In - vivo - Studie der menschlichen Endothelial-pericyte Interaktion Mit dem Matrix - Gel - Plug - Assay in der Maus

Zusammenfassung

Wir stellen ein Protokoll menschlichen endothelial-pericyte Wechselwirkungen in Maus unter Verwendung einer Variation der Matrix Gelpfropfen Angiogenese-Assay zu untersuchen.

Zusammenfassung

Angiogenesis is the process by which new blood vessels are formed from existing vessels. New vessel growth requires coordinated endothelial cell proliferation, migration, and alignment to form tubular structures followed by recruitment of pericytes to provide mural support and facilitate vessel maturation. Current in vitro cell culture approaches cannot fully reproduce the complex biological environment where endothelial cells and pericytes interact to produce functional vessels. We present a novel application of the in vivo matrix gel plug assay to study endothelial-pericyte interactions and formation of functional blood vessels using severe combined immune deficiency mutation (SCID) mice. Briefly, matrix gel is mixed with a solution containing endothelial cells with or without pericytes followed by injection into the back of anesthetized SCID mice. After 14 days, the matrix gel plugs are removed, fixed and sectioned for histological analysis. The length, number, size and extent of pericyte coverage of mature vessels (defined by the presence of red blood cells in the lumen) can be quantified and compared between experimental groups using commercial statistical platforms. Beyond its use as an angiogenesis assay, this matrix gel plug assay can be used to conduct genetic studies and as a platform for drug discovery. In conclusion, this protocol will allow researchers to complement available in vitro assays for the study of endothelial-pericyte interactions and their relevance to either systemic or pulmonary angiogenesis.

Einleitung

Die Angiogenese ist der Prozess , durch den neue Blutgefäße aus einem bereits bestehenden Gefäßnetz gebildet werden ¹ und steht im Mittelpunkt der laufenden Forschung in vielen Bereichen von der normalen Entwicklung von Krankheiten reichen. Dieser dynamische Prozess beinhaltet die Proliferation und Migration von endothelialen Zellen (ECs) und die Rekrutierung von Perizyten eines Gefäßrohr zu konstruieren , die in Richtung auf die Seite gerichtet ist , die ^zwei Sauerstoff- und Nährstoffzufuhr benötigt. Zur Untersuchung dieser Prozess einen ebenso dynamischen Test erfordert, vor allem eine, die die dreidimensionale Natur der Schlauchbildung rekapitulieren kann. In - vitro - 3D - Matrix - Assays wurden entwickelt , um diesen Bedarf zu adressieren und gearbeitet haben und Forscher zu ermöglichen , die einzelnen Schritte in Raum und Zeit zu definieren , in denen die Angiogenese Platz ^{3 nimmt, 4, 5, 6.} Allerdings sind diese in vitro 3D - Matrix - Modelle beschränkt auf das Studium nicht-durchbluteten Gefäßen eined fehlt daher kritische Komponenten relevant für die Prozess der Angiogenese (zB Wachstum zirkulierenden und hemmenden Faktoren, unnatürliche Spannung / Kräfte über das Gefäßbett) und nicht die komplexe Umwelt in lebendem Gewebe zu simulieren. Um dieser Einschränkung, mehrere in - vivo - Angiogenese - Assays wurden ⁷ entwickelt, einschließlich der Matrix Gelpfropfen Assay, der im Mittelpunkt unseres Berichts wird ^{8, 9.}

Die Matrix Gelpfropfen Assay ist ein etabliertes in vivo - Angiogenese - Test, der den Forschern anspricht , wie es eine robuste Plattform bietet die Rollen von verschiedenen Zellen und Substanzen in die Angiogenese zu testen. Matrix-Gel ist ein kommerziell erhältlicher Basalmembran Lösung, die von dem Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) Maus-Sarkom-Zelllinie sekretiert wird, die bei 37 ° C in ein gelartiges Material erstarrt. Die Matrix-Gel kann mit Zellen und / oder Substanzen, wie Wachstumsfaktoren, gemischt werden und injesubkutan in die Maus cted. Der Host-ECs wird den Stecker über 14 Tage überfallen, ein Gefäßnetz bilden und mit dem Blut des Wirts durchblutet sind. Bislang Matrix Gelpfropfen Assays ausschließlich auf die Untersuchung der endothelialen Zellverhalten während der Angiogenese konzentriert sich jedoch auf bestem Wissen ist keine Anstrengung noch aus, um festzustellen, ob dieser Assay zur Kokultur Endothelzellen und Perizyten verwendet werden können, zu untersuchen, wie sich diese beiden Zelltypen während der Angiogenese zusammenwirken. Insbesondere ist wertvoll zwischen ECs und Perizyten die Beziehung Verständnis für Krankheiten zu studieren , wo Blutgefäßverlust pathologisch, einschließlich mikrovaskulären Ischämie und periphere Gefäßerkrankungen ^{10, 11, 12.}

Hier beschreiben wir ein Protokoll, das Perizyten Menschen stamm an die Matrix Gelmischung zusammen mit menschlichen ECs und Fibroblastenwachstumsfaktor (bFGF) einführt. Diese Mischung kann dann i subkutan injiziert werdenn die dorsum von SCID-Mäusen die Bildung von voll funktionsfähig, pericyte beschichtet, Hybridgefäße zu ermöglichen. Unser Protokoll beschreibt, wie Matrix Gelpfropfen, die menschliches ECs vorzubereiten entweder mit oder ohne menschliches pericytes, Platzierung in SCID-Mäuse und wie die histologischen Schnitte für kritische Angiogenese-Endpunkte zu analysieren.

Protokoll

Ethikerklärung: Verfahren unter Verwendung tierischer Probanden wurden von der Institutional Animal Care und Use Committee an der Stanford University School of Medicine zugelassen.

HINWEIS: Die Tiere sind unter anesthetization mit 3% Verdampfer Isofluran und 3% Zufuhr von O ₂ -Gas. Die Verwendung von Tierarzt Salbe auf die Augen kann helfen, Trockenheit während der Narkose zu verhindern.

1. Zellpräparation

1. Wachsen humanen Endothel- und Perizyten Zellkulturen in 100 mm-Platten mit 10 ml der geeigneten Medien. Ersetzen Sie 10 ml frisches Medium alle 2 - 3 Tage, bis die Zellen erreichen 80% Konfluenz.
   1. Kultur Endothelzellen (ECs) in kompletten endothelialen Zellmedien (ECM), ergänzt mit Firma geliefert 5% fötales Rinderserum (FBS), 10% Penicillin / Streptomycin und 10% endothelialen Zellwachstumsergänzung.
   2. Kultur pericytes in komplette pericyte Medien (PM), ergänzt mit Unternehmen lieferte 2% FBS, 10% Penicillin / Streptomycin und 10% pericyte Wachstum zu ergänzen.
2. Bereiten Zellgemischen
   1. Berechne die erforderliche Anzahl von Zellen für die Versuchs- und Kontrollgruppen.
      HINWEIS: Jeder Stecker in der experimentellen Gruppe enthält eine Million (1 × 10 ⁶⁾ menschlichen ECs und zweihunderttausend (2 x 10 ⁵⁾ pericytes. Für die Kontrollgruppe enthält jeder Stecker 1,2 Millionen menschliche ECs nur. Die negative Kontrollgruppe hat nur Matrix-Gel. Jede Gruppe sollte mindestens vier Stecker umfassen, die zwei Mäuse erfordern würde, als Stecker können in jeder Seite eine Maus unteren Rücken injiziert werden. Drei Stecker würde als dreifacher Ausfertigung für das Experiment dienen und das vierte im Fall verwendet werden könnte, ausfällt. Bereiten Sie 25% mehr Zellen das zusätzliche Volumen des Gels entsprechen.
   2. Sammeln und Zählen Zellen aus Kulturplatten.
      1. Zum Abnehmen Zellen, entfernen Medien und waschen Sie einmal mit Raumtemperatur 1x phosphatgepufferter Salzlösung (PBS). Entfernen PBS, 1 ml 0,25% Trypsin / 2,21 mM EDTA, und nach 1 min. Wash-Zellen von der Platte durch 2 Hinzufügenml Medium und sammeln sich in einem 15-ml-Tube.
      2. Zählzelle einer Zählkammer nach den Anweisungen des Herstellers verwendet wird.
      3. Zentrifugieren Sie die entsprechende Anzahl von Zellen zu einem Pellet bei 400 xg für 5 min. Für die Versuchsgruppe, Zentrifuge sowohl ECs und Perizyten nach unten zusammen in einem Pellet.

2. Matrix Gelzubereitung

1. Auftauen Matrix Gel vollständig bei 4 ° C für 4 Stunden oder über Nacht eine homogene Lösung zu erhalten. Kein Mischen erforderlich.
2. Aliquotieren Matrix Gel in 1,5-ml-Röhrchen und lagern bei 4 ° C.
3. Pre-Chill-sterile 1,5 ml-Röhrchen und 28 G 1 cc Insulinspritzen bei 4 ° C. Vorsicht: Halten Sie Matrix-Gel auf Eis zu allen Zeiten.
4. Mischen Sie kalt Matrix-Gel mit bFGF bei einem Volumenverhältnis von 1: 100 (Endkonzentration von bFGF = 0,5 ug / ml; bFGF Stammlösung = 50 & mgr; g / ml) Nach dem Mischen Matrix-Gel-Lösung durch Auf- und Abpipettieren mehrmals, Inkubation auf Eis für 30 - 60 min before Mischen mit den Zellen in Schritt 3.1.
   HINWEIS: auftauen Lager bFGF vor dem Mischen. Berechnen Sie die Anzahl der Stecker für die Injektion benötigt. Zum Beispiel erfordert jeder Stopfen 200 & mgr; l Matrix Gel. Daher 25% Extra-Gel herzustellen.

3. Mix Matrix Gel mit Zellen

1. Für jede Gruppe Zellpellet mit dem berechneten Volumen der Matrix-Gel mit bFGF (geeignete Zellzahl enthält). Vorsichtig mischen Schäumen zu vermeiden und in der 15-ml-Röhrchen auf Eis belassen, bis Mäuse zur Injektion hergestellt werden.

4. Maus-Vorbereitung

1. Anesthetize 1 SCID - Mäuse für 5 min in 3% Isofluran plus 3% O ₂ in einer Induktionskammer. Konzentrieren Sie sich auf eine experimentelle Gruppe oder 2-Mäuse, zu einer Zeit.
2. Entfernen Sie die Maus aus der Induktionskammer, auf ein nach unten Bauchseite Heizkissen und schnell eine Schnauze Düse mit der Maus Gesicht über eine nicht-Rückatmungssystem befestigen Anästhesie während des inje zu liefernction Verfahren. Schalten Sie den Gasstrom aus der Induktionskammer zu dem Nicht-Rückatmungssystem und senken den Gasdruck auf 1,5% Isofluran und 1,5% O _2.
3. Entfernen Sie Haare aus den beiden seitlichen Hinter Regionen (etwa 1 cm Durchmesser) mit einem Rasierapparat oder Enthaarungscreme.
4. Wischen Sie den Hautbereich mit einer 70% igen Alkohol-Pad.
5. Bringen Sie die Maus an die Induktionskammer und wiederholen Sie die Schritte 4,2-4,4 mit der zweiten Maus.

5. Matrix-Gel-Injektion

1. Bereiten Sie eine Maus für die Injektion von der Nichtrückatmungssystem befestigt und nach unten auf das Heizkissen Bauchseite platzieren.
2. Legen Sie das Matrix-Gel in eine vorgekühlte 28 G 1 cc-Insulinspritze eine Maus zu einem Zeitpunkt.
   1. Laden Sie die komplette 500 & mgr; l Volumen der Matrix-Gel für zwei Stecker (200 ul pro Stecker plus 25% extra) in die Spritze.
   2. Achten Sie darauf, die Matrix-Gel in die Mäuse innerhalb von 3 Minuten des Ladens der Zellen in die Spritze zu injizieren, um die ce zu verhindernlls aus zur Seite der Spritze Absetzen und Matrix Gel zu verhindern Innenseite der Spritze verfestigt.
3. Heben Sie die Rückenhaut subkutanen Raum zu lokalisieren, zu injizieren dann 200 & mgr; l der Matrix Gel langsam und gleichmäßig in den subkutanen Raum von der Rückseite hinteren Teil des Brustkorbs.
4. Entfernen Sie die Injektionsnadel langsam, wobei darauf geachtet, Matrix Gel zu verhindern, dass ein Auslaufen der Injektionsstelle. Eine Beule wird bei der Injektionsstelle bilden. Wischen Injektionsstelle mit einem Alkoholtupfer.
5. Wiederholen Sie die Schritte Injektion 5,2-5,5 auf der anderen Seite der Maus zurück, dann mit der Maus auf dem Rücken lässt 1 min Gelieren der Matrix-Gel auf dem Heizkissen zu ermöglichen.
6. Skizzieren Sie die beiden Höcker einen Permanent-Marker mit der Beule nach 14 Tagen zu identifizieren. Nachdem ich einige Haare wieder wächst, wird es leichter sein, die Beule zu finden.

6. Matrix Gelpfropfen Isolation: 14 Tage nach der Injektion

1. Euthanize die Mäuse auf humane Weise durch das Tier ausgesetzts bis> 5 min Kohlendioxid Inhalation durch zervikale Dislokation gefolgt Tod zu gewährleisten.
2. Entfernen Sie die Matrix Gelpfropfen auf der Rückseite der Maus.
   1. Entfernen Sie vorsichtig nachgewachsenen Haare um Injektionsstelle, wo der Stecker durch Wiederholen von Schritt 4.3 befindet. Die Markierungslinie zeigt die Größe der ursprünglichen Beule unter der Haut.
   2. Excise den Stecker zusammen mit den umgebenden Haut und Muskelschichten angebracht auf den oberen und unteren Seiten des Steckers sind.
      1. Mit feinen chirurgischen Schere, machen einen Einschnitt an der markierten Grenze des Steckers, die senkrecht zur Haut ist und geschnitten, um den Muskel unterhalb der Stecker durch. Dann sorgfältig entlang der markierten Rand um den Umfang des Stopfens geschnitten.
      2. Ziehen Sie den Stecker, halten es zwischen der Haut und Muskelschichten eingebettet ist. sofort gründlich in einem kleinen Becher mit 1x PBS überschüssiges Blut abzuwaschen. Der Stecker ist nun bereit, festgelegt werden (nächster Schritt, 6.3).
3. Befestigen Sie die plug in 4% Paraformaldehyd.
   1. Platzieren Sie den gesamten Stecker, einschließlich der Haut und Muskelschichten, in einem 50-ml-Röhrchen mit 25 ml 4% Paraformaldehyd für 24 Stunden bei Raumtemperatur ohne zu schaukeln. Am nächsten Tag übertragen Sie den Stecker in 25 ml 70% Ethanol für weitere 24 Stunden vor der Paraffineinbettung.
      HINWEIS: Die beim Umgang Paraformaldehyd mit Vorsicht. Trag Handschuhe.

7. Paraffin Prozess der Matrix Gelpfropfen

1. Bereiten Sie den Stecker für die Paraffineinbettung.
   1. Richten Sie den Stecker wie in 1a gezeigt; Platzieren Sie den Stecker in eine Gewebekassette, so dass die Seite des Steckers nach oben zeigt und die beiden Haut und Muskelschichten sind über die Oberfläche des Gewebeblocks sichtbar, die zuerst während des Schneidens geschnitten wird.
2. Paraffin einbetten den Stecker nach Standardparaffineinbettung Protokolle ^13.
3. Schneiden Sie 8 - 10 & mgr; m dicke Abschnitte aus der Gewebeblock und montieren auf Mikroskop accor gleitetding Standard Paraffin sectioning Protokolle ^13.
4. Lagern Sie die Folien in einem kühlen, trockenen Ort bei Raumtemperatur, bis sie bereit für die Färbung.

8. Stain Abschnitte mit Hämatoxylin und Eosin - Färbung (H & E) ¹³

1. De-Paraffin säubern die Gewebeschnitte durch die Folien über 100% Xylol Passieren zweimal, 100% Ethanol, 95% Ethanol, 70% Ethanol und schließlich 1x PBS für jeweils 5 min bei Raumtemperatur. Verlassen Dias in 1x PBS, bis zum nächsten Schritt.
2. Je 100 & mgr; l H & E-Lösung auf den Abschnitt und Inkubation für 1 bis 5 min, oder bis es klare Kontrast zwischen blauen Kernen und rosa Zytoplasma in einer Zelle, wie bei 10-facher Vergrößerung unter einem aufrechten Lichtmikroskop betrachtet. Achten Sie darauf, nicht zu lassen, jede H & E-Lösung das Ziel berühren.
3. Wash H & E-Lösung von Dunking die Folie in einen großen Becher Leitungswasser, dann legen Sie die Folie in einem Rack in den Becher und bündig mit fließendem Wasser für 2 Minuten von der Folie ab.
4. Move 9,8 Schritt die Folien zu montieren.

9. Stain Andere Folien für Menschen Kapillaren und Perizyten

1. De-Paraffin säubern die Gewebeschnitte durch die Folien über 100% Xylol Passieren zweimal, 100% Ethanol, 95% Ethanol, 70% Ethanol und schließlich 1x PBS für jeweils 5 min bei Raumtemperatur. Verlassen Dias in 1x PBS, bis zum nächsten Schritt.
2. Kochen Sie die Abschnitte in Antigen-Retrieval-Lösung.
   1. In einem 2-Liter-Becher, bereiten Antigen-Retrieval-Lösung unter Verwendung von 1x Citratpuffer (pH 7,0) bei 95 ° C auf einem Heizblock Sieden.
   2. Nach dem Kochen legen Sie die Folien in einem Metallgestell und unterzutauchen für 20 Minuten in die siedende Antigen-Retrieval-Lösung.
   3. Entfernen Sie vorsichtig den Becher aus dem Heizblock mit den noch unter Wasser gleitet und die Lösung zu langsam für etwa 30 min auf Raumtemperatur zurück.
   4. Legen Sie die Folien in 1x PBS bis zum nächsten Schritt.
3. Blockieren Sie die Abschnitte in Blockierungspuffer (1x PBS, 5% Ziegenserum, 00,3% Triton X-100).
   1. Zeichnen Sie einen hydrophoben Kreis um die Ränder eines jeden Abschnitts mit einem PAP Stift.
   2. Legen Sie die Folien in einer Luftfeuchtigkeit Schale mit destilliertem Wasser auf dem Boden des Fachs.
   3. Je 100 & mgr; l Blockierungspuffer auf die Abschnitte dafür, dass das gesamte Gewebe von Flüssigkeit bedeckt ist (kann mehr als 100 & mgr; l erfordern).
   4. Inkubieren Abschnitte mit Puffer für 1 h blockiert.
4. Inkubieren Abschnitte mit dem primären Antikörper.
   1. Vorbereitung einer Lösung mit zwei primären Antikörpern jeden Abschnitt Sonde für CD31 (ECs) und smooth muscle actin (Perizyten) verdünnt in Verdünnungspuffer (1 × PBS, 1% BSA, 0,3% Triton X-100).
      HINWEIS: Hier, anti-CD31-Konzentration ist 01.50 und anti-Glattmuskelaktin Konzentration ist 1: 300.
   2. Inkubieren der Abschnitte über Nacht bei 4 ° C mit 100 & mgr; l primärer Antikörper in einer Feuchtigkeitsfach destilliertes Wasser enthält.
5. Waschen Sie die Objektträger dreimal in 1x PBST (1x PBS + 0,1% TweEN20) für jeweils 5 min waschen.
6. Inkubieren Abschnitte mit sekundären Antikörper.
   1. Vorbereitung einer Lösung mit einem Fluorophor konjugiertes Ziege-anti-Kaninchen-Sekundär-Antikörper der Anti-CD31-Kaninchen-Antikörper in Verdünnungspuffer verdünnt, zu erkennen.
      1. HINWEIS: Die Glattmuskelaktin primären Antikörper bereits mit einem Cy3 Fluorophor konjugiert ist, so ist keine sekundäre Antikörper-Färbung benötigt. Ziege-Anti-Kaninchen-Sekundärantikörperkonzentration beträgt 1: 250.
   2. Inkubieren Sie die Abschnitte 1 h mit 100 ul sekundären Antikörper in der Feuchtigkeit Fach destilliertes Wasser enthält.
7. Waschen Sie die Objektträger dreimal in 1x PBST für jeweils 5 min waschen.
8. Montieren Sie die Dias.
   1. Pipette 2 - 3 Tropfen (~ 40 - 60 & mgr; l) von Antifade Montagelösung mit DAPI Kernfärbung auf jedem Abschnitt.
   2. Sanft legen Sie eine Nr. 1.5 Deckglas über die Abschnitte und Montagelösung, so dass die Flüssigkeit über die Abschnitte, um sich auszubreiten und zu den Ränderndas Deckglas. Verwenden Sie vorsichtig mit einem Finger zu drücken aus Luftblasen, die über den Abschnitt befinden können.
   3. Lassen Sie die Folien für mindestens 1 Stunde trocknen, bevor Handhabung.

10. Quantify Kapillar - Dichte und Struktur ¹⁴

1. Zähle die Anzahl der Kapillaren in H & E gefärbte Schnitte, ausgedrückt als # / mm ^2.
   1. Erwerben Sie Fotos von vier verschiedenen Feldern an einem aufrechten Lichtmikroskop unter 40-facher Vergrößerung.
      HINWEIS: Die Kapillaren als Rohre mit roten Blutkörperchen gefüllt identifiziert.
   2. Alternativ kann anstelle der manuellen Zählen Kapillaren verwenden Bildanalysesoftware (zB Wimasis Image Analysis) verschiedene Angiogenese Parameter wie Gefäßzahl, mittlere Fahrzeuglänge und Durchmesser und Verzweigungspunkte zu quantifizieren.
2. Analysieren kapillare Struktur in Immunofluoreszenz-gefärbten Schnitten.
   1. Erwerben Sie Fotos von vier verschiedenen Feldern auf einem invertierten Fluoreszenzmikroskopmit FITC und TxRed Filterwürfel.
      1. Verwenden Sie ein FITC Würfel Bild ECs durch Anregung bei 488 nm Wellenlänge und mit einem TxRed Würfel Bild pericytes durch Anregung bei 594 nm Wellenlänge.

Ergebnisse

Repräsentative H & E und Immunfluoreszenzanfärbung von Matrix Gelpfropfen Abschnitte sind in Abbildung 2 Abschnitte von EG nur Stecker einige Schiffe angezeigt werden gezeigt, die meist nicht durchblutet (Abbildung 2 oben links, schwarze Pfeile) , während Stecker , die sowohl ECs und Perizyten Anzeige mehrere perfundierter Schiffe mit größerem Durchmesser und vollständige pericyte Abdeckung, wie durch positive SMA Färbung unmittelbar angrenzen...

Diskussion

Die Matrix Gelpfropfen Assay hat eine bequeme und leistungsfähige Methode zur Bewertung der Genregulation in Angiogenese, angiogene und antiangiogene Verbindungen in vivo erwiesen, und in vitro - Tests zu ergänzen. Hier beschreiben wir im Detail eine neuartige Matrix Gelpfropfen Test der menschlichen Angiogenese, die die Interaktion zwischen Endothelzellen und Perizyten während Gefäßbildung untersucht.

Es gibt einige neuartige und wichtige Schritte in diesem Protokoll....

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
PBS (Phosphate buffered saline)	Corning	21-031-CV
0.25% Trypsin/0.53 mM EDTA	Corning	25-053-CI
Endothelial Cell Media (ECM) kit	Sciencell	1001	includes media, EC growth supplement, and penicillin/streptomycin, each supplied at the appropriate volume for easy mixing
Pericyte Media (PM) kit	Sciencell	1201	includes media, Pericyte growth supplement, and penicillin/streptomycin, each supplied at the appropriate volume for easy mixing
primary human pulmonary microvascular endothelial cells	Pulmonary Hypertension Breakthrough Initiative		this cell type is also available commercially. Cells used at passage 1-4
primary human pulmonary pericytes	Pulmonary Hypertension Breakthrough Initiative		this cell type is not available commercially, but brain paricytes are.  Cells used at passage 1-4
bFGF (basic Fibroblast Growth Factor)	Peprotech	100-18B	stock solution is 50 μg/ml in 0.1% BSA in PBS, aliquots at 50 μl and stored at -20 degrees
Matrigel Basement Membrane Matrix	BD	356237
28 G 1 cc Insluin Syringe	BD	329410
SCID (Severe Combined Immune Deficiency) mice	The Jackson Laboratory	5557	NOD.SCID IL2R gamma knockout strain is the best strain; 4-6 weeks of age
1.5 ml microcentrifuge tubes, sterile	Thermo Fisher Scientific	05-408-129
15 ml screw top tubes, sterile	BD Biosciences	352096
PAP pen	Life Technologies	8899
hemocytometer	ThermoFisher Scientific	02-671-6
Nair hair removal cream	Walmart
anti-human CD31 primary antibody	LifeSpan Biosciences	LS-B4737	working solution is 1:50
anti-human Smooth Muscle actin CY3 primary fluorescent antibody	Sigma	C6198	working solution is 1:300
goat anti-rabbit secondary antibody; 488/green	ThermoFisher Scientific	A-11008	working solution is 1:250
Prolong Gold DAPI solution	Cell Signaling	8961S
microscope slides	VWR	48300-047
no. 1.5 cover slips	Thermo Fisher Scientific	12-544-D
citrate buffer 10x	Millipore	21545
extra fine surgical scissors	Fine Science Tools	14084-08
Formalin (paraformaldehyde)	Thermo Fisher Scientific	245-685
Tissue cassettes	Simport	M492-12
goat serum	Dako	X0907