No estudo in vivo da Human Interaction Endotelial-pericyte usando o plug Ensaio Matrix Gel no mouse

Resumo

Nós apresentamos um protocolo para estudar as interações endotelial-pericyte humanos no rato usando uma variação do ensaio plugue angiogênese gel matriz.

Resumo

Angiogenesis is the process by which new blood vessels are formed from existing vessels. New vessel growth requires coordinated endothelial cell proliferation, migration, and alignment to form tubular structures followed by recruitment of pericytes to provide mural support and facilitate vessel maturation. Current in vitro cell culture approaches cannot fully reproduce the complex biological environment where endothelial cells and pericytes interact to produce functional vessels. We present a novel application of the in vivo matrix gel plug assay to study endothelial-pericyte interactions and formation of functional blood vessels using severe combined immune deficiency mutation (SCID) mice. Briefly, matrix gel is mixed with a solution containing endothelial cells with or without pericytes followed by injection into the back of anesthetized SCID mice. After 14 days, the matrix gel plugs are removed, fixed and sectioned for histological analysis. The length, number, size and extent of pericyte coverage of mature vessels (defined by the presence of red blood cells in the lumen) can be quantified and compared between experimental groups using commercial statistical platforms. Beyond its use as an angiogenesis assay, this matrix gel plug assay can be used to conduct genetic studies and as a platform for drug discovery. In conclusion, this protocol will allow researchers to complement available in vitro assays for the study of endothelial-pericyte interactions and their relevance to either systemic or pulmonary angiogenesis.

Introdução

A angiogénese é o processo pelo qual novos vasos sanguíneos são formados a partir de uma rede vascular pré-existente e ¹ é o foco da pesquisa em curso em muitas áreas, desde o desenvolvimento normal da doença. Este processo dinâmico envolve a proliferação e migração de células endoteliais (ECS) e recrutamento de pericitos para a construção de um tubo vascular que é dirigida para o local que necessita de oxigénio e de nutrientes de entrega ^2. Para estudar este processo requer um ensaio dinâmico igualmente, o mais importante que pode recapitular a natureza tridimensional de formação de tubos. Os ensaios in vitro de matrizes 3D foram desenvolvidos para atender a essa necessidade e têm funcionado bem para permitir que pesquisadores para definir os passos discretos no espaço e no tempo em que a angiogénese ocorre ^{3, 4, 5, 6.} No entanto, estes modelos in vitro de matrizes 3D estão limitadas a estudar navios não-perfundidos umd, por conseguinte, não têm componentes críticos pertinentes para o processo de angiogese (por exemplo, circulando o crescimento e factores inibitórios, a tensão não natural / forças através do leito vascular) e falhar para simular o ambiente complexo presente no tecido vivo. Para resolver esta limitação, vários ensaios in vivo da angiogénese têm sido desenvolvidos ^7, incluindo o ensaio de tampão de gel de matriz, que será o foco do nosso relatório ^{8, 9.}

O ensaio de matriz de tampão de gel é um ensaio in vivo de angiogénese bem estabelecido que atrai pesquisadores, pois proporciona uma plataforma robusta para testar os papéis dos diferentes células e substâncias na angiogênese. gel de matriz é uma membrana basal solução disponível comercialmente que é segregado pela linha celular de Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) sarcoma de rato que solidifica em um material semelhante a gel a 37 ° C. A matriz de gel pode ser misturado com as células e / ou substâncias, tais como factores de crescimento, e injected subcutaneamente no mouse. O anfitrião ECs vai invadir a ficha ao longo de 14 dias, formar uma rede vascular, e tornar-se perfusão com sangue do hospedeiro. Até à data, os ensaios camada de gel de matriz têm-se centrado exclusivamente no estudo do comportamento da célula endotelial durante a angiogénese, no entanto, com o melhor de nosso conhecimento nenhum esforço foi feito ainda para determinar se este ensaio pode ser utilizado células endoteliais para co-cultura e pericitos para estudar como estes dois tipos de células interagem durante a angiogênese. Especificamente, a compreensão da relação entre ECs e pericitos é valioso para o estudo de doenças em que a perda de vasos sanguíneos é patológico, incluindo isquemia microvascular e doença vascular periférica ^{10, 11, 12.}

Aqui, nós descrevemos um protocolo que introduz pericitos derivadas de humanos para a mistura de gel da matriz juntamente com ECs humano e factor de crescimento de fibroblastos (bFGF). Esta mistura pode então ser injectado por via subcutânea in o dorso de ratinhos SCID para permitir a formação de pericitos, revestidos, vasos híbridos totalmente funcionais. Nosso protocolo descreve como preparar tampões de gel matriz contendo ECs humanos com ou sem pericitos humanos, colocação em ratinhos SCID e como analisar os cortes histológicos para endpoints angiogênese críticos.

Protocolo

Declaração de Ética: Procedimentos envolvendo indivíduos animais foram aprovados pelo Institutional Animal Care e do Comitê Use na Stanford University School of Medicine.

NOTA: Os animais estão sob anestesia com 3% de isoflurano vaporizador e fornecimento 3% de _O2 gás. O uso de pomada veterinário nos olhos pode ajudar a prevenir o ressecamento enquanto sob anestesia.

1. Preparação de células

1. Crescer endoteliais e células pericyte culturas humanas em placas de 100 mm com 10 ml de a mídia apropriada. Substituir 10 ml de meio fresco a cada 2 - 3 dias até que as células atingir 80% de confluência.
   1. Cultura de células endoteliais (ECs) em meio completo de células endoteliais (ECM) suplementado com empresa fornecido 5% de soro fetal de bovino (FBS), 10% de penicilina / estreptomicina e suplemento de crescimento celular endotelial 10%.
   2. pericitos cultura em meios pericyte completo (PM) suplementado com empresa forneceu 2% FBS, 10% de penicilina / estreptomicina e suplemento de crescimento pericyte 10%.
2. Preparar misturas de células
   1. Calcula-se a quantidade necessária de células para os grupos experimentais e de controlo.
      NOTA: Cada plug no grupo experimental contém um milhão (1 x 10 ⁶⁾ ECs humana e duzentos mil (2 x 10 ⁵⁾ pericitos. Para o grupo controle, cada vela contém apenas 1,2 milhão de ECs humanos. O grupo de controlo negativo tem gel matriz única. Cada grupo deve incluir, pelo menos, quatro tomadas de corrente, o que exigiria dois ratos como tampões podem ser injectadas em cada lado de um rato parte inferior das costas. Três tampões serviria como triplicado para a experiência e o quarto pode ser utilizado no caso de uma falha. Preparar 25% de células adicionais para coincidir com o volume adicional de gel.
   2. Recolher e contar as células de placas de cultura.
      1. Para retirar as células, remova a mídia e lavar uma vez com fosfato de 1x temperatura ambiente salino (PBS). Remover PBS, adicionar 1 ml de 0,25% EDTA de tripsina / 2,21 mM, e incubar durante 1 min. Lave as células fora da placa por adição de 2ml de meio e recolher num tubo de 15 ml.
      2. A contagem de células utilizando um hemocitómetro de acordo com as instruções do fabricante.
      3. Centrifuga-se o número adequado de células numa pelete a 400 xg durante 5 min. Para o grupo experimental, de centrifugação tanto ECs e pericitos para baixo junto em um pellet.

2. Preparação matriz de gel

1. Descongelar completamente na matriz de gel a 4 ° C durante 4 horas ou durante a noite para se obter uma solução homogénea. Não é necessária mistura.
2. aliquota gel de matriz em tubos de 1,5 ml e armazenar a 4 ° C.
3. Pré-frio estéreis tubos de 1,5 ml e 28 g seringas de 1 cc de insulina, a 4 ° C. Cuidado: Mantenha gel matriz no gelo em todos os momentos.
4. Misturar na matriz de gel frio com bFGF a uma proporção em volume de 1: 100 (concentração final de bFGF = 0,5 ug / ml; bFGF solução estoque = 50 ug / ml) após reconstituição solução de gel matriz por pipetagem para cima e para baixo várias vezes, incubar em gelo por 30 - 60 min bntes de mistura com as células no passo 3.1.
   NOTA: Descongelar o estoque bFGF antes da mistura. Calcular o número de fichas necessárias para a injecção. Por exemplo, cada plug requer 200 gel matriz ul. Por conseguinte, preparar 25% de gel adicional.

3. Misturar matriz de gel com células

1. Para cada grupo, ressuspender o sedimento de células (número de células contendo o caso) com o volume calculado de gel de matriz contendo bFGF. Misture com cuidado para evitar a formação de espuma e deixe no tubo de 15 ml em gelo até ratos são preparadas para injecção.

4. Rato Preparação

1. 1 Anestesiar ratos SCID durante 5 minutos em 3% de isoflurano mais _de O ₂ a 3% em uma câmara de indução. Concentre-se em um grupo experimental, ratos ou 2, de cada vez.
2. Remover o rato da câmara de indução, lugar em um lado ventral almofada de aquecimento para baixo e rapidamente anexar um bocal focinho até o rosto do rato através de um sistema não-reinalação para fornecer anestesia em todo o injeprocedimento cção. Comutar o fluxo de gás a partir da câmara de indução para o sistema de reciclagem do ar e não diminuir a pressão do gás de 1,5% de isoflurano e 1,5% de O _2.
3. Remover pêlos de ambas as regiões traseiras laterais (cerca de 1 cm de diâmetro) com um creme da remoção da máquina de barbear ou cabelo.
4. Limpar a área da pele com uma compressa de álcool de 70%.
5. Devolver o mouse para a câmara de indução e repita os passos 4,2-4,4 com o segundo mouse.

5. Injecção matriz de gel

1. Prepare um rato para injecção, anexando ao sistema não-reinalação e colocando no lado da almofada de aquecimento ventral para baixo.
2. Carregar o gel matriz para uma pré-arrefecida de 28 g de 1 cc de insulina seringa um rato de cada vez.
   1. Carregar o volume de 500 ul de gel de matriz completa em dois tampões (200 ul por encaixe e ainda 25% adicionais) para dentro da seringa.
   2. Certifique-se para injectar o gel matriz para os ratos dentro de 3 min de carregar as células para dentro da seringa para impedir o cells se deposite no lado da seringa e para impedir a matriz de gel solidifique no interior da seringa.
3. Levantar a pele volta para localizar espaço subcutâneo, em seguida, injectar 200 ul de gel matriz lentamente e uniformemente no espaço subcutâneo do posterior para trás da caixa torácica.
4. Remover a agulha de injecção lentamente, tendo o cuidado de evitar a matriz de gel de vazar para fora do local de injecção. Uma colisão vai formar no local da injecção. Limpe local da injecção com uma compressa embebida em álcool.
5. Repita os passos de injecção 5,2-5,5 no outro lado da parte traseira do rato, em seguida, deixar o mouse sobre as suas costas para 1 min para permitir a gelificação do gel matriz sobre a almofada de calor.
6. Delinear as duas colisões usando um marcador permanente para identificar a colisão após 14 dias. Depois de algum cabelo volta a crescer, será mais fácil encontrar a colisão.

6. Matrix Gel plug Isolamento: 14 dias após a injecção

1. Eutanásia com humanidade os ratos por exposição do animals a> 5 min de inalação de dióxido de carbono, seguido por deslocamento cervical para assegurar a morte.
2. Retire o bujão de gel matriz das costas do mouse.
   1. Remova cuidadosamente o cabelo de novo cultivadas em torno do local da injecção onde a ficha está localizado repetindo o passo 4.3. A linha de marcação indica o tamanho da colisão original sob a pele.
   2. Excisar o encaixe juntamente com a pele e os músculos que rodeiam as camadas unidas nos lados superior e inferior do tampão, respectivamente.
      1. Usando finas tesouras cirúrgicas, fazer uma incisão na fronteira acentuada do tampão que é perpendicular à pele e cortar ao músculo debaixo do bujão. Em seguida, cuidadosamente cortada em torno da periferia do tampão ao longo da fronteira marcada.
      2. Retirar a ficha, mantendo-ensanduichada entre as camadas de pele e músculo. lave imediatamente em um pequeno copo com 1x PBS para lavar o excesso de sangue. A ficha está agora pronto para ser fixado (passo seguinte, 6.3).
3. Corrigir os plug em 4% de paraformaldeído.
   1. Colocar todo o tampão, incluindo as camadas da pele e músculo, em um tubo de 50 ml com 25 ml de 4% de paraformaldeído durante 24 horas à temperatura ambiente sem agitação. No dia seguinte, transferir o plugue em 25 ml de etanol a 70% durante mais 24 horas antes da inclusão em parafina.
      NOTA: Punho paraformaldeído com cautela. Use luvas.

7. Parafina Processo Matrix Gel plug

1. Prepare o plug para inclusão em parafina.
   1. Orientar a ficha, como mostrado na Figura 1A; colocar a ficha numa cassete de tecido de modo que o lado da ficha é virada para cima e as duas camadas da pele e músculo são visíveis através da superfície do bloco de tecido que vai ser cortado em primeiro lugar durante o corte.
2. Parafina incorporar a ficha de acordo com Parafina protocolos padrão ^13.
3. Corte 8 - 10 mm de espessura fora do bloco de tecido e montar em lâminas de microscópio According a parafina seccionamento protocolos padrão ^13.
4. Armazenar as lâminas em local seco e fresco à temperatura ambiente até que esteja pronto para a coloração.

8. Secções mancha com hematoxilina e eosina (H & E) ¹³

1. De-paraffinize as secções de tecido por passagem das lâminas por meio de 100% de xileno, duas vezes, com 100% de etanol, 95% de etanol, 70% de etanol e, finalmente, 1 x PBS, cada um durante 5 min à temperatura ambiente. Deixar as lâminas em 1x PBS até ao passo seguinte.
2. solução de pipeta 100 mL H & E para a seção e incubar por 1-5 min, ou até que haja um claro contraste entre núcleos azuis e citoplasma rosa em uma célula como visto sob um microscópio de luz na posição vertical no aumento de 10x. Tenha cuidado para não deixar que qualquer solução H & E tocar o objectivo.
3. solução de lavagem H & E fora do slide, molhando o slide em um grande copo de água da torneira, em seguida, coloque o slide em um rack no copo e lave com água corrente durante 2 min.
4. Move para o passo 9.8 para montar os slides.

9. Stain outros slides para Capilares Humanos e pericitos

1. De-paraffinize as secções de tecido por passagem das lâminas por meio de 100% de xileno, duas vezes, com 100% de etanol, 95% de etanol, 70% de etanol e, finalmente, 1 x PBS, cada um durante 5 min à temperatura ambiente. Deixar as lâminas em 1x PBS até ao passo seguinte.
2. Ferva as seções de solução de recuperação antigênica.
   1. Em um copo de 2 L, preparar a solução de recuperação de antigénio de ebulição usando 1x tampão de citrato (pH 7,0) a 95 ° C num bloco de aquecimento.
   2. Depois de ferver, coloque as lâminas em um rack de metal e mergulhe na solução de recuperação antigênica em ebulição durante 20 min.
   3. Cuidadosamente remover o copo do bloco de aquecimento com as lâminas submersas e ainda permitir que a solução voltar lentamente à temperatura ambiente durante cerca de 30 min.
   4. Colocar as lâminas em 1x PBS até o próximo passo.
3. Bloquear as seções em tampão de bloqueio (1x PBS, 5% de soro de cabra, 00,3% de Triton X-100).
   1. Desenhar um círculo hidrófobo em torno das bordas de cada secção com uma caneta PAP.
   2. Colocar as lâminas em uma bandeja de humidade com água destilada na parte inferior do tabuleiro.
   3. Pipetar 100 ul de tampão de bloqueio para as secções assegurando-se todo o tecido é coberta por fluido (pode necessitar de mais de 100 uL).
   4. Incubar secções com tampão de bloqueio durante 1 h.
4. Incubar seções com anticorpo primário.
   1. Preparar uma solução com dois anticorpos primários para sondar cada secção para CD31 (ECS) e actina do músculo liso (pericitos) diluída em tampão de diluição (PBS 1x, 1% de BSA, 0,3% de Triton X-100).
      NOTA: Aqui, a concentração de anti-CD31 é de 1:50 e concentração actina anti-músculo liso é de 1: 300.
   2. Incubam-se as secções durante a noite a 4 ° C com 100 ul de anticorpos primários em uma bandeja de humidade contendo água destilada.
5. Lavam-se as lâminas três vezes em 1x PBST (PBS 1x + 0,1% TweEN20) durante 5 min cada lavagem.
6. Incubar seções com anticorpo secundário.
   1. Prepara-se uma solução com um anticorpo secundário anti-coelho de cabra conjugada com fluoróforo para reconhecer o anticorpo de coelho anti-CD31 diluído no tampão de diluição.
      1. NOTA: O anticorpo primário actina de músculo liso já é conjugado com um fluoróforo CY3, assim, não coloração do anticorpo secundário é necessária. coelho concentração de anticorpo secundário de cabra anti-é de 1: 250.
   2. Incubar as secções durante 1 hora com anticorpo secundário ul 100 na bandeja de umidade contendo água destilada.
7. Lavam-se as lâminas três vezes em 1x PBST, durante 5 min cada lavagem.
8. Montar os slides.
   1. Pipetar 2 - 3 gotas (~ 40 - 60 L) de solução antifade montagem com coloração nuclear DAPI em cada secção.
   2. Delicadamente, coloque um não. 1,5 tampa de deslizamento sobre as seções e solução de montagem, permitindo que o fluido para se espalhar sobre as seções e as bordasa lamela. Suavemente utilizar um dedo para pressionar para fora as bolhas de ar que podem ser localizados ao longo do percurso.
   3. Deixe que as lâminas secar por pelo menos 1 hora antes de utilizar.

10. Quantificar Capilar Densidade e Estrutura ¹⁴

1. Contar o número de capilares em H & E secções coradas, expressa como # / mm ^2.
   1. Adquirir fotos de quatro campos diferentes em um microscópio de luz na posição vertical sob 40X.
      NOTA: Os capilares são identificados como tubos cheios com células vermelhas do sangue.
   2. Alternativamente, em vez de capilares contando manualmente, use imagem software de análise (por exemplo, Wimasis Análise de Imagem) para quantificar vários parâmetros de angiogênese, como o número de navio, comprimento médio navio e diâmetro, e pontos de ramificação.
2. Analisar a estrutura capilar em seções de imunofluorescência corados.
   1. Adquirir fotos de quatro campos diferentes em um microscópio de fluorescência invertidacom cubo de filtro FITC e TxRed.
      1. Use um cubo FITC para a imagem ECs por excitação a 488 nm de comprimento de onda e usar um cubo TxRed de pericitos de imagem por excitação a 594 nm de comprimento de onda.

Resultados

Representante H & E e imunofluorescência coloração das seções camada de gel de matriz são mostrados na Figura 2. Os pontos de CE apenas fichas de exibir alguns vasos que na maioria não são perfundidos com sangue (Figura 2 parte superior esquerda, setas pretas), enquanto fichas contendo tanto ECs e pericitos mostrar vários perfundido vasos com diâmetros maiores e cobertura pericyte completa, como evidenciado por coloração SMA positivo imed...

Discussão

O ensaio de tampão de gel de matriz tem provado ser um método conveniente e poderoso para avaliar a regulação do gene na angiogénese, os compostos angiogénicos e anti-angiogénicos in vivo, e para complementar os testes in vitro. Aqui, descrevemos em detalhe um ensaio tampão de gel matriz novela de angiogênese humana que investiga a interação entre as células endoteliais e pericitos durante a formação de vasos.

Existem alguns passos novos e críticos n...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
PBS (Phosphate buffered saline)	Corning	21-031-CV
0.25% Trypsin/0.53 mM EDTA	Corning	25-053-CI
Endothelial Cell Media (ECM) kit	Sciencell	1001	includes media, EC growth supplement, and penicillin/streptomycin, each supplied at the appropriate volume for easy mixing
Pericyte Media (PM) kit	Sciencell	1201	includes media, Pericyte growth supplement, and penicillin/streptomycin, each supplied at the appropriate volume for easy mixing
primary human pulmonary microvascular endothelial cells	Pulmonary Hypertension Breakthrough Initiative		this cell type is also available commercially. Cells used at passage 1-4
primary human pulmonary pericytes	Pulmonary Hypertension Breakthrough Initiative		this cell type is not available commercially, but brain paricytes are.  Cells used at passage 1-4
bFGF (basic Fibroblast Growth Factor)	Peprotech	100-18B	stock solution is 50 μg/ml in 0.1% BSA in PBS, aliquots at 50 μl and stored at -20 degrees
Matrigel Basement Membrane Matrix	BD	356237
28 G 1 cc Insluin Syringe	BD	329410
SCID (Severe Combined Immune Deficiency) mice	The Jackson Laboratory	5557	NOD.SCID IL2R gamma knockout strain is the best strain; 4-6 weeks of age
1.5 ml microcentrifuge tubes, sterile	Thermo Fisher Scientific	05-408-129
15 ml screw top tubes, sterile	BD Biosciences	352096
PAP pen	Life Technologies	8899
hemocytometer	ThermoFisher Scientific	02-671-6
Nair hair removal cream	Walmart
anti-human CD31 primary antibody	LifeSpan Biosciences	LS-B4737	working solution is 1:50
anti-human Smooth Muscle actin CY3 primary fluorescent antibody	Sigma	C6198	working solution is 1:300
goat anti-rabbit secondary antibody; 488/green	ThermoFisher Scientific	A-11008	working solution is 1:250
Prolong Gold DAPI solution	Cell Signaling	8961S
microscope slides	VWR	48300-047
no. 1.5 cover slips	Thermo Fisher Scientific	12-544-D
citrate buffer 10x	Millipore	21545
extra fine surgical scissors	Fine Science Tools	14084-08
Formalin (paraformaldehyde)	Thermo Fisher Scientific	245-685
Tissue cassettes	Simport	M492-12
goat serum	Dako	X0907