In vivo לחקר האדם האנדותל-pericyte אינטראקציה באמצעות assay Plug מטריקס ג'ל עכבר

Summary

אנו מציגים פרוטוקול ללמוד אינטראקציות אנדותל-pericyte אדם העכבר באמצעות וריאציה של assay אנגיוגנזה תקע ג'ל מטריקס.

Abstract

Angiogenesis is the process by which new blood vessels are formed from existing vessels. New vessel growth requires coordinated endothelial cell proliferation, migration, and alignment to form tubular structures followed by recruitment of pericytes to provide mural support and facilitate vessel maturation. Current in vitro cell culture approaches cannot fully reproduce the complex biological environment where endothelial cells and pericytes interact to produce functional vessels. We present a novel application of the in vivo matrix gel plug assay to study endothelial-pericyte interactions and formation of functional blood vessels using severe combined immune deficiency mutation (SCID) mice. Briefly, matrix gel is mixed with a solution containing endothelial cells with or without pericytes followed by injection into the back of anesthetized SCID mice. After 14 days, the matrix gel plugs are removed, fixed and sectioned for histological analysis. The length, number, size and extent of pericyte coverage of mature vessels (defined by the presence of red blood cells in the lumen) can be quantified and compared between experimental groups using commercial statistical platforms. Beyond its use as an angiogenesis assay, this matrix gel plug assay can be used to conduct genetic studies and as a platform for drug discovery. In conclusion, this protocol will allow researchers to complement available in vitro assays for the study of endothelial-pericyte interactions and their relevance to either systemic or pulmonary angiogenesis.

Introduction

אנגיוגנזה הוא התהליך שבו כלי דם חדשים נוצרים מרשת וסקולרית קיים ¹ והוא במוקד מחקר המתמשך על פני תחומים רבים, החל התפתחות תקינה למחלות. תהליך דינאמי זה כרוך ההתפשטות וההגירה של תאי האנדותל (EC) וגיוס pericytes לבנות צינור כלי דם כי היא מכוונת כלפי האתר שצריך העברת חמצן וחומרי הזנה ^2. כדי ללמוד את התהליך הזה דורש assay דינמית לא פחות, והכי חשוב אחד שיכול לשחזר את הטבע תלת ממדי של היווצרות צינור. במבחנת מבחני מטריקס 3D פותחו כדי לתת מענה לצורך הזה עבדו היטב על מנת לאפשר לחוקרים לקבוע את הצעדים הבדידים במרחב ובזמן שבו אנגיוגנזה מתקיים ^{3, 4, 5, 6.} עם זאת, מודלים מטריקס במבחנה 3D אלה מוגבלים ללימוד כלי הלא perfusedד ולכן הם חסרים רכיבים קריטיים רלוונטיים לתהליך אנגיוגנזה (למשל, במחזור צמיחה וגורם מעכבים, מתח טבעי / כוחות לרוחב מיטת כלי הדם) ולא מצליח לדמות את הסביבה המורכבת נוכח רקמת חיים. כדי לטפל מגבלה זו, כמה in vivo מבחני אנגיוגנזה פותחו ^7, כולל assay תקע מטריקס ג'ל אשר יהיה המוקד של הדו"ח שלנו ^{8, 9.}

את assay תקע ג'ל מטריקס הוא assay אנגיוגנזה ומבוסס in vivo שמושך חוקר כפי שהוא מספק פלטפורמה יציבה על מנת לבחון את התפקידים של תאים וחומרים שונים אנגיוגנזה. ג'ל מטריקס הוא פתרון קרום במרתף זמין מסחרי כי מופרש על ידי Engelbreth-הולם-הנחיל (EHS) שורת תאי סרקומה עכבר מבצרת לחומר דמוי ג'ל על 37 מעלות צלזיוס. הג'ל מטריקס ניתן לערבב עם תאים ו / או חומרים, כגון גורמי גדילה, ו Injected מתחת לעור לתוך העכבר. מארח ECS יפלוש התקע למעלה מ -14 ימים, יוצר רשת כלי דם, ולהפוך להיות perfused עם של דם המארח. נכון להיום, מבחני תקע ג'ל מטריקס התמקדו אך ורק על חקר התנהגות תא האנדותל במהלך אנגיוגנזה, עם זאת, למיטב ידיעתנו לא נעשה מאמץ עדיין לקבוע אם assay זה יכול לשמש כדי תאי האנדותל שיתוף תרבות pericytes ללמוד כיצד סוגי תאים אלה שני אינטראקציה במהלך אנגיוגנזה. באופן ספציפי, הבנת הקשר בין ECS ו pericytes היא בעל ערך לחקר מחלות שבו אובדן כלי דם הוא פתולוגי, כולל איסכמיה כלי דם ומחלות היקפיות וסקולרית ^{10, 11, 12.}

כאן אנו מתארים פרוטוקול מציג pericytes נגזרות האנושיות לתערובת ג'ל מטריקס יחד עם ECS האדם גורם גדילה פיברובלסטים (bFGF). תערובת זו לאחר מכן ניתן מוזרק מתחת לעור in את dorsum של עכברי SCID כדי לאפשר היווצרות של מצופית מתפקד במלואה, pericyte, כלי היברידי. הפרוטוקול שלנו מתאר כיצד להכין אטמי ג'ל מטריקס המכילים ECS אדם עם או בלי pericytes האנוש, שם לעכברי SCID וכיצד לנתח את הסעיפים היסטולוגית עבור נקודות קצה אנגיוגנזה קריטיות.

Protocol

משפט ואתיקה: הנהלים הקשורים בנושאים בעלי חיים אושרו על ידי טיפול בבעלי חיים מוסדיים ועדת השתמש בבית הספר לרפואה של אוניברסיטת סטנפורד.

הערה: בעלי חיים נמצאים תחת הרדמה עם 3% מאדה isoflurane ו -3% באספקת הגז O _2. שימוש במשחת וטרינר על עיניים על מנת למנוע יובש לאחר הרדמה.

1. תא הכנה

1. לגדול תא האנדותל pericyte אדם תרבויות 100 צלחות מ"מ עם 10 מיליליטר של המדיה המתאימה. החלף 10 מ"ל של מדיום חדש כל 2 - 3 ימים עד התאים מגיעים 80% confluency.
   1. תאי האנדותל תרבות (ECS) בתקשורת תא שלם האנדותל (ECM) השלימו עם סיפקה החברה בסרום שור העובר 5% (FBS), 10% פניצילין / סטרפטומיצין ו -10% תוספת צמיחה תא האנדותל.
   2. pericytes תרבות בתקשורת pericyte מלאה (PM) השלימו עם סיפקה החברה 2% FBS, 10% פניצילין / סטרפטומיצין ו תוספת צמיחה pericyte 10%.
2. הכן תערובות תא
   1. לחשב את המספר הדרוש של תאים עבור קבוצות ניסוי ובקרה.
      הערה: תקע כל בקבוצת הניסוי מכיל כמיליון (1 x 10 ⁶⁾ אדם ECS ומאתיים אלף (2 x 10 ⁵⁾ pericytes. עבור קבוצת הביקורת, כל תקע מכיל 1.2 מיליון ECS אדם בלבד. קבוצת הביקורת השלילית יש ג'ל מטריקס בלבד. כל קבוצה צריכה לכלול לפחות ארבעה תקעים, אשר ידרשו שני עכברים כמו אטמים ניתן להזריק לתוך מכל צד של גב התחתון של עכבר. שלושה תקעים ישמשו בשלושה עותקים עבור הניסוי ואת הרביעי יכול לשמש במקרה אחד נכשל. כן 25% תאים עודפים כדי להתאים את עוצמת קול התוספת של ג'ל.
   2. אסוף ולספור תאי צלחות תרבות.
      1. כדי לנתק תאים, להסיר התקשורת ולשטוף פעם עם בופר פוספט 1x בטמפרטורת החדר (PBS). הסר PBS, להוסיף 1 מ"ל 0.25% טריפסין / 2.21 mM EDTA, דגירה של 1 דק '. שטפו תאים מהצלחת על ידי הוספת 2בינוני מ"ל ולאסוף בתוך שפופרת 15 מ"ל.
      2. ספירת תאים באמצעות hemocytometer על פי הוראות היצרן.
      3. צנטריפוגה את המספר המתאים של תאים לתוך גלולה ב 400 XG במשך 5 דקות. עבור קבוצה, צנטריפוגות ניסיוני הוא ECS ו pericytes למטה ביחד לתוך גלולה אחת.

2. מטריקס ג'ל הכנה

1. להפשיר ג'ל מטריקס לחלוטין על 4 מעלות צלזיוס למשך 4 שעות או למשך הלילה כדי להשיג פתרון הומוגני. אין ערבוב נדרש.
2. ג'ל מטריקס Aliquot ב 1.5 מ"ל צינורות ולאחסן ב 4 מעלות צלזיוס.
3. טרום צמרמורת סטרילי 1.5 מיליליטר צינורות 28 מזרקי אינסולין סמ"ק G 1 ב 4 ° C.. זהירות: שמור ג'ל מטריקס על הקרח בכל עת.
4. מערבבים ג'ל מטריקס קר עם bFGF ביחס נפח של 1: 100 (הריכוז הסופי של bFGF = 0.5 מיקרוגרם / מ"ל; bFGF פתרון המניות = 50 מיקרוגרם / מ"ל) לאחר ערבוב הפתרון ג'ל מטריקס על ידי pipetting למעלה ולמטה מספר פעמים, דגירה על קרח עבור 30 - 60 דק 'בefore ערבוב עם תאים בשלב 3.1.
   הערה: להפשיר את מניית bFGF לפני הערבוב. לחשב את המספר ותקעים הנחוצים להזרקה. לדוגמה, כל תקע דורש 200 ג'ל מטריקס μl. לכן, להכין 25% ג'ל נוסף.

3. ג'ל מטריקס מערבבים עם תאים

1. עבור כל קבוצה, resuspend התא הגלול (המכיל מספר תאים מתאים) עם הנפח המחושב של ג'ל מטריצה ​​המכיל bFGF. מערבבים בעדינות כדי למנוע הקצפה ולהשאיר בצינור 15 מ"ל על הקרח עד עכברים מוכנים להזרקה.

4. הכנת עכבר

1. להרדים 1 עכברי SCID במשך 5 דקות ב 3% Isoflurane בתוספת 3% O ₂ בתא אינדוקציה. להתמקד בקבוצה אחת ניסיוני, או 2 עכברים, בכל פעם.
2. הסר את העכבר מהאולם אינדוקציה, מניחים על הצד הגחוני כרית חימום למטה ובמהירות לצרף זרבובית חוטם אל פניו של העכבר באמצעות מערכת שלטונית לא rebreathing לספק הרדמה ברחבי Injeהליך ction. לעבור את זרימת הגז לתא אינדוקציה למערכת הלא rebreathing ולהפחית את לחץ הגז ל -1.5% Isoflurane ו -1.5% O _2.
3. הסרת שיער מאזורים האחוריות וצידית (בסביבות 1 ס"מ קוטר) עם קרם להסרת גילוח או שיער.
4. נגב את אזור העור עם כרית אלכוהול 70%.
5. החזר את העכבר לתא אינדוקציה וחזור על שלבים 4.2 - 4.4 עם העכבר השני.

הזרקת מטריקס ג'ל 5.

1. הכן עכבר אחד להזרקה על ידי הצמדת למערכת הלא rebreathing והצבת בצד הגחון כרית חימום למטה.
2. טען את הג'ל מטריקס לעכבר אחד מזרק אינסולין מראש צונן 28 G 1 סמ"ק בכל פעם.
   1. טען את הג'ל 500 μl הנפח של מטריקס המלא ל שני תקעים (200 μl לכל תקע בתוספת 25% תוספת) לתוך המזרק.
   2. הקפד להזריק את ג'ל מטריקס לתוך העכברים בתוך 3 דקות של טעינה את התאים לתוך המזרק כדי למנוע ceLLS מלהתיישב לצד של המזרק כדי למנוע ג'ל מטריקס מן לחיזוק הפנימי של מזרק.
3. הרם את העור בחזרה לאתר שטח תת עורית, ואז מזריקים 200 μl של ג'ל מטריצה ​​לאט ובאופן שווה לחלל תת עורית של האחורי האחורי של כלוב הצלעות.
4. הסר את מחט הזריקה לאט, נזהר למנוע ג'ל מטריקס ייזל החוצה של הזריקה. בליטה תהווה באתר הזרקה. נגב זריקה עם כרית אלכוהול.
5. הזרקה חוזר על שלבי 5.2 - 5.5 ביום הצד השני של גביו של העכבר, ולאחר מכן לעזוב את העכבר על גבית עבור 1 דקות כדי לאפשר gelation של ג'ל מטריקס על המשטח החום.
6. מתאר הן בליטות באמצעות סמן קבע לזהות גבשושית לאחר 14 ימים. לאחר כמה שיער צומח בחזרה, זה יהיה קל יותר למצוא את הבליטה.

6. בידוד מטריקס ג'ל הכנס: 14 ימים לאחר ההזרקה

1. להרדים את העכברים בצורה אנושית על ידי חשיפת החיהs ל> 5 דקות של שאיפת פחמן דו חמצני ואחריו נקע בצוואר הרחם כדי להבטיח מוות.
2. הסר את תקע ג'ל מטריקס מן גב העכבר.
   1. בעדינות להסיר שיער שצמח סביב זריקה שבו התקע ממוקם על ידי חזרה על שלב 4.3. השורה סמן מציינת את הגודל של בליטה המקורית מתחת לעור.
   2. ובלו תקע יחד עם שכבות העור ושרירים שמסביב המצורפת בצדדים העליונים ותחתונים של התקע, בהתאמה.
      1. בעזרת מספרי כירורגיות בסדר, עושה חתך בגבול הניכר של התקע כי הוא בניצב העור בקע לשריר מתחת התקע. לאחר מכן, לחתוך בזהירות סביב בפריפריה של התקע לאורך הגבול המסומן.
      2. הסר את תקע, שמירה על אותה דחוקה בין שכבות העור והשרירים. מיד לשטוף בכוס קטנה עם 1x PBS כדי לשטוף דם עודף. התוספת עכשיו הוא מוכן להיות קבוע (השלב ​​הבא, 6.3).
3. תקן את plug ב paraformaldehyde 4%.
   1. חבר את תקע כולו, כולל שכבות העור והשרירים, בתוך שפופרת 50 מ"ל עם 25 מ"ל של paraformaldehyde 4% במשך 24 שעות בטמפרטורת החדר ללא נדנדה. למחרת, להעביר את התקע לשקע 25 מ"ל של אתנול 70% למשך 24 שעות לפני הטבעה פרפין.
      הערה: ידית paraformaldehyde בזהירות. יש להשתמש בכפפות.

7. תהליך פרפין הכנס ג'ל מטריקס

1. הכן את התקע להטבעת פרפין.
   1. אוריינט התקע כפי שמוצג באיור 1 א; למקם את תקע קלטת רקמות, כך שהצד של התקע פונה כלפי מעלה הוא את שכבות העור ושרירים גלויות על פני השטח של גוש הרקמה יקוצץ ראשון במהלך חתך.
2. פרפין להטביע את התקע על פי פרוטוקולי הטבעת פרפין תקן ^13.
3. חותכים 8 - 10 מיקרומטר חלקים עבים הנחה של גוש רקמות הר גבי שקופיות מיקרוסקופ אקורדינג פרוטוקולי חתך פרפין תקן ^13.
4. אחסן את השקופיות במקום קריר ויבש בטמפרטורת החדר עד מוכן מכתים.

8. סעיפים הכתם עם Hematoxylin ו Eosin הכתם (H & E) ¹³

1. דה-paraffinize בסעיפים רקמות על ידי העברת שקופיות באמצעות 100% קסילן פעמיים, 100% אתנול, 95% אתנול, 70% אתנול ולבסוף 1x PBS, כל 5 דקות בטמפרטורת החדר. השאר שקופיות 1x PBS עד לשלב הבא.
2. פתרון פיפטה 100 μl H & E על קטע דגירה במשך 1 - 5 דקות, או עד שלא יהיה ניגוד ברור בין גרעינים הכחולים הציטופלסמה ורוד בתא כפי שמוצג תחת מיקרוסקופ אור זקופה בהגדלה 10X. היזהר שלא לתת כל פתרון H & E לגעת המטרה.
3. לשטוף פתרון H & E הנחה של השקופיות על ידי טבילת השקופית בכוס גדולה של מים ברז, אז במקום להחליק במעמד בכוס ולשטוף עם מים זורמים במשך 2 דקות.
4. מוve לשלב 9.8 לעגן את השקופיות.

9. שקופיות כתם אחרות עבור נימי אדם pericytes

1. דה-paraffinize בסעיפים רקמות על ידי העברת שקופיות באמצעות 100% קסילן פעמיים, 100% אתנול, 95% אתנול, 70% אתנול ולבסוף 1x PBS, כל 5 דקות בטמפרטורת החדר. השאר שקופיות 1x PBS עד לשלב הבא.
2. מרתיח את סעיפי פתרון יחזור אנטיגן.
   1. בכוס L 2, להכין רותחים אנטיגן פתרון אחזור באמצעות חיץ ציטראט 1x (pH 7.0) בשעה 95 ° C על בלוק חימום.
   2. לאחר רותחים, מניחים את השקופיות במעמד מתכת לצלול הפתרון אחזור אנטיגן רתיחה במשך 20 דקות.
   3. מוציא בזהירות את הכוס מגוש החימום עם המגלשות עדיין שקועות ולאפשר הפתרון לחזור לאט לטמפרטורת חדר למשך כ -30 דקות.
   4. מניחים את השקופיות ב 1x PBS עד לשלב הבא.
3. חסום את סעיפים בחסימת המאגר (PBS 1x, 5% עיזים סרום, 0.3% Triton X-100).
   1. צייר עיגול הידרופובי סביב הקצוות של כל קטע עם עט PAP.
   2. מניחים את השקופיות מגש לחות עם מים מזוקקים בתחתית המגש.
   3. חיץ חסימת פיפטה 100 μl על הסעיפים מוודאים כל הרקמה מכוסה על ידי נוזל (עשוי להזדקק ליותר מ 100 μl).
   4. סעיפי דגירה עם חסימת חיץ במשך שעה 1.
4. סעיפי דגירה עם נוגדן ראשוני.
   1. כן פתרון אחד עם שני נוגדנים ראשוניים לחקור כל מקטע עבור CD31 (ECS) ו יקטין שריר חלק (pericytes) מדולל במאגר דילול (PBS 1x, 1% BSA, 0.3% Triton X-100).
      הערה: כאן, אנטי CD31 ריכוז הוא 01:50 וריכוז יקטין שרירים אנטי חלקה הוא 1: 300.
   2. דגירת סעיפי הלילה ב 4 ° C עם 100 נוגדנים ראשוניים μl במגש לחות המכיל מים מזוקקים.
5. שטפו את השקופיות שלוש פעמים 1x PBST (0.1% 1x PBS + Tween20) במשך 5 דקות כל אחד לשטוף.
6. סעיפי דגירה עם נוגדנים משני.
   1. כן פתרון עם נוגדנים משני נגד ארנב עז מצומדות fluorophore להכיר את נוגדן הארנב נגד CD31 המדולל במאגר דילול.
      1. הערה: נוגדן שריר החלק העיקרי יקטין כבר מצומדות עם fluorophore CY3, ולכן אין מכתים נוגדנים משני הוא זקוק. עיזים אנטי ארנב ריכוז נוגדנים משני הוא 1: 250.
   2. דגירה החלקה עבור שעה 1 עם 100 נוגדנים משני μl במגש הלחות המכיל מים מזוקקים.
7. שטפו את השקופיות שלוש פעמים 1x PBST במשך 5 דקות כל אחד לשטוף.
8. הר שקופיות.
   1. 2 פיפטה - 3 טיפות (~ 40 - 60 μl) של antifade פתרון גובר עם מכתים גרעיני DAPI על כל קטע.
   2. בעדינות להניח לא. 1.5 כיסוי להחליק על הסעיפים פתרון גובר, המאפשר נוזל להתפזר על פני חלקים עד קצותלהחליק את המכסה. בעדינות להשתמש אצבע ללחוץ את בועות אוויר עשוי להיות ממוקמת מעל האזור.
   3. בואו השקופיות להתייבש במשך שעה 1 לפחות לפני הטיפול.

צפיפות 10. לכמת נימים ומבנה ¹⁴

1. ספירת נימי H & E חלקים מוכתמים, כפי שבא לידי ביטוי # / ² מ"מ.
   1. רוכשת את התמונות של ארבעה תחומים שונים על מיקרוסקופ אור זקוף תחת הגדלה 40X.
      הערה: נימים מזוהים צינורות מלאים כדורי דם אדום.
   2. לחלופין, במקום נימים לספור ידני, להשתמש בתוכנת ניתוח תמונה (למשל, ניתוח תמונת Wimasis) לכמת פרמטרים אנגיוגנזה שונים כגון מספר כלי, Vessel אורך ממוצע קוטר, ונקודות סניף.
2. לנתח מבנה נימי בסעיפים מוכתם immunofluorescent.
   1. רוכש את תמונות של ארבעה תחומים שונים על מיקרוסקופ פלואורסצנטי הפוךעם קוביית מסנן FITC ו TxRed.
      1. השתמש קוביית FITC לתדמית ECS ידי עירור באורך גל 488 ננומטר ולהשתמש קובייה TxRed כדי pericytes התמונה על ידי עירור באורך גל 594 ננומטר.

תוצאות

נציג צביעת H & E ו- immunofluorescent סעיפי תקע ג'ל מטריקס מוצגת באיור 2. חלקים מן EC רק תקעים להציג כמה כלים כי הם בעיקר לא perfused עם דם (איור 2 צד ימין למעלה, חיצים שחורים) ואילו תקעים המכילים גם ECS ו pericytes להציג כמה perfused כלי בקטרים ​​גדולים וכ?...

Discussion

את assay תקע ג'ל מטריקס הוכיחה להיות שיטה נוחה וחזקה כדי להעריך ויסות הגנים ב אנגיוגנזה, תרכובות angiogenic ו antiangiogenic in vivo, וכדי להשלים בדיקות במבחנה. כאן אנו מתארים בפרוטרוט assay תקע ג'ל מטריקס הרומן של אנגיוגנזה אדם שחוקר את האינטראקציה בין תאי האנדותל pericytes במה...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
PBS (Phosphate buffered saline)	Corning	21-031-CV
0.25% Trypsin/0.53 mM EDTA	Corning	25-053-CI
Endothelial Cell Media (ECM) kit	Sciencell	1001	includes media, EC growth supplement, and penicillin/streptomycin, each supplied at the appropriate volume for easy mixing
Pericyte Media (PM) kit	Sciencell	1201	includes media, Pericyte growth supplement, and penicillin/streptomycin, each supplied at the appropriate volume for easy mixing
primary human pulmonary microvascular endothelial cells	Pulmonary Hypertension Breakthrough Initiative		this cell type is also available commercially. Cells used at passage 1-4
primary human pulmonary pericytes	Pulmonary Hypertension Breakthrough Initiative		this cell type is not available commercially, but brain paricytes are.  Cells used at passage 1-4
bFGF (basic Fibroblast Growth Factor)	Peprotech	100-18B	stock solution is 50 μg/ml in 0.1% BSA in PBS, aliquots at 50 μl and stored at -20 degrees
Matrigel Basement Membrane Matrix	BD	356237
28 G 1 cc Insluin Syringe	BD	329410
SCID (Severe Combined Immune Deficiency) mice	The Jackson Laboratory	5557	NOD.SCID IL2R gamma knockout strain is the best strain; 4-6 weeks of age
1.5 ml microcentrifuge tubes, sterile	Thermo Fisher Scientific	05-408-129
15 ml screw top tubes, sterile	BD Biosciences	352096
PAP pen	Life Technologies	8899
hemocytometer	ThermoFisher Scientific	02-671-6
Nair hair removal cream	Walmart
anti-human CD31 primary antibody	LifeSpan Biosciences	LS-B4737	working solution is 1:50
anti-human Smooth Muscle actin CY3 primary fluorescent antibody	Sigma	C6198	working solution is 1:300
goat anti-rabbit secondary antibody; 488/green	ThermoFisher Scientific	A-11008	working solution is 1:250
Prolong Gold DAPI solution	Cell Signaling	8961S
microscope slides	VWR	48300-047
no. 1.5 cover slips	Thermo Fisher Scientific	12-544-D
citrate buffer 10x	Millipore	21545
extra fine surgical scissors	Fine Science Tools	14084-08
Formalin (paraformaldehyde)	Thermo Fisher Scientific	245-685
Tissue cassettes	Simport	M492-12
goat serum	Dako	X0907