, прикрепленных на верхней и нижней сторонах вилки, соответственно.
      1. Использование тонких хирургические ножницы, надрезать на отмеченной границе вилки, которая перпендикулярна к коже и прорезать к мышце под пробкой. Затем осторожно обвести периферии пробки вдоль отмеченной границы.
      2. Удалите пробку, удерживая ее зажатой между кожей и мышечных слоев. Немедленно промыть в небольшом стакане с 1x PBS, чтобы смыть лишнюю кровь. Вилка теперь готова быть фиксированной (следующий шаг, 6.3).
3. Закрепить PLUг в 4% параформальдегид.
   1. Поместите всю пробку, включая кожу и мышечные слои, в 50 мл пробирку с 25 мл 4% параформальдегида в течение 24 ч при комнатной температуре без раскачивания. На следующий день, перевести вилку в 25 мл 70% этанола в течение еще 24 ч до парафин.
      Примечание: Ручка параформальдегида с осторожностью. Носить перчатки.

7. Парафин Процесс гелевой матрицы штепсельной вилки

1. Подготовить пробку для парафин.
   1. Сориентируйте заглушку , как показано на рисунке 1а; поместите пробку в кассету ткани таким образом, чтобы сторона вилки была обращена вверх, и как кожи, так и мышечные слои видны по всей поверхности блока тканей, которые будут сокращены в первую очередь во время секционирования.
2. Парафин вставлять вилку в соответствии со стандартными протоколами парафиновых встраивания ^13.
3. Вырезать 8 - 10 мкм толщиной секций от блока ткани и смонтировать на предметные стекла микроскопа Accorдинь со стандартными парафиновых секционирования протоколов ^13.
4. Храните слайды в прохладном и сухом месте при комнатной температуре до готовности к окрашиванию.

8. Пятно Секции гематоксилином и эозином Stain (H & E) ¹³

1. Де-paraffinize срезах тканей путем пропускания через слайды 100% ксилола в два раза, 100% этанол, 95% этанола, 70% этанола и, наконец, 1X PBS, каждый в течение 5 мин при комнатной температуре. Оставьте слайдов в 1X PBS до следующего шага.
2. Пипетка 100 мкл раствора H & E на участке и не инкубировать в течение 1 - 5 мин, или пока имеется четкий контраст между голубыми ядрами и розовой цитоплазмы в клетке, если смотреть под вертикальным световым микроскопом при 10-кратным увеличением. Будьте осторожны, чтобы не допустить, чтобы любое решение H & E прикоснуться к цели.
3. Мытье H & E решение от слайда по Данкинг слайд в большом стакане водопроводной воды, а затем поместить слайд в стойку в стакане и промойте проточной водой в течение 2 мин.
4. Moве к шагу 9.8 для установки слайдов.

9. Пятно Другие Слайды для человека капилляры и Перициты

1. Де-paraffinize срезах тканей путем пропускания через слайды 100% ксилола в два раза, 100% этанол, 95% этанола, 70% этанола и, наконец, 1X PBS, каждый в течение 5 мин при комнатной температуре. Оставьте слайдов в 1X PBS до следующего шага.
2. Отварить секции в поисковых раствор антигена.
   1. В 2 л лабораторный стакан, готовят кипячением антиген извлечения раствора с использованием 1х цитратном буфере (рН 7,0) при 95 ° C на нагревательном блоке.
   2. После кипения, поместите слайды в металлическую стойку и погрузить в раствор антигена поисковой кипения в течение 20 мин.
   3. Осторожно вынуть стакан из нагревательного блока с горками еще погруженных и дайте раствору медленно нагреться до комнатной температуры в течение примерно 30 мин.
   4. Поместите слайды в 1x PBS до следующего шага.
3. Блок-секции в блокирующем буфере (PBS 1x, 5% козьей сыворотки, 00,3% Тритон Х-100).
   1. Нарисуйте гидрофобный круг вокруг краев каждой секции с PAP ручкой.
   2. Поместите слайды в лоток влажности с использованием дистиллированной воды в нижней части лотка.
   3. Пипетка 100 мкл Блокирующий буфер на секциях то, чтобы все ткани покрыта жидкостью (может потребоваться более 100 мкл).
   4. Инкубировать срезы с блокирующим буфером в течение 1 часа.
4. Инкубировать срезы с первичным антителом.
   1. Приготовьте одно решение с двумя первичными антителами, чтобы исследовать каждую секцию для CD31 (ПАУ) и актин гладких мышц (перицитов), разведенного в буфере для разведения (1х PBS, 1% BSA, 0,3% Тритон Х-100).
      Примечание: Здесь, анти-CD31 концентрации 1:50 и анти-гладкая концентрация актин составляет 1: 300.
   2. Инкубируйте разделы в течение ночи при 4 ° С со 100 мкл первичных антител в ванночку влажности, содержащего дистиллированную воду.
5. Вымойте слайды три раза в 1x PBST (1x PBS + 0,1% TWEEN20) в течение 5 мин каждый промывной.
6. Инкубировать срезы с вторичным антителом.
   1. Готовят раствор с флуорофором, конъюгированного козьего анти-кроличьего вторичным антителом признать кролика антитела против CD31, разбавленного в буфере для разведения.
      1. ПРИМЕЧАНИЕ: актин гладких мышц первичного антитела уже конъюгированы с Су3 флуорофора, так что не требуется вторичное окрашивание антител. Коза-анти вторичного концентрация антитела кролика составляет 1: 250.
   2. Инкубируйте разделы в течение 1 ч со 100 мкл вторичного антитела в лотке влажности, содержащего дистиллированную воду.
7. Вымойте слайды три раза в 1x PBST в течение 5 мин каждый стирки.
8. Установите слайды.
   1. Пипетировать 2 - 3 капли (~ 40 - 60 мкл) antifade монтажного раствора с DAPI ядерного окрашивания на каждом участке.
   2. Аккуратно откуда нет. 1.5 Крышка скользит по секциям и монтажного раствора, что позволяет жидкости разложить по секциям и к краямкрышка скольжения. Осторожно использовать палец, чтобы выдавить пузырьки воздуха, которые могут быть расположены по сечению.
   3. Пусть слайды высохнуть в течение по меньшей мере 1 ч перед обработкой.

10. Количественная капиллярного Плотность и структура ¹⁴

1. Подсчитайте количество капилляров в H & E окрашенных срезов, выраженное в виде # / мм ^2.
   1. Приобретать фотографии четырех различных полей на вертикальном световым микроскопом при 40-кратном увеличении.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Капилляры выявляются в виде трубок, заполненных эритроцитами.
   2. В качестве альтернативы, вместо того , чтобы вручную подсчета капилляров, используют программное обеспечение для анализа изображений (например, Wimasis путем анализа изображения) для количественного определения различных параметров ангиогенеза , такие как номер судна, средней длины судна и диаметра, а также точки ветвления.
2. Анализ структуры капилляров в иммунофлуоресцентных окрашенных участках.
   1. Приобретать фотографии четырех различных полей на перевернутой флуоресцентного микроскопас FITC и TxRed фильтра куб.
      1. Используйте куб FITC для изображения КЭ при возбуждении при 488 нм и использовать куб TxRed для перицитами изображения путем возбуждения при 594 нм.

Результаты

Представитель H & E и иммунофлуоресцентного окрашивание срезов матрицы геля зажигания показаны на рисунке 2. Разделы от ЕК только штекеры отображения некоторых судов, которые в большинстве случаев не озарен крови (рис 2 в левом верхнем углу черные с?...

Обсуждение

Анализ гель плагин матрица оказалась удобной и мощный метод для оценки регуляции генов в ангиогенезе, ангиогенеза и антиангиогенных соединений в естественных условиях, и дополнить тесты в лабораторных условиях . Здесь мы опишем подробно новый матричный гель плагин анализа ч...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
PBS (Phosphate buffered saline)	Corning	21-031-CV
0.25% Trypsin/0.53 mM EDTA	Corning	25-053-CI
Endothelial Cell Media (ECM) kit	Sciencell	1001	includes media, EC growth supplement, and penicillin/streptomycin, each supplied at the appropriate volume for easy mixing
Pericyte Media (PM) kit	Sciencell	1201	includes media, Pericyte growth supplement, and penicillin/streptomycin, each supplied at the appropriate volume for easy mixing
primary human pulmonary microvascular endothelial cells	Pulmonary Hypertension Breakthrough Initiative		this cell type is also available commercially. Cells used at passage 1-4
primary human pulmonary pericytes	Pulmonary Hypertension Breakthrough Initiative		this cell type is not available commercially, but brain paricytes are.  Cells used at passage 1-4
bFGF (basic Fibroblast Growth Factor)	Peprotech	100-18B	stock solution is 50 μg/ml in 0.1% BSA in PBS, aliquots at 50 μl and stored at -20 degrees
Matrigel Basement Membrane Matrix	BD	356237
28 G 1 cc Insluin Syringe	BD	329410
SCID (Severe Combined Immune Deficiency) mice	The Jackson Laboratory	5557	NOD.SCID IL2R gamma knockout strain is the best strain; 4-6 weeks of age
1.5 ml microcentrifuge tubes, sterile	Thermo Fisher Scientific	05-408-129
15 ml screw top tubes, sterile	BD Biosciences	352096
PAP pen	Life Technologies	8899
hemocytometer	ThermoFisher Scientific	02-671-6
Nair hair removal cream	Walmart
anti-human CD31 primary antibody	LifeSpan Biosciences	LS-B4737	working solution is 1:50
anti-human Smooth Muscle actin CY3 primary fluorescent antibody	Sigma	C6198	working solution is 1:300
goat anti-rabbit secondary antibody; 488/green	ThermoFisher Scientific	A-11008	working solution is 1:250
Prolong Gold DAPI solution	Cell Signaling	8961S
microscope slides	VWR	48300-047
no. 1.5 cover slips	Thermo Fisher Scientific	12-544-D
citrate buffer 10x	Millipore	21545
extra fine surgical scissors	Fine Science Tools	14084-08
Formalin (paraformaldehyde)	Thermo Fisher Scientific	245-685
Tissue cassettes	Simport	M492-12
goat serum	Dako	X0907