Etude in vivo de Human Interaction Endothelial-péricytes Utilisation du Gel Matrice Plug - test chez la souris

Résumé

Nous présentons un protocole pour étudier les interactions endothéliale péricytes humaines chez la souris en utilisant une variante du test d'angiogenèse bouchon de gel de matrice.

Résumé

Angiogenesis is the process by which new blood vessels are formed from existing vessels. New vessel growth requires coordinated endothelial cell proliferation, migration, and alignment to form tubular structures followed by recruitment of pericytes to provide mural support and facilitate vessel maturation. Current in vitro cell culture approaches cannot fully reproduce the complex biological environment where endothelial cells and pericytes interact to produce functional vessels. We present a novel application of the in vivo matrix gel plug assay to study endothelial-pericyte interactions and formation of functional blood vessels using severe combined immune deficiency mutation (SCID) mice. Briefly, matrix gel is mixed with a solution containing endothelial cells with or without pericytes followed by injection into the back of anesthetized SCID mice. After 14 days, the matrix gel plugs are removed, fixed and sectioned for histological analysis. The length, number, size and extent of pericyte coverage of mature vessels (defined by the presence of red blood cells in the lumen) can be quantified and compared between experimental groups using commercial statistical platforms. Beyond its use as an angiogenesis assay, this matrix gel plug assay can be used to conduct genetic studies and as a platform for drug discovery. In conclusion, this protocol will allow researchers to complement available in vitro assays for the study of endothelial-pericyte interactions and their relevance to either systemic or pulmonary angiogenesis.

Introduction

L' angiogenèse est le processus par lequel de nouveaux vaisseaux sanguins sont formés à partir d' un réseau vasculaire préexistant ¹ et est le centre de recherche en cours dans de nombreux domaines allant du développement normal de la maladie. Ce processus dynamique implique la prolifération et la migration des cellules endothéliales (EC) et le recrutement des pericytes pour construire un tube vasculaire qui est dirigée vers le site qui a besoin d' oxygène et de nutriments livraison ^2. Pour étudier ce processus nécessite une analyse aussi dynamique, le plus important qui peut récapituler le caractère tridimensionnel de la formation du tube. Les essais in vitro de la matrice 3D ont été développés pour répondre à ce besoin et ont bien fonctionné pour permettre aux chercheurs de définir les étapes discrètes dans l' espace et le temps dans lequel l' angiogenèse a lieu ^{3, 4, 5, 6.} Cependant, ces modèles in vitro de la matrice 3D sont limitées à l' étude des navires non-perfusé uned manquent donc des éléments essentiels pertinents pour le processus de l' angiogenèse (par exemple, circulant croissance et facteurs inhibiteurs, la tension contre - nature / forces à travers le lit vasculaire) et ne parviennent pas à simuler l'environnement complexe présent dans les tissus vivants. Pour remédier à cette limitation, plusieurs essais in vivo de l' angiogenèse ont été mis au point ^7, y compris le bouchon dosage de gel de matrice qui sera l'objet de notre rapport ^{8, 9.}

Le dosage de bouchon de gel de matrice est un test in vivo bien établi dans l' angiogenèse qui fait appel à des chercheurs car il offre une plate - forme robuste pour tester les rôles des différentes cellules et de substances dans l' angiogenèse. gel de Matrix est une solution de la membrane basale disponible dans le commerce qui est sécrétée par la lignée cellulaire de sarcome de souris Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) qui se solidifie en une matière analogue à un gel à 37 ° C. Le gel de la matrice peut être mélangée avec des cellules et / ou des substances telles que des facteurs de croissance et injeCTED sous-cutanée dans la souris. L'hôte CEs va envahir le bouchon de plus de 14 jours, former un réseau vasculaire, et devenir perfusé avec le sang de l'hôte. À ce jour, les plug essais de gel de la matrice ont toutefois porté exclusivement sur l'étude du comportement des cellules endothéliales lors de l'angiogenèse, au meilleur de notre connaissance, aucun effort n'a encore été faite pour déterminer si ce test peut être utilisé pour la co-culture de cellules endothéliales et péricytes pour étudier comment ces deux types de cellules interagissent au cours de l'angiogenèse. Plus précisément, la compréhension de la relation entre les CEs et péricytes est précieux pour l' étude des maladies où la perte de vaisseaux sanguins est pathologique, y compris microvasculaire ischémie et la maladie vasculaire périphérique ^{10, 11, 12.}

Ici, nous décrivons un protocole qui introduit péricytes d'origine humaine au mélange de gel de matrice avec CEs humaine et le facteur de croissance des fibroblastes (bFGF). Ce mélange peut ensuite être injecté par voie sous cutanée in le dos de souris SCID pour permettre la formation de, péricytes enduits, les navires hybrides entièrement fonctionnels. Notre protocole décrit comment préparer des fiches de gel de matrice contenant CEs humaines avec ou sans péricytes humains, le placement dans des souris SCID et la façon d'analyser les coupes histologiques critères d'angiogenèse critiques.

Protocole

Déclaration d'éthique: Les procédures impliquant des sujets animaux ont été approuvés par l'Institutional Animal Care et l'utilisation Comité à l'école de médecine de l'Université de Stanford.

NOTE: Les animaux sont sous anesthésie avec 3% d' isoflurane de vaporisateur et 3% fourniture de gaz O _2. L'utilisation de vétérinaire pommade sur les yeux peut aider à prévenir la sécheresse sous anesthésie.

1. Préparation des cellules

1. Cultivez endothéliales et cellules péricytes cultures humaines dans des plaques de 100 mm avec 10 ml du support approprié. Remplacer 10 ml de milieu frais tous les 2 - 3 jours jusqu'à ce que les cellules atteignent 80% de confluence.
   1. la culture de cellules endothéliales (EC) dans un milieu complet des cellules endothéliales (ECM) additionné de compagnie fourni 5% de sérum bovin fœtal (FBS), 10% de pénicilline / streptomycine et de supplément de croissance de cellules endothéliales de 10%.
   2. péricytes de culture dans les médias de péricytes complète (PM) supplémenté avec la société fournis 2% de FBS, 10% de pénicilline / streptomycine et le supplément de croissance des péricytes 10%.
2. Préparer des mélanges de cellules
   1. Calculer le nombre requis de cellules pour les groupes expérimentaux et de contrôle.
      NOTE: Chaque bouchon dans le groupe expérimental contient un million (1 x 10 ⁶⁾ CEs humaine et deux cent mille (2 x 10 ⁵⁾ péricytes. Pour le groupe de contrôle, chaque fiche ne contient que 1,2 million CEs humaines. Le groupe témoin négatif a un gel de matrice seulement. Chaque groupe doit comprendre au moins quatre prises, ce qui nécessiterait deux souris que des bouchons peuvent être injectés dans chaque côté du bas du dos d'une souris. Trois fiches serviraient triple pour l'expérience et le quatrième pourrait être utilisé dans le cas où l'on échoue. Préparer 25% de cellules supplémentaires en fonction du volume supplémentaire de gel.
   2. Recueillir et compter les cellules à partir des plaques de culture.
      1. Pour détacher les cellules, enlever les médias et laver une fois avec 1x température ambiante tampon phosphate salin (PBS). Retirer du PBS, ajouter 1 ml de trypsine à 0,25% EDTA / 2,21, et on incube pendant 1 min. Laver les cellules de la plaque en ajoutant 2ml de milieu et de recueillir dans un tube de 15 ml.
      2. Nombre de cellules en utilisant un hémocytomètre selon les instructions du fabricant.
      3. Centrifuger le nombre approprié de cellules en une pastille à 400 g pendant 5 min. Pour le groupe expérimental, centrifugeuse à la fois CEs et péricytes vers le bas en une seule pastille.

2. Matrice Gel Préparation

1. Dégeler gel de matrice complètement à 4 ° C pendant 4 heures ou toute la nuit pour obtenir une solution homogène. Pas de mélange est nécessaire.
2. Aliquoter gel de matrice dans 1,5 ml tubes et conserver à 4 ° C.
3. Pré-refroidissement stériles tubes de 1,5 ml et 28 G 1 insuline cc seringues à 4 ° C. Attention: Gardez le gel de la matrice sur la glace en tout temps.
4. Mélanger un gel de matrice à froid avec du bFGF dans un rapport volumique de 1: 100 (concentration finale de bFGF = 0,5 ug / ml; bFGF solution mère = 50 pg / ml) Après avoir mélangé la solution de gel de matrice, par pipetage de haut en bas plusieurs fois, laisser incuber sur de la glace pour 30 - 60 min bvant le mélange avec les cellules à l'étape 3.1.
   NOTE: Décongeler le stock bFGF avant le mélange. Calculer le nombre de bouchons nécessaires pour l'injection. Par exemple, chaque bouchon nécessite un gel de matrice 200 ul. Par conséquent, préparer 25% de gel supplémentaire.

3. Gel de matrice avec des cellules Mix

1. Pour chaque groupe, remettre en suspension le culot cellulaire (contenant le nombre de cellules approprié) avec le volume calculé de gel de matrice contenant du bFGF. Mélanger doucement pour éviter de faire mousser et laisser dans le tube de 15 ml sur la glace jusqu'à ce que les souris sont préparées pour l'injection.

4. Préparation de la souris

1. 1 anesthésier les souris SCID pendant 5 min à 3% d' isoflurane plus 3% de O ₂ dans une chambre d'induction. Focus sur un groupe expérimental, ou 2 souris, à la fois.
2. Retirez la souris de la chambre d'induction, lieu sur une face ventrale du coussin chauffant vers le bas et fixer rapidement une buse de museau sur le visage de la souris via un système non-réinhalation pour fournir une anesthésie tout au long du InjeProcédure ction. Commuter l'écoulement de gaz depuis la chambre d'admission du système de non-réinhalation et d' abaisser la pression de gaz à 1,5% d' isoflurane et de 1,5% de O _2.
3. Enlever les poils des deux régions postérieures latérales (environ 1 cm de diamètre) avec une crème dépilatoire rasoir ou des cheveux.
4. Essuyez la zone de la peau avec un tampon d'alcool à 70%.
5. Retour de la souris à la chambre d'induction et répétez les étapes 4.2 à 4.4 avec la seconde souris.

Gel Matrice 5. Injection

1. Préparer une souris pour l'injection en se fixant sur le système non-réinhalation et en plaçant sur la face ventrale du coussin chauffant vers le bas.
2. Charger le gel de matrice dans un pré-refroidie 28 G 1 cc une seringue à insuline de souris à la fois.
   1. Chargez le volume de 500 pi complète de gel de matrice pour deux bouchons (200 pi par prise, plus de 25% supplémentaires) dans la seringue.
   2. Assurez-vous d'injecter le gel de la matrice dans les souris en 3 minutes de chargement des cellules dans la seringue pour empêcher la CEIIs de se fixer sur le côté de la seringue et pour empêcher le gel de la matrice de se solidifier à l'intérieur de la seringue.
3. Soulevez la peau du dos pour localiser l'espace sous-cutané, puis injecter 200 ul du gel de la matrice lentement et uniformément dans l'espace sous-cutané de la partie postérieure arrière de la cage thoracique.
4. Retirer l'aiguille d'injection lentement, en prenant soin d'éviter le gel de la matrice de fuir du site d'injection. Une bosse se forme au niveau du site d'injection. Essuyez site d'injection avec un tampon d'alcool.
5. étapes injection répétée 05.02 à 05.05 de l'autre côté du dos de la souris, puis laisser la souris sur son dos pendant 1 min pour permettre la gélification du gel de matrice sur le coussin chauffant.
6. Décrire les deux bosses à l'aide d'un marqueur permanent pour identifier la bosse après 14 jours. Après quelques cheveux repoussent, il sera plus facile de trouver la bosse.

6. Matrice Gel plug Isolation: 14 jours après l'injection

1. Euthanasier les souris humainement en exposant l'animals à> 5 min d'inhalation de dioxyde de carbone suivie d'une dislocation cervicale pour assurer la mort.
2. Retirez le bouchon de gel de la matrice du dos de la souris.
   1. Retirez délicatement les cheveux regrown autour du site d'injection où le bouchon est situé par l'étape 4.3 répéter. La ligne de marqueur indique la taille de bosse d'origine sous la peau.
   2. Exciser la fiche ainsi que les couches de la peau et des muscles environnants attachés sur les faces supérieure et inférieure de la fiche, respectivement.
      1. Avec des ciseaux chirurgicaux fines, faire une incision à la frontière marquée de la fiche qui est perpendiculaire à la peau et couper à travers le muscle sous le bouchon. Ensuite, couper soigneusement autour de la périphérie du bouchon le long de la frontière marquée.
      2. Enlever le bouchon, en le maintenant pris en sandwich entre les couches de la peau et des muscles. Rincer immédiatement dans un petit bécher avec PBS 1x pour laver l'excès de sang. Le bouchon est maintenant prêt à être fixé (étape suivante, 6.3).
3. Fixer les plug dans 4% de paraformaldehyde.
   1. Placer l'ensemble de bouchon, y compris les couches de peau et de muscle, dans un tube de 50 ml avec 25 ml de paraformaldehyde à 4% pendant 24 heures à température ambiante, sans basculer. Le lendemain, le transfert de la fiche dans 25 ml d'éthanol à 70% pendant 24 heures avant l'inclusion en paraffine.
      REMARQUE: Manipulez paraformaldéhyde avec prudence. Porter des gants.

7. Paraffine Process le Gel Plug-matrice

1. Préparer le bouchon pour l'inclusion en paraffine.
   1. Orientez la fiche comme illustré sur la figure 1a; placer le bouchon dans une cassette de tissu de telle sorte que le côté du bouchon est orientée vers le haut et les deux couches de peau et de muscle sont visibles à travers la surface du bloc de tissu qui sera coupée en premier lors de la coupe.
2. Paraffine intégrer la prise selon les protocoles de paraffine enrobage standards ^13.
3. Couper 8 - 10 um d'épaisseur des sections hors du bloc de tissu et monter sur des lames de microscope according aux protocoles de paraffine sectionnant standards ^13.
4. Stocker les diapositives dans un endroit frais et sec à la température ambiante avant d'être prêt pour la coloration.

8. Stain Sections avec hématoxyline et éosine (H & E) ¹³

1. De-paraffinize les coupes de tissu en faisant passer les lames à 100% de xylene deux fois, 100% d'éthanol, 95% d'éthanol, 70% d'éthanol et enfin 1 x PBS, chacun pendant 5 minutes à température ambiante. Laisser les lames dans 1x PBS jusqu'à ce que la prochaine étape.
2. Pipeter 100 ul H & E solution sur la section et incuber pendant 1 - 5 min ou jusqu'à ce qu'il y ait un contraste clair entre les noyaux bleus et cytoplasme rose dans une cellule telle que vue sous un microscope à lumière verticale à un grossissement de 10X. Faites attention à ne pas laisser la solution H & E toucher l'objectif.
3. Laver H & E solution hors de la diapositive par tremper la lame dans un grand bêcher d'eau du robinet, puis placez la lame dans un rack dans le bécher et rincer à l'eau courante pendant 2 min.
4. Move à l'étape 9.8 pour monter les diapositives.

9. Stain Autres Diapositives pour Capillaires humaines et péricytes

1. De-paraffinize les coupes de tissu en faisant passer les lames à 100% de xylene deux fois, 100% d'éthanol, 95% d'éthanol, 70% d'éthanol et enfin 1 x PBS, chacun pendant 5 minutes à température ambiante. Laisser les lames dans 1x PBS jusqu'à ce que la prochaine étape.
2. Faire bouillir les sections dans une solution de récupération d'antigène.
   1. Dans un bécher de 2 L, de préparer une solution bouillante de récupération d'antigène en utilisant un tampon citrate 1x (pH 7,0) à 95 ° C sur un bloc chauffant.
   2. Une fois l'ébullition, placer les lames dans un rack métallique et plonger dans la solution de récupération d'antigène d'ébullition pendant 20 min.
   3. Retirez délicatement le bécher du bloc de chauffage avec les lames encore submergées et laissez la solution revenir lentement à la température ambiante pendant environ 30 min.
   4. Placer les lames dans PBS 1x jusqu'à l'étape suivante.
3. Bloquer les sections dans un tampon de blocage (1x PBS, 5% de sérum de chèvre, 00,3% de Triton X-100).
   1. Tracez un cercle hydrophobe autour des bords de chaque section avec un stylo PAP.
   2. Placer les lames dans un bac d'humidité avec de l'eau distillée au fond du bac.
   3. Distribuer 100 ul du tampon de blocage sur les sections en veillant à tout le tissu est couvert par un fluide (peut nécessiter plus de 100 pi).
   4. Incuber les sections avec du tampon de blocage pendant 1 h.
4. Incuber sections avec l'anticorps primaire.
   1. Préparer une solution avec deux anticorps primaires pour sonder chaque section pour CD31 (EC) et de l'actine des muscles lisses (les pericytes) dilué dans du tampon de dilution (1 x PBS, 1% de BSA, 0,3% de Triton X-100).
      NOTE: Ici, la concentration anti-CD31 est 01h50 et la concentration de l'actine musculaire lisse est anti-1: 300.
   2. Incuber les sections pendant une nuit à 4 ° C avec 100 ul d'anticorps primaires dans un bac d'humidité contenant de l'eau distillée.
5. Laver les lames trois fois en 1x PBST (1x PBS + 0,1% TweEN20) pendant 5 min à chaque lavage.
6. Incuber les sections avec un anticorps secondaire.
   1. Préparer une solution avec une chèvre conjuguée à un anticorps secondaire anti-lapin fluorophore pour reconnaître l'anticorps de lapin anti-CD31 dilué dans du tampon de dilution.
      1. NOTE: L'anticorps primaire actine du muscle lisse est déjà conjugué à un fluorophore CY3, de sorte qu'aucune coloration d'anticorps secondaire est nécessaire. lapin concentration d'anticorps secondaire de chèvre anti est égal à 1: 250.
   2. Incuber les sections pendant 1 heure avec 100 pi d'anticorps secondaire dans le bac d'humidité contenant de l'eau distillée.
7. Laver les lames trois fois 1x PBST pendant 5 minutes chaque lavage.
8. Monter les lames.
   1. Pipette 2 - 3 gouttes (~ 40 - 60 pi) de antifade solution de montage avec DAPI coloration nucléaire sur chaque section.
   2. Placez délicatement un non. 1,5 lamelle sur les sections et solution de montage, permettant au fluide d'étaler sur les sections et les bords dela lamelle. utiliser doucement un doigt pour appuyer sur les bulles d'air qui peuvent être situés sur la section.
   3. Laissez les diapositives sécher pendant au moins 1 h avant de le manipuler.

10. Quantifier Capillaire Densité et structure ¹⁴

1. Comptez le nombre de capillaires dans H & E coupes colorées, exprimée en # / mm ^2.
   1. Acquérir des photos de quatre domaines différents sur un microscope à lumière verticale sous un grossissement de 40X.
      NOTE: Les capillaires sont identifiés comme des tubes remplis de globules rouges.
   2. Alternativement, au lieu des capillaires de comptage manuel, utiliser un logiciel d'analyse d'image (par exemple, Wimasis Analyse d'image) pour quantifier différents paramètres de l' angiogenèse tels que le nombre de navires, la longueur du navire moyen et le diamètre, et des points de branchement.
2. Analyser la structure capillaire dans les sections d'immunofluorescence colorées.
   1. Acquérir des photos de quatre domaines différents sur un microscope à fluorescence inverséavec FITC et TxRed cube de filtre.
      1. Utilisez un cube FITC à l'image CEs par une excitation à 488 nm de longueur d'onde et d'utiliser un cube TxRed à péricytes d'image par excitation à 594 nm de longueur d'onde.

Résultats

Représentant H & E et immunofluorescence de sections de bouchon de gel de la matrice sont présentés dans la figure 2. Les articles de la CE uniquement les fiches présentent certains navires qui ne sont généralement pas perfusées avec du sang (Figure 2 en haut à gauche, flèches noires) , tandis que les bouchons contenant à la fois CEs et péricytes afficher plusieurs perfusé les navires avec des diamètres plus grands et une couverture comp...

Discussion

Le bouchon de gel dosage de la matrice est avérée être un moyen pratique et efficace d'évaluer la régulation des gènes dans l' angiogenèse, angiogéniques et anti - angiogéniques in vivo, et pour compléter les tests in vitro. Ici, nous décrivons en détail un nouveau bouchon essai de gel de la matrice de l'angiogenèse humaine qui étudie l'interaction entre les cellules et les pericytes endothéliales lors de la formation des vaisseaux.

Il y a que...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
PBS (Phosphate buffered saline)	Corning	21-031-CV
0.25% Trypsin/0.53 mM EDTA	Corning	25-053-CI
Endothelial Cell Media (ECM) kit	Sciencell	1001	includes media, EC growth supplement, and penicillin/streptomycin, each supplied at the appropriate volume for easy mixing
Pericyte Media (PM) kit	Sciencell	1201	includes media, Pericyte growth supplement, and penicillin/streptomycin, each supplied at the appropriate volume for easy mixing
primary human pulmonary microvascular endothelial cells	Pulmonary Hypertension Breakthrough Initiative		this cell type is also available commercially. Cells used at passage 1-4
primary human pulmonary pericytes	Pulmonary Hypertension Breakthrough Initiative		this cell type is not available commercially, but brain paricytes are.  Cells used at passage 1-4
bFGF (basic Fibroblast Growth Factor)	Peprotech	100-18B	stock solution is 50 μg/ml in 0.1% BSA in PBS, aliquots at 50 μl and stored at -20 degrees
Matrigel Basement Membrane Matrix	BD	356237
28 G 1 cc Insluin Syringe	BD	329410
SCID (Severe Combined Immune Deficiency) mice	The Jackson Laboratory	5557	NOD.SCID IL2R gamma knockout strain is the best strain; 4-6 weeks of age
1.5 ml microcentrifuge tubes, sterile	Thermo Fisher Scientific	05-408-129
15 ml screw top tubes, sterile	BD Biosciences	352096
PAP pen	Life Technologies	8899
hemocytometer	ThermoFisher Scientific	02-671-6
Nair hair removal cream	Walmart
anti-human CD31 primary antibody	LifeSpan Biosciences	LS-B4737	working solution is 1:50
anti-human Smooth Muscle actin CY3 primary fluorescent antibody	Sigma	C6198	working solution is 1:300
goat anti-rabbit secondary antibody; 488/green	ThermoFisher Scientific	A-11008	working solution is 1:250
Prolong Gold DAPI solution	Cell Signaling	8961S
microscope slides	VWR	48300-047
no. 1.5 cover slips	Thermo Fisher Scientific	12-544-D
citrate buffer 10x	Millipore	21545
extra fine surgical scissors	Fine Science Tools	14084-08
Formalin (paraformaldehyde)	Thermo Fisher Scientific	245-685
Tissue cassettes	Simport	M492-12
goat serum	Dako	X0907