Fare Matrix Jel Plug Test kullanma İnsan endotel-pericyte Etkileşim Vivo Çalışmasında

Özet

Biz matris jel fiş anjiyogenez testinin bir varyasyon kullanarak fare insan endotel-pericyte etkileşimleri incelemek için bir protokol mevcut.

Özet

Angiogenesis is the process by which new blood vessels are formed from existing vessels. New vessel growth requires coordinated endothelial cell proliferation, migration, and alignment to form tubular structures followed by recruitment of pericytes to provide mural support and facilitate vessel maturation. Current in vitro cell culture approaches cannot fully reproduce the complex biological environment where endothelial cells and pericytes interact to produce functional vessels. We present a novel application of the in vivo matrix gel plug assay to study endothelial-pericyte interactions and formation of functional blood vessels using severe combined immune deficiency mutation (SCID) mice. Briefly, matrix gel is mixed with a solution containing endothelial cells with or without pericytes followed by injection into the back of anesthetized SCID mice. After 14 days, the matrix gel plugs are removed, fixed and sectioned for histological analysis. The length, number, size and extent of pericyte coverage of mature vessels (defined by the presence of red blood cells in the lumen) can be quantified and compared between experimental groups using commercial statistical platforms. Beyond its use as an angiogenesis assay, this matrix gel plug assay can be used to conduct genetic studies and as a platform for drug discovery. In conclusion, this protocol will allow researchers to complement available in vitro assays for the study of endothelial-pericyte interactions and their relevance to either systemic or pulmonary angiogenesis.

Giriş

Anjiyogenez yeni kan damarları normal gelişim hastalığın kadar birçok alanda genelinde devam eden araştırma odağı önceden varolan damar ağı ^1'den oluşan ve bir olan süreçtir. Bu dinamik süreç çoğalmasını ve endotel hücreleri (EC) ve oksijen ve besin teslim ² ihtiyacı sitede yöneliktir vasküler tüp oluşturmak için perisitlerin işe göç içerir. Bu işlem, aynı derecede dinamik bir tahlil, tüp oluşumu üç boyutlu yapısını özetlemek için en önemlisi bir gerektirir incelenmesi. In vitro 3D matris deneyleri bu ihtiyaca cevap vermek geliştirilmiştir ve araştırmacılar anjiyogenez yeri ^{3, 4, 5, 6} aldığı uzay ve zamanda ayrık adımları tanımlamak için izin de çalıştı. Bununla birlikte, bu in vitro olarak 3D matris modelleri perfüze olmayan damarları, bir eğitim sınırlıdırd nedenle anjiyogenez sürecine uygun kritik bileşenleri eksikliği (örneğin, damar yatak boyunca büyüme ve inhibitör faktörler, doğal olmayan gerginlik / kuvvetleri dolaşan) ve canlı dokuda mevcut karmaşık ortamında simüle etmek için başarısız. Bu sınırlama gidermek için, birçok in vivo anjiyogenez deneyleri raporumuzun ^{8, 9} odak noktası olacaktır matris jel fiş deneyi de dahil olmak üzere, ⁷ geliştirilmiştir.

Matris jel fiş tahlil angiogeneziste farklı hücre ve maddelerin rolleri test etmek için sağlam bir platform sağlar olarak araştırmacılara hitap köklü in vivo anjiyogenez testtir. Matris jel 37 ° C 'de, bir jel-benzeri malzeme içine katılaşmaktadır Engelbreth-Holm-Swarm (EHS), fare sarkoma hücre çizgisi tarafından salgılanan bir ticari olarak temin edilebilir bazal membran çözümdür. Matris jel, büyüme faktörleri ve enjeksiyonundan gibi hücreler ve / veya maddeler ile karıştırılabilirfare içine deri altından cted. ev sahibi EC, 14 gün boyunca fişi işgal vasküler ağ oluşturacak ve konağın kanla perfüze hale gelecektir. Bugüne kadar, matris jel fiş deneyleri bu deney için ortak kültür endotel hücreleri ve perisitleri kullanılabilir olup olmadığını belirlemek için hiçbir çaba henüz yapılmamıştır, bizim bildiğimiz kadarıyla, ancak, anjiyogenez sırasında endotel hücre davranış çalışma odaklanmış olması bu iki hücre tipleri anjiyogenez sırasında nasıl etkileşimde çalışmak için. Özellikle, EC ve perisitlere arasındaki ilişkiyi anlamak mikrovasküler iskemi ve periferik vasküler hastalık ^{10, 11, 12} de dahil olmak üzere kan damarı kaybı patolojik olan hastalıkların, eğitim için değerlidir.

Burada, insan EC ve fibroblast büyüme faktörü (bFGF) ile birlikte matris jel karışımına insandan türetilmiş perisitler getiren bir protokol açıklar. Bu karışım daha sonra deri altına enjekte edilebilirn, SCID farelerinin sırtı tam olarak işlevsel, perisit kaplanmış, hibrid damarlarının oluşumunu sağlamak için. Bizim protokol ile veya SCID fareleri ve nasıl kritik anjiyogenez bitiş noktaları için histolojik bölümleri analiz etmek, insan perisitlere, yerleştirme olmadan ya insan ECS içeren matris jel fişlerini hazırlamak açıklamaktadır.

Protokol

Etik Beyanı: Hayvan denekleri Prosedürleri Stanford Üniversitesi Tıp Okulu'nda Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi tarafından onaylanmıştır.

NOT: Hayvanlar% 3 buharlaştırıcı izofluran ve O ₂ gazının% 3 kaynağı ile anestezi altında bulunmaktadır. gözleri veteriner merhem kullanılması anestezi altında iken kuruluğunu önlemeye yardımcı olabilir.

1. Hücre Hazırlanması

1. Uygun ortam, 10 ml 100 mm plakalarında insan endotel ve perisit hücre kültürleri büyütün. hücreler kadar 3 gün% 80 confluency ulaşmak - her 2 taze ortam 10 ml değiştirin.
   1. şirketi ile desteklenmiş tam endotel hücre ortamı (ECM) Kültür endotel hücreleri (EC),% 5 fetal sığır serumu (FBS),% 10 penisilin / streptomisin ve% 10 endotel hücre büyüme takviyesi verilir.
   2. şirket ile desteklenmiş tam perisit medya (PM) Kültür perisitler% 2 FBS,% 10 penisilin / streptomisin ve% 10 perisit büyüme takviyesi verilir.
2. Hücre karışımları hazırlayın
   1. deney ve kontrol grupları için hücrenin gerekli sayısını hesaplayın.
      NOT: Deney grubunda her fiş bir milyon (x 10 ⁶ 1) İnsan ECS ve iki yüz bin (2 x 10 ⁵⁾ perisitleri içerir. Kontrol grubu için, her fiş, 1.2 milyon insan ECS sadece içerir. Negatif kontrol grubu, matris jel imkanına sahiptir. Her bir grup, fişler bir fare alt sırt bölgesinin her iki tarafında enjekte edilebilir iki fare gerektirir en az dört fişler, içermelidir. Üç fişler deney için üç nüsha olarak hizmet edecek ve dördüncü durumda tek başarısız kullanılabilir. jel ekstra hacim maç için% 25 ekstra hücreleri hazırlayın.
   2. Toplayın ve kültür plakalarından hücreleri saymak.
      1. hücreleri ayırmak için, ortamını çıkarın ve oda sıcaklığında 1 x fosfat tamponlu tuzlu su (PBS) ile bir kez yıkanır. PBS kaldır 1 mi% 0.25 tripsin / 2.21 mM EDTA ekleyin ve 1 dakika boyunca inkübe edin. 2 ekleyerek plaka kapalı hücre yıkayınml'lik ortam ve 15 ml bir tüp içinde toplanır.
      2. üreticinin talimatlarına göre bir hemositometre kullanılarak hücre sayısı.
      3. 5 dakika boyunca 400 xg'de bir pelet içine hücrelerin uygun sayıda santrifüj. Deney grubu, santrifüj EC ve aşağı birlikte tek pelet haline perisitler hem.

2. Matris jel çözeltisi,

1. 4 saat ya da homojen bir çözelti elde etmek için gece boyunca 4 ° C'de tam matris jel çözülme. Hiçbir karıştırma gereklidir.
2. 4 ° C'de kısım matrisi 1.5 ml tüpler jel saklayın.
3. Ön-soğutma, steril 1.5 ml tüpler 4 ° C'de 28 G 1 cc insülin şırıngası. Dikkat: Her zaman buz üzerinde matris jel tutun.
4. 1 bir hacim oranında bFGF soğuk matris jel karıştırın: 100 (bFGF nihai konsantrasyon = 0.5 ug / ml bFGF stok çözeltisi = 50 ug / ml) birçok kez aşağı yukarı pipetleme matris jel çözeltisi karıştırıldıktan sonra buz üzerinde inkübe 60 dk b - 30efore adım 3.1 hücrelerle karıştırılması.
   NOT: karıştırmadan önce stok bFGF çözülme. Enjeksiyon için gerekli fişleri sayısını hesaplayın. Örneğin, her bir fiş 200 ul matris jel gerektirir. Bu nedenle,% 25 ekstra jel hazırlamak.

Hücreleri 3. karıştırın Matrix Jel

1. Her bir grup için, bFGF ihtiva eden matris jel hesaplanan hacmi (uygun hücre sayısı ihtiva eden) hücre pelletini. köpük önlemek ve farenin enjeksiyon için hazırlanmaktadır kadar buz üzerinde 15 ml tüp içinde bırakmak için yavaşça karıştırın.

4. Fare Hazırlama

1. Indüksiyon odasında% 3 İsofluranın 5 dakika artı% 3 O ₂ için 1 SCID fareler anestezi. Bir seferde tek deney grubunda, ya da 2 fareler üzerinde odaklanın.
2. aşağı bir ısıtma yastığı ventral tarafta, indüksiyon odasından yer fareyi çıkarın ve hızlı bir şekilde enjeksiyonundan boyunca anestezi sağlamak için olmayan bir geri soluma sistemi aracılığıyla farenin yüzüne burun ağzına takılırSeçim sürecinde. Olmayan geri soluma sistemine indüksiyon odasına gaz akışını açın ve% 1.5 İsofluranın ve% 1.5 O ₂ gaz basıncını düşürmek.
3. Bir tıraş makinesi veya tüy dökücü krem ​​(1 cm çapında etrafında) her iki lateral arka bölgelerden saç kaldırmak.
4. % 70 alkol ped ile cilt alanını silin.
5. indüksiyon odasına fare dönün ve tekrarlayın 4.2 adımları - 4.4 saniye fare ile.

5. Matris Jel Enjeksiyon

1. olmayan geri soluma sistemi takılarak aşağı ısıtma yastığı ventral tarafta koyarak enjeksiyon için bir fare hazırlayın.
2. Bir seferde bir ön-soğutulmuş 28 G 1 cc insülin şırınga bir fare içine matris jel yükleyin.
   1. şırınganın içine iki fişler (200 fiş başına ul artı% 25 ekstra) için matris jel tam 500 ul hacmi yükleyin.
   2. Make ce önlemek için enjektöre hücrelerin yüklenmesi 3 dakika içinde farelere matris jel enjekte eminşırınganın tarafına yerleşme ve şırınga içinde katılaşan gelen matris jel önlemek için rf.
3. Daha sonra, deri altı boşluk bulmak göğüs kafesinin arka posterior deri altı uzaya yavaş yavaş ve eşit matris jel 200 ul enjekte geri cilt kaldırın.
4. enjeksiyon yerinde dışarı sızmasını matris jel önlemek için dikkatli olmak, yavaş yavaş enjeksiyon iğnesi çıkarın. Bir yumru enjeksiyon bölgesinde oluşturacaktır. alkol ped ile enjeksiyon bölgesini silin.
5. 1 dk ısı pad üzerinde matris jel jelleşme izin için daha sonra sırtında fare bırakın, fare arka diğer tarafında 5,5 - tekrarlayın enjeksiyon 5.2 adımları.
6. 14 gün sonra yumru tanımlamak için kalıcı bir kalem kullanarak her iki darbelere özetleyin. bazı saç geri büyür sonra, yumru bulmak daha kolay olacaktır.

6. Matris Jel Tak İzolasyon: 14 Gün Enjeksiyon sonrası

1. hayvan teşhir ederek insanca fareler Euthanizeölümünü sağlamak için servikal dislokasyon tarafından takip karbondioksit inhalasyon> 5 dk.
2. Farenin arkasından matris jel fişini çıkartın.
   1. Yavaşça fiş adımı 4.3 tekrarlayarak bulunduğu enjeksiyon yeri çevresinde regrown tüylerden. işaret çizgisi cilt altında orijinal yumru boyutunu gösterir.
   2. sırasıyla, fişin alt ve üst tarafta takılı çevreleyen deri ve kas tabakaları ile birlikte fişi tüketim.
      1. ince cerrahi makas kullanarak, deriye dik fişin belirgin sınırında bir kesi yapmak ve fiş altındaki kas kesti. Daha sonra, dikkatli bir şekilde belirgin bir sınır boyunca tıpanın dış yüzeyi etrafında kesilir.
      2. cilt ve kas tabakaları arasına sıkıştırılan tutarak fişi çıkarın. Hemen aşırı kan yıkayacak 1x PBS ile küçük bir beher durulayın. fiş (sonraki adım, 6.3) şimdi sabit hazırdır.
3. PLU'nun Fix% 4 paraformaldehid içinde örn.
   1. Sallanan olmaksızın oda sıcaklığında, 24 saat süreyle% 4'lük paraformaldehit, 25 ml ile 50 ml tüp içinde, deri ve kas tabakaları da dahil olmak üzere, tüm fiş, koyun. Bir sonraki gün, parafine önce başka bir 24 saat süre ile,% 70 etanol, 25 ml prize aktarın.
      NOT: dikkatli paraformaldehid tutun. Eldiven giy.

7. Parafin Süreci Matrix Jel Tak

1. parafine için fişi hazırlayın.
   1. Şekil 1a'da gösterilen fiş Orient; fişin yüzü yukarı bakacak ve hem cilt ve kas tabakaları kesit sırasında ilk olarak kesilecek doku blok yüzeyi boyunca görünür böylece doku kasetine fişi yerleştirin.
2. Parafin standart parafin gömme protokollere ¹³ göre fişi gömün.
3. mikroskop Accor slaytlar üzerine doku bloğu 10 indirim mikron kalınlığında kesitler ve montaj - 8 CutStandart parafin kesit protokolleri ¹³ artırılabilir.
4. boyama için hazır olana kadar oda sıcaklığında serin ve kuru bir yerde slaytlar saklayın.

Hematoksilen ve Eosin Leke (H & E) ile 8. Leke Bölüm ¹³

1. iki kez% 100 ksilen üzerinde kaydığı geçirilerek doku bölümleri de-paraffinize,% 100 etanol,% 95 etanol,% 70 etanol ve son olarak da 1 x PBS, oda sıcaklığında 5 dakika boyunca her biri. Bir sonraki adıma kadar 1x PBS slaytlar bırakın.
2. Pipet 100 ul H & E bölümü üzerine çözüm ve 1 inkübe - 5 dakika, ya da 10X büyütmede dik bir ışık mikroskop altında bakıldığında bir hücrede mavi çekirdekleri ve pembe sitoplazma arasında belirgin bir kontrast kalmayıncaya kadar. Herhangi bir H & E çözüm hedefi dokunmasına izin için dikkatli olun.
3. musluk suyu büyük bir beher slayt dunking ile slayt yıkayınız H & E çözümü, daha sonra beher bir rafa slayt yerleştirin ve 2 dakika süreyle akan su ile yıkayın.
4. Moslaytlar monte 9,8 adıma ettik.

İnsan kılcal ve perisitlere 9. Leke Diğer Slaytlar

1. iki kez% 100 ksilen üzerinde kaydığı geçirilerek doku bölümleri de-paraffinize,% 100 etanol,% 95 etanol,% 70 etanol ve son olarak da 1 x PBS, oda sıcaklığında 5 dakika boyunca her biri. Bir sonraki adıma kadar 1x PBS slaytlar bırakın.
2. antijen alma çözeltide bölümleri kaynatın.
   1. 2 L'lik bir beher içinde, bir ısıtma bloğu üzerinde 95 ° C de antijen geri çözelti 1x sitrat tamponu (pH 7.0) kaynar hazırlar.
   2. kaynama sonra, bir metal raf slaytlar yerleştirin ve 20 dakika için kaynar antijen alımı çözelti içinde daldırın.
   3. Dikkatle de daldırılmış slaytlar ısıtma bloğundan beher çıkarın ve çözelti yavaş yavaş 30 dakika boyunca oda sıcaklığına dönmesi beklenmektedir.
   4. Bir sonraki adıma kadar 1x PBS slaytlar yerleştirin.
3. tampon engelleme bölümleri (1x PBS,% 5 Keçi Serum, 0 engelle.3% Triton X-100).
   1. Bir PAP kalemle her bölümün kenarlarında bir hidrofobik bir daire çizin.
   2. tepsinin alt damıtılmış su olan bir nem tepsisine slaytlar yerleştirin.
   3. Emin tüm doku yapım bölümleri üzerine Pipet 100 ul engelleme tampon sıvısı ile kaplıdır (100'den fazla ul gerekebilir).
   4. 1 saat süre ile blokaj tamponu ile bölümleri inkübe edin.
4. primer antikor ile bölümleri inkübe edin.
   1. CD31 (EC) ve seyreltme tamponu içinde seyreltildi düz kas aktini (perisitler) için her bir bölümü (1 x PBS,% 1 BSA,% 0.3 Triton X-100), sonda için iki primer antikorlar ile bir çözelti hazırlayın.
      Not: Burada, bir anti-CD31 yoğunluğu 1:50 ve anti-düz kas aktini konsantrasyonu 1: 300.
   2. gece boyunca damıtılmış su ihtiva eden bir nem tepsisine 100 ul primer antikorlar ile 4 ° C'de bölümleri inkübe edin.
5. 1x PBST (1x PBS +% 0.1 Twe içinde slaytlar üç kez yıkayın5 dakika, her yıkama için en20).
6. ikincil antikor ile bölümleri inkübe edin.
   1. seyreltme tamponu içinde seyreltilmiş anti-CD31 tavşan antikorunu tanıyan bir flüorofor konjuge keçi anti-tavşan ikincil antikoru ile bir çözelti hazırlayın.
      1. NOT: düz kas aktini primer antikor zaten CY3 fluorofor ile konjuge, bu nedenle herhangi bir ikincil antikor boyama gereklidir. 250: Keçi-anti-tavşan ikincil antikoru konsantrasyonu 1'dir.
   2. damıtılmış su ihtiva eden nem tepsisine 100 ul sekonder antikor ile 1 saat boyunca bölümler inkübe edin.
7. 5 dakika, her yıkama için 1x PBST slaytlar üç kez yıkayın.
8. slaytlar monte edin.
   1. Her bölümü üzerine DAPI nükleer boyanma ile antifade montaj çözümün - (60 ul ~ 40) - Pipet 2 3 damla.
   2. Yavaşça bir yer yok. sıvı bölümleri yayılmış için izin bölümleri ve montaj çözümü üzerinde ve kenarlarında 1.5 kapak kaymaKapak kayma. Yavaşça bölümünün üzerine yerleştirilebilir hava kabarcıklarını dışarı basın bir parmağınızı kullanın.
   3. slaytlar dokunmadan önce en az 1 saat kurumasını bekleyin.

10. nicelik değerlendirmesini Kılcal Yoğunluk ve Yapı ¹⁴

1. H & E boyanmış kesitlerde kılcal damarların sayısını, # / mm ² olarak ifade edilir.
   1. 40X büyütme altında dik bir ışık mikroskobu dört farklı alanlarda fotoğrafları edinin.
      Not: Kapiler kırmızı kan hücreleri ile dolu borular olarak tanımlanır.
   2. Seçenek olarak ise, yerine el sayım kılcalların, örneğin damar sayısı, ortalama damar uzunluğu ve çapı ve branş noktası gibi çeşitli anjiyojenez parametrelerini ölçmek için görüntü analizi yazılımı (ör Wimasis Görüntü Analizi) kullanın.
2. immunofluorescent boyanan kesitler kılcal yapısını analiz eder.
   1. bir ters floresan mikroskop dört farklı alanlarda fotoğrafları EdinmeFITC ve TxRed filtre küpü ile.
      1. 488 nm dalga boyunda eksitasyon görüntü EC bir FITC küp kullanın ve 594 nm dalga boyunda eksitasyon görüntü perisitlere bir TxRed küp kullanın.

Sonuçlar

Matris jel fiş bölümlerinin Temsilcisi H & E ve immunofluorescent boyama sadece fişler çoğunlukla içeren fişler ise kanda (sol Şekil 2 top, siyah oklar) ile perfüze olmayan bazı damarları EC ve perisitler hem perfüze birkaç görüntüler gösterilecek EC, Şekil 2'de Bölümler gösterilmektedir CD31-pozitif EC hemen bitişiğinde pozitif SMA boyama ile kanıtlandığı gibi büyük çaplı ve tam perisit kapsama kaplar. Bu sonuçla...

Tartışmalar

Matris jel yatağından tahlili, angiogenesisin, in vivo olarak anjiyogenik ve anti-anjiyojenik bileşikler gen regülasyonu değerlendirmek ve in vitro testler tamamlamak için kullanışlı ve güçlü bir yöntem olduğu kanıtlanmıştır. Burada detaylı olarak damar oluşumu sırasında endotel hücrelerin ve perisitlerin arasındaki etkileşimi inceler insan anjiojenleri yeni bir matris jel yatağından tahlili tarif eder.

Bu protokolde birkaç roman ve kritik adıml...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
PBS (Phosphate buffered saline)	Corning	21-031-CV
0.25% Trypsin/0.53 mM EDTA	Corning	25-053-CI
Endothelial Cell Media (ECM) kit	Sciencell	1001	includes media, EC growth supplement, and penicillin/streptomycin, each supplied at the appropriate volume for easy mixing
Pericyte Media (PM) kit	Sciencell	1201	includes media, Pericyte growth supplement, and penicillin/streptomycin, each supplied at the appropriate volume for easy mixing
primary human pulmonary microvascular endothelial cells	Pulmonary Hypertension Breakthrough Initiative		this cell type is also available commercially. Cells used at passage 1-4
primary human pulmonary pericytes	Pulmonary Hypertension Breakthrough Initiative		this cell type is not available commercially, but brain paricytes are.  Cells used at passage 1-4
bFGF (basic Fibroblast Growth Factor)	Peprotech	100-18B	stock solution is 50 μg/ml in 0.1% BSA in PBS, aliquots at 50 μl and stored at -20 degrees
Matrigel Basement Membrane Matrix	BD	356237
28 G 1 cc Insluin Syringe	BD	329410
SCID (Severe Combined Immune Deficiency) mice	The Jackson Laboratory	5557	NOD.SCID IL2R gamma knockout strain is the best strain; 4-6 weeks of age
1.5 ml microcentrifuge tubes, sterile	Thermo Fisher Scientific	05-408-129
15 ml screw top tubes, sterile	BD Biosciences	352096
PAP pen	Life Technologies	8899
hemocytometer	ThermoFisher Scientific	02-671-6
Nair hair removal cream	Walmart
anti-human CD31 primary antibody	LifeSpan Biosciences	LS-B4737	working solution is 1:50
anti-human Smooth Muscle actin CY3 primary fluorescent antibody	Sigma	C6198	working solution is 1:300
goat anti-rabbit secondary antibody; 488/green	ThermoFisher Scientific	A-11008	working solution is 1:250
Prolong Gold DAPI solution	Cell Signaling	8961S
microscope slides	VWR	48300-047
no. 1.5 cover slips	Thermo Fisher Scientific	12-544-D
citrate buffer 10x	Millipore	21545
extra fine surgical scissors	Fine Science Tools	14084-08
Formalin (paraformaldehyde)	Thermo Fisher Scientific	245-685
Tissue cassettes	Simport	M492-12
goat serum	Dako	X0907