마우스의 매트릭스 젤 플러그 분석을 사용하여 인간의 내피 - 주연 세포 상호 작용의 생체 내 연구에

요약

우리는 매트릭스 겔 플러그 혈관 분석의 변형을 사용하여 마우스에서의 인간 내피 주연 세포의 상호 작용을 연구하는 프로토콜을 제시한다.

초록

Angiogenesis is the process by which new blood vessels are formed from existing vessels. New vessel growth requires coordinated endothelial cell proliferation, migration, and alignment to form tubular structures followed by recruitment of pericytes to provide mural support and facilitate vessel maturation. Current in vitro cell culture approaches cannot fully reproduce the complex biological environment where endothelial cells and pericytes interact to produce functional vessels. We present a novel application of the in vivo matrix gel plug assay to study endothelial-pericyte interactions and formation of functional blood vessels using severe combined immune deficiency mutation (SCID) mice. Briefly, matrix gel is mixed with a solution containing endothelial cells with or without pericytes followed by injection into the back of anesthetized SCID mice. After 14 days, the matrix gel plugs are removed, fixed and sectioned for histological analysis. The length, number, size and extent of pericyte coverage of mature vessels (defined by the presence of red blood cells in the lumen) can be quantified and compared between experimental groups using commercial statistical platforms. Beyond its use as an angiogenesis assay, this matrix gel plug assay can be used to conduct genetic studies and as a platform for drug discovery. In conclusion, this protocol will allow researchers to complement available in vitro assays for the study of endothelial-pericyte interactions and their relevance to either systemic or pulmonary angiogenesis.

서문

혈관 신생은 새로운 혈관이 정상 개발 관련 질병에 이르기까지 다양한 분야에 걸쳐 지속적인 연구의 초점을 기존의 혈관 망 ^(1)로 형성하고있다하는 과정이다. 이 역동적 인 과정은 증식과 혈관 내피 세포되는 EC () 및 산소와 영양 ^{공급이 필요합니다} 사이트 향하는 혈관 튜브를 구성하는 혈관 주위 세포의 모집의 이동을 포함한다. 이 프로세스는 동일 동적 분석, 관 형성의 3 차원 성질 요점을 되풀이 할 가장 중요한 하나가 필요보고자. 시험관 차원 매트릭스 분석이 요구를 충족하기 위해 개발되어 연구자 혈관 제자리 ^{3, 4, 5, 6 소요되는} 시간과 공간에서의 개별 단계를 정의 할 수 있도록 잘 작동 하였다. 그러나, 이러한 시험 관내 3D 행렬 모델은 비 혈관 관류 공부에 한정D 따라서 혈관 신생 과정과 관련된 중요한 구성 요소 부족 (예를 들어, 혈관 침대에서 성장 및 저해 요인, 자연스러운 긴장 / 힘을 순환) 라이브 조직에 존재하는 복잡한 환경을 시뮬레이션하는 데 실패합니다. 이러한 한계를 해결하기 위해 여러 가지의 생체 내 혈관 신생 어 세이가 우리 보고서 ^{(8, 9)의} 초점이 될 매트릭스 겔 플러그 분석 포함 ⁷ 개발되었다.

매트릭스 겔 플러그 분석은 혈관 신생에 다른 세포 물질의 역할을 테스트하기위한 강력한 플랫폼을 제공하기 때문에 연구자 호소 잘 확립 된 생체 내 혈관 신생 어 세이이다. 매트릭스 겔을 37 ℃에서 겔과 같은 물질로 고형화 Engelbreth-Holm이 - 스웜 (EHS) 마우스 육종 세포주에 의해 분비 된 시판 기저막 솔루션이다. 매트릭스 겔 같은 성장 인자와 같은 인제 세포 및 / 또는 물질과 혼합 될 수있다마우스에 피하 cted. 호스트되는 EC는 14 일 동안 플러그를 침공 혈관 네트워크를 형성하고, 호스트의 혈액 관류 될 것입니다. 현재까지, 매트릭스 겔 플러그 분석이 분석은에 공동 문화 내피 세포와 혈관 주위 세포를 사용할 수 있는지 여부를 결정하기 위해 노력은 아직하지 않았습니다 우리가 아는 한, 그러나, 혈관 신생 동안 내피 세포 행동의 연구에 독점적으로 초점을 맞추고있다 이 두 종류의 세포가 혈관 신생 동안 상호 작용하는 방법을 연구한다. 특히, 내장 컴퓨터와 주연 세포 간의 관계를 이해하는 것은 미세 혈관 허혈 및 말초 혈관 질환을 ^{10, 11, 12을} 포함한 혈관 손실 병적 인 질환을 연구하는데 유용하다.

여기에서는 인간의 EC 및 섬유 아세포 성장 인자 (bFGF)와 함께 매트릭스 겔 혼합물에 인간 유래 혈관 주위 세포를 도입하는 프로토콜을 기술한다. 이 혼합물을 내가 피하 주입 될 수있다n은 SCID 마우스의 배부는 완전한 기능을, 주연 세포 코팅, 하이브리드 혈관의 형성을 허용합니다. 우리의 프로토콜 또는 SCID 마우스 및 방법 중요한 혈관 신생 엔드 포인트에 대한 조직 학적 섹션을 분석하는 방법으로 인간의 혈관 주위 세포, 배치하지 않고 두 사람의 EC를 포함하는 매트릭스 겔 플러그를 준비하는 방법에 대해 설명합니다.

프로토콜

윤리 정책 : 동물 과목을 포함하는 절차는 의학의 스탠포드 대학에서 기관 애니멀 케어 및 사용위원회에 의해 승인되었습니다.

주 : 동물은 3 % 이소 플루 란 기화기와 O ₂ 가스의 3 % 공급 마취하에. 눈에 수의사 연고의 사용은 마취 상태에서 건조를 방지하는 데 도움이 될 수 있습니다.

1. 셀 준비

1. 적절한 용지의 10 ml의 100mm 판에 인간의 내피 세포와 혈관 주위 세포 문화를 성장. 세포까지 삼일 80 % 포화 상태에 도달 - 매 2는 새로운 배지 10 ㎖를 교체합니다.
   1. 회사 보충 완전한 내피 세포 배지 (ECM)에서 배양 된 혈관 내피 세포 (EC에)는 5 % 소 태아 혈청 (FBS), 10 % 페니실린 / 스트렙토 마이신 및 10 %의 내피 세포 성장 보충 공급된다.
   2. 회사 전체 주연 세포 보충 미디어 (PM)에서 배양 혈관 주위 세포는 2 % FBS, 10 % 페니실린 / 스트렙토 마이신 및 10 % 주연 세포 성장 보충 공급된다.
2. 세포 혼합물을 준비
   1. 실험 및 제어 그룹에 대한 세포의 필요한 수를 계산합니다.
      참고 : 실험 그룹의 각 플러그는 백만 (× 10 ⁶ 1) 인간되는 EC 및 이십만 (2 × 10 ⁵⁾ 혈관 주위 세포가 포함되어 있습니다. 대조군의 경우, 각 플러그는 120 만 인간되는 EC 만 포함되어 있습니다. 음성 대조군은 기질 겔만을 갖는다. 각 그룹은 플러그가 마우스의 허리의 양쪽에 주입 될 수있는 두 개의 마우스를 필요 최소한 네 개의 플러그를 포함한다. 세 개의 플러그는 실험 중으로 역할 것이며, 네 번째는 하나가 실패 할 경우에 사용될 수있다. 젤의 여분의 볼륨에 맞게 25 % 추가 세포를 준비합니다.
   2. 수집 및 배양 접시에서 세포를 계산합니다.
      1. 세포를 분리하려면, 미디어를 제거하고 실내 온도 1 배 인산 완충 식염수 (PBS)로 한 번 씻는다. , PBS를 제거 1 ml의 0.25 % 트립신 / 2.21 mM의 EDTA를 추가하고, 1 분 동안 품어. (2)를 추가하여 플레이트 떨어져 세포를 씻으ML의 중간 15 ML 튜브에 수집합니다.
      2. 제조업체의 지침에 따라 혈구를 사용하여 셀을 계산합니다.
      3. 5 분 동안 400 XG에서 펠릿으로 세포의 적절한 수를 원심 분리기. 실험 그룹, 원심 분리되는 EC 아래로 함께 한 펠렛으로 혈관 주위 세포 모두에 대해.

2. 매트릭스 젤 준비

1. 4 시간 또는 균질 용액을 수득 밤새 4 ℃에서 완전히 겔 매트릭스를 해동. 아니 혼합이 필요하지 않습니다.
2. 4 ° C에서 나누어지는 매트릭스 1.5 ml의 튜브 젤 및 저장.
3. 사전 진정 멸균 1.5 ml의 튜브와 4 ℃에서 28 G 1 cc의 인슐린 주사기. 주의 : 항상 얼음에 매트릭스 젤을 유지합니다.
4. 부피비 1 bFGF를 차가운 매트릭스 겔 믹스 : 100 (bFGF를 최종 농도 = 0.5 μg의 / ml의 bFGF를는 원액 =를 50㎍ / ml)로 수회를 피펫 팅 상하로 매트릭스 겔 용액을 혼합 한 후, 얼음에 부화 60 분 B - 30는 efore 단계 3.1에서 세포와 혼합.
   참고 : 혼합하기 전에 주식의 bFGF를 해동. 주입에 필요한 플러그의 수를 계산합니다. 예를 들어, 각 플러그 200 μL 매트릭스 겔을 필요로한다. 따라서, 25 % 추가 젤을 준비합니다.

세포 3. 믹스 매트릭스 젤

1. 각 그룹에 대해, bFGF를 함유 매트릭스 겔의 부피 계산 (적합한 세포 수를 포함) 세포 펠렛을 재현 탁. 거품을 방지하고 쥐가 주입을 위해 준비 될 때까지 얼음에 15 ML 튜브에두고 가볍게 섞는다.

4. 마우스 준비

1. 유도 챔버에서 3 % 아이소 플루 란에서 5 분 플러스 3 % O ₂ 1 SCID 마우스를 마취. 한 번에 하나의 실험 그룹 또는 2 마우스에 초점을 맞 춥니 다.
2. 다운 가열 패드 복부 측의 유도 챔버로부터 발생 마우스를 제거하고 신속 인제 걸쳐 마취를 공급하는 비 호흡 낭 시스템을 통해 마우스의 얼굴에 주둥이 노즐 부착ction 절차. 비 호흡 낭 시스템으로 유도 챔버에서 가스 흐름을 전환하여 1.5 % 아이소 플루 란 1.5 % O ₂ 가스 압력을 낮출.
3. 면도기 나 헤어 제거 크림 (1cm 직경 약) 두 측면 뒷 영역에서 머리를 제거합니다.
4. 70 % 알코올 패드로 피부 부위를 닦아주십시오.
5. 유도 챔버에 마우스를 반환하고 반복 4.2 단계 - 4.4 두 번째 마우스.

5. 매트릭스 젤 주입

1. 비 호흡 낭 시스템에 연결하고 아래로 가열 패드 복부 측면에 배치하여 주사 한 마우스를 준비합니다.
2. 한 번에 미리 냉장 28 G 1 cc의 인슐린 주사기 하나의 마우스로 매트릭스 젤을로드합니다.
   1. 주사기에 두 개의 플러그 (200 플러그 당 μl의 플러스 25 % 추가)에 대한 매트릭스 젤의 전체 500 μl의 볼륨을로드합니다.
   2. 확인 세륨을 방지하기 위해 주사기로 세포를 로딩 3 분 이내에 쥐에 매트릭스 겔을 주입해야주사기의 측면에 고정되고 주사기 내부 고화 매트릭스 겔을 방지 내지 LLS.
3. 다음, 피하 공간을 찾아 흉곽의 뒷면 후방의 피하 공간으로 천천히 고르게 매트릭스 젤의 200 μl를 주입하기 위해 다시 피부를 들어 올립니다.
4. 주사 부위에서 누출 매트릭스 겔 않도록주의하면서 천천히 주사 바늘을 제거합니다. 범프는 주사 부위에서 형성된다. 알코올 솜으로 주사 부위를 닦아주십시오.
5. 1 분은 열 패드의 매트릭스 겔의 겔화를 허용하는 다음의 뒷면에 마우스를두고 마우스의 뒷면의 반대편에 5.5 - 반복 주입은 5.2 단계를 반복합니다.
6. 십사일 후 범프를 식별하기 위해 영구 마커를 사용하여 두 범프 개요. 일부 머리 위로 성장 후에, 범프를 쉽게 찾을 수있을 것이다.

6. 매트릭스 젤 플러그 분리 : 14 일 주입 후

1. 동물을 인도적으로 노출시켜 마우스를 안락사죽음을 보장하기 위해 자궁 경부 전위 다음 이산화탄소 흡입> 5 분에.
2. 마우스의 뒷면에서 매트릭스 겔 플러그를 제거합니다.
   1. 조심스럽게 플러그가 4.3 단계를 반복하여있는 주사 부위 주변 재성장 머리를 제거합니다. 마커 라인 피부 아래 원래 범프의 크기를 나타낸다.
   2. 각각 플러그의 상부 및 하부 측면 상에 장착 된 주변 피부와 근육 층과 함께 플러그를 절제.
      1. 미세 수술 가위를 사용하여 피부에 수직 인 플러그의 뚜렷한 경계에 절개를하고, 플러그 아래 근육의 실수. 그리고, 신중 표시된 테두리를 따라 플러그의 둘레 잘랐다.
      2. 그것은 피부와 근육 층 사이에 끼워 유지, 플러그를 제거합니다. 즉시 여분의 피를 씻어 1X PBS와 작은 비커에 헹군다. 플러그 (다음 단계, 6.3)는 이제 해결 될 준비가되어 있습니다.
3. PLU 수정4 % 파라 포름 알데히드에서 g.
   1. 요동없이 실온에서 24 시간 동안 4 % 파라 포름 알데히드의 25 ㎖와 50 ㎖ 튜브에서 피부와 근육 층을 포함하는 전체 플러그 두지. 다음날, 파라핀 매립하기 전에 또 다른 24 시간 동안 70 % 에탄올 25 ㎖에 플러그를 옮긴다.
      참고 :주의 파라 포름 알데히드를 처리합니다. 장갑을 착용 할 것.

7. 파라핀 프로세스 매트릭스 젤 플러그

1. 파라핀 삽입의 플러그를 준비합니다.
   1. 도 1a에 도시 된 바와 같이 플러그의 방향; 플러그의면이 위를 향하게되고, 모두 피부와 근육 층 절편 중 첫번째 절단 될 조직 블록의 표면을 볼 수 있도록 조직 카세트에 플러그를 배치했다.
2. 파라핀 파라핀 매립 표준 프로토콜 ^13에 따라 플러그를 삽입.
3. 현미경 코르 슬라이드에 조직 블록 떨어져 10 μm의 두께 섹션 및 마운트 - 8 컷표준 파라핀 절편 프로토콜 ¹³ 땡.
4. 염색에 대한 준비가 될 때까지 실온에서 시원하고 건조한 장소에 슬라이드를 저장합니다.

헤 마톡 실린 및 에오신 얼룩 (H & E) 8. 얼룩 섹션 ⁽¹³⁾

1. 회 100 % 크실렌으로 슬라이드를 전달하여 조직 절편을 드 - paraffinize, 100 % 에탄올, 95 % 에탄올, 70 % 에탄올, 마지막 1X PBS, 실온에서 5 분간 각. 다음 단계까지 1X PBS에서 슬라이드를 둡니다.
2. 피펫 100 μL H & E 섹션 상 용액 1 부화 - 5 분, 또는 10 배 배율로 수직 광 현미경으로 볼 때 셀에 파란색 핵와 핑크 세포질 사이의 명확한 대비가있을 때까지. 어떤 H & E 솔루션은 목표에 닿지 않도록주의하십시오.
3. 수돗물의 큰 비이커 슬라이드 덩크하여 슬라이드 씻어 H & E 용액 후 비커 랙에 슬라이드를 넣고 2 분 동안 흐르는 물에 세척 할.
4. 모슬라이드 마운트 9.8 단계했습니다.

인간의 모세 혈관과 혈관 주위 세포 9. 얼룩 다른 슬라이드

1. 회 100 % 크실렌으로 슬라이드를 전달하여 조직 절편을 드 - paraffinize, 100 % 에탄올, 95 % 에탄올, 70 % 에탄올, 마지막 1X PBS, 실온에서 5 분간 각. 다음 단계까지 1X PBS에서 슬라이드를 둡니다.
2. 항원 검색 솔루션의 섹션을 끓인다.
   1. 2 L의 비이커에서, 가열 블록에 95 ° C에서 항원을 검 용액 1X 시트르산 완충액을 사용하여 (PH 7.0) 끓는 제조.
   2. 비등하면, 금속 랙에 슬라이드를 넣고 20 분 동안 끓는 항원 검색 용액에 잠기.
   3. 조심 여전히 잠겨 슬라이드와 가열 블록의 비이커를 제거하고 용액을 서서히 약 30 분 동안 실온으로 복귀 할 수있다.
   4. 다음 단계까지 1X PBS에서 슬라이드를 놓습니다.
3. 블로킹 완충액의 섹션 (1X PBS, 5 % 염소 혈청 0 차단0.3 % 트리톤 X-100).
   1. 팹 펜으로 각 섹션의 가장자리 주위에 소수성 원을 그립니다.
   2. 트레이 하단에 증류수와 습도 트레이에 슬라이드를 놓습니다.
   3. 확인 모든 조직으로 만드는 부분 상에 피펫 100 μl를 차단 버퍼가 유체에 의해 덮여있다 (이상 100 μl를 요구할 수있다).
   4. 1 시간 동안 버퍼를 차단하여 섹션을 품어.
4. 일차 항체와 섹션을 품어.
   1. CD31되는 EC ()와 희석액에 희석 평활근 액틴 (혈관 주위 세포)에 대한 각 섹션 (1X PBS, 1 % BSA, 0.3 %는 트리톤 X-100)를 조사하기 위해 두 개의 일차 항체와 하나의 솔루션을 준비합니다.
      참고 : 여기, 항 CD31 농도 1:50이며, 안티 - 평활근 액틴 농도는 1 : 300.
   2. 하룻밤 증류수를 포함하는 습도 트레이에 100 ㎕의 일차 항체 4 ° C에서 섹션을 품어.
5. 1X PBST (1X PBS + 0.1 % TWE에서 슬라이드를 세 번 씻으5 분마다 세척을위한 EN20).
6. 차 항체와 섹션을 품어.
   1. 희석액에 희석 항 CD31 토끼 항체를 인식하는 형광 결합 염소 항 - 토끼 이차 항체 용액을 준비한다.
      1. 참고 : 평활근 액틴 차 항체가 이미 CY3의 형광 물질과 결합되어, 그래서 차 항체 염색이 필요하지 않습니다. 250 : 염소 안티 토끼 차 항체 농도는 1입니다.
   2. 증류수가 들어있는 습도 트레이에 100 μL 차 항체와 1 시간 동안 섹션을 품어.
7. 5 분마다 세척을 위해 1X PBST에서 슬라이드를 세 번 씻으십시오.
8. 슬라이드를 탑재합니다.
   1. 각 섹션 상에 DAPI 핵 염색 antifade 장착 솔루션의 - (60 μL ~ 40) - 피펫 2 3 방울.
   2. 조심스럽게 노를 놓습니다. 유체가 섹션을 통해 확산 할 수 있도록 섹션 및 설치 솔루션, 이상과의 가장자리에 1.5 커버 슬립커버 슬립. 조심스럽게 섹션 위에 위치 할 수있다 기포를 눌러 손가락을 사용합니다.
   3. 슬라이드가 취급하기 전에 최소 1 시간 동안 건조 시키십시오.

10. 정량화 모세관 밀도 및 구조 ⁽¹⁴⁾

1. H & E 염색 절에 모세 혈관의 수를 계산, # / mm ^2로 표시됩니다.
   1. 40X 배율에서 직립 광학 현미경에 네 가지 분야의 사진을 획득.
      참고 : 모세 혈관은 적혈구 가득 튜브로 식별됩니다.
   2. 대안 적으로, 수동으로 계산하는 대신 모세 혈관 등 혈관 수 평균 용기의 길이와 직경과 분기점 각종 혈관 변수 정량화 이미지 분석 소프트웨어 (예 Wimasis 이미지 분석)을 사용한다.
2. 면역 염색 섹션 모세관 구조를 분석.
   1. 거꾸로 형광 현미경에 네 가지 분야의 사진을 획득FITC와 TxRed 필터 큐브.
      1. 488 nm 파장에서 여기로 이미지되는 EC에 FITC 큐브를 사용하여 594 nm 파장에서 여기로 이미지 혈관 주위 세포에 TxRed 큐브를 사용합니다.

결과

매트릭스 겔 플러그 부분의 대표 H & E 및 면역 염색은 플러그가 대부분 포함 플러그 반면 혈액 (왼쪽 그림 2 위에, 검은 색 화살표)를 관류되지 않는 일부 선박되는 EC 및 혈관 주위 세포가 모두 관류 여러 표시를 표시 EC에서 그림 2. 섹션을 표시됩니다 CD31 양성되는 EC 바로 옆에 긍정적 인 SMA 염색에 의해 입증 직경이 크고 완전한 주연 세포의 범?...

토론

매트릭스 겔 플러그 분석은 혈관 신생, 혈관 신생 및 생체 내 혈관 형성 화합물의 유전자 조절을 평가하기 위해 시험 관내 테스트를 보완하기 위해 더욱 강력한 방법으로 입증되었다. 여기서는 상세히 용기 형성시 내피 세포와 주연 세포 간의 상호 작용을 조사 인간 혈관의 신규 매트릭스 겔 플러그 어 세이를 기술한다.

이 프로토콜에 몇 가지 새롭고 중요한 단?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
PBS (Phosphate buffered saline)	Corning	21-031-CV
0.25% Trypsin/0.53 mM EDTA	Corning	25-053-CI
Endothelial Cell Media (ECM) kit	Sciencell	1001	includes media, EC growth supplement, and penicillin/streptomycin, each supplied at the appropriate volume for easy mixing
Pericyte Media (PM) kit	Sciencell	1201	includes media, Pericyte growth supplement, and penicillin/streptomycin, each supplied at the appropriate volume for easy mixing
primary human pulmonary microvascular endothelial cells	Pulmonary Hypertension Breakthrough Initiative		this cell type is also available commercially. Cells used at passage 1-4
primary human pulmonary pericytes	Pulmonary Hypertension Breakthrough Initiative		this cell type is not available commercially, but brain paricytes are.  Cells used at passage 1-4
bFGF (basic Fibroblast Growth Factor)	Peprotech	100-18B	stock solution is 50 μg/ml in 0.1% BSA in PBS, aliquots at 50 μl and stored at -20 degrees
Matrigel Basement Membrane Matrix	BD	356237
28 G 1 cc Insluin Syringe	BD	329410
SCID (Severe Combined Immune Deficiency) mice	The Jackson Laboratory	5557	NOD.SCID IL2R gamma knockout strain is the best strain; 4-6 weeks of age
1.5 ml microcentrifuge tubes, sterile	Thermo Fisher Scientific	05-408-129
15 ml screw top tubes, sterile	BD Biosciences	352096
PAP pen	Life Technologies	8899
hemocytometer	ThermoFisher Scientific	02-671-6
Nair hair removal cream	Walmart
anti-human CD31 primary antibody	LifeSpan Biosciences	LS-B4737	working solution is 1:50
anti-human Smooth Muscle actin CY3 primary fluorescent antibody	Sigma	C6198	working solution is 1:300
goat anti-rabbit secondary antibody; 488/green	ThermoFisher Scientific	A-11008	working solution is 1:250
Prolong Gold DAPI solution	Cell Signaling	8961S
microscope slides	VWR	48300-047
no. 1.5 cover slips	Thermo Fisher Scientific	12-544-D
citrate buffer 10x	Millipore	21545
extra fine surgical scissors	Fine Science Tools	14084-08
Formalin (paraformaldehyde)	Thermo Fisher Scientific	245-685
Tissue cassettes	Simport	M492-12
goat serum	Dako	X0907