Preparación y<em&gt; In Vitro</em&gt; Caracterización de los agentes de contraste basados ​​en dendrímeros de Imágenes por Resonancia Magnética

Resumen

Este protocolo describe la preparación y caracterización de un agente de contraste dendrimérica imágenes de resonancia magnética (MRI) que lleva a base cyclen-quelatos macrocíclicos de coordinación iones paramagnéticos de gadolinio. En una serie de experimentos de resonancia magnética en vitro, este agente produce una señal de MRI amplificado en comparación con el análogo monomérico disponible comercialmente.

Resumen

complejos paramagnéticos de gadolinio (III) con acíclico o quelatos macrocíclicos son los agentes de contraste más utilizados (CAS) para la formación de imágenes por resonancia magnética (MRI). Su propósito es mejorar la velocidad de relajación de protones del agua en el tejido, aumentando así el contraste de la imagen MR y la especificidad de las mediciones de resonancia magnética. Los agentes de contraste clínicamente aprobados actuales son moléculas de bajo peso molecular que se eliminan rápidamente del cuerpo. El uso de dendrímeros como portadores de quelantes paramagnéticas puede desempeñar un papel importante en el futuro desarrollo de agentes de contraste para MRI más eficientes. En concreto, el aumento de la concentración local de los resultados especie paramagnética en un mayor contraste de la señal. Además, esta CA proporciona un tiempo de retención de tejido más largo debido a su alto peso molecular y el tamaño. Aquí, se demuestra un procedimiento conveniente para la preparación de agentes de contraste macromoleculares de resonancia magnética a base de poli (amidoamina) (PAMAM) con monomacrocíclicos quelantes de tipo DOTA (DOTA - 1,4,7,10-tetraazaciclododecano-1,4,7,10-tetraacetato). La unidad quelante se adjuntó explotando la reactividad del grupo isotiocianato (NCS) hacia los grupos de superficie amina del dendrímero PAMAM para formar puentes de tiourea. productos dendrímeros se purificaron y se analizaron por medio de espectroscopía de resonancia magnética nuclear, espectrometría de masas y análisis elemental. Por último, de alta resolución las imágenes de RM se registraron y se compararon los contrastes de señal obtenidos a partir de la dendrimérica preparados y los agentes monoméricos disponibles comercialmente.

Introducción

La resonancia magnética (RM) es una técnica de imagen de gran alcance y no ionizantes ampliamente utilizado en la investigación biomédica y el diagnóstico clínico debido a su naturaleza no invasiva y excelente contraste de los tejidos blandos intrínseca. Los métodos de resonancia magnética utilizados más comúnmente utilizan la señal obtenida a partir de los protones del agua, proporcionando imágenes de alta resolución e información detallada dentro de los tejidos en base a las diferencias en la densidad de las señales de agua. La intensidad de la señal y la especificidad de los experimentos de resonancia magnética se pueden mejorar aún más el uso de agentes de contraste (CAS). Estos son especies paramagnéticas o superparamagnéticas que afectan a la longitudinal (T ₁₎ y transversal (T ₂₎ tiempos de relajación, respectivamente ^1,2.

Los complejos de gadolinio de iones lantánidos con ligandos de ácido poliamino policarboxílicos son los más comúnmente utilizados T ₁ AC. Gadolinio (III) acorta la relajación T ₁tiempo de protones del agua, lo que aumenta el contraste de la señal en la RM experimentos ^3. Sin embargo, el gadolinio iónico es tóxico; su tamaño se aproxima al de calcio (II), y afecta seriamente calcio asistida señalización en las células. Por lo tanto, se emplean acíclicos y macrocíclicos quelatos para neutralizar esta toxicidad. Varios ligandos polidentados se han desarrollado hasta el momento, dando como resultado complejos de gadolinio (III) con alta estabilidad termodinámica e inercia cinética ^1. Los basados ​​en los cyclen azamacrocycle de 12 miembros, en particular, su tetracarboxílico DOTA derivado (1,4,7,10-tetraazaciclododecano-1,4,7,10-tetraacetato) son los complejos más investigados y aplicados de esta clase CA.

Sin embargo, de tipo GdDOTA CAs son sistemas de bajo peso molecular, que presentan ciertas desventajas tales como la baja eficiencia de contraste y la excreción renal rápido. Macromolecular y multivalente entidades emisoras pueden ser una buena solución a estos problemas ^4. Desde CA biodistribución está determinada principalmente por su tamaño, AC macromoleculares muestran tiempos de retención más largos dentro de los tejidos. Igualmente importante, la polivalencia de estos agentes da como resultado un aumento de la concentración local de la sonda monomérica MR (por ejemplo, complejo GdDOTA), mejorando sustancialmente la señal de MR adquirida y la calidad de la medición.

Los dendrímeros son algunos de los andamios más preferidos para la preparación de multivalente CAs para MRI ^4,5. Estas macromoléculas altamente ramificadas con tamaños bien definidos son propensos a diversas reacciones de acoplamiento en su superficie. En este trabajo se reporta la preparación, purificación y caracterización de un dendrímero CA para la resonancia magnética que consiste en un poli 4 (G4) generación (amidoamina) (PAMAM) dendrímero acoplado a quelatos GdDOTA-como (DCA). Se describe la síntesis del derivado de DOTA reactivo y su acoplamiento al dendrímero PAMAM. Tras la formación de complejos con Gd (III), la caracterización físico-química estándar procedire de DCA se realizó. Por último, se realizaron experimentos de resonancia magnética para demostrar la capacidad de DCA para producir imágenes de RM con un contraste más fuerte que los obtenidos de bajo peso molecular CAs.

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Protocolo

1. Preparación de DCA

1. Síntesis de la unidad monomérica 4 ^6.
   1. Síntesis de 4- (4-nitrofenil) -2- (terc 4,7,10-tris- -butoxycarbonylmethyl-1,4,7,10-tetraazaciclododec-1-il) éster de ácido butírico tert -butil (2).
      1. Disolver (terc 4,7-bis- -butoxycarbonylmethyl-1,4,7,10-tetraaza-cyclododec-1-il) éster terc -butílico del ácido acético 1 (1,00 g, 1,94 mmol) en N, N-dimetilformamida ( DMF, 5 ml), añadir carbonato de potasio (0,67 g, 4,86 ​​mmol, 2,5 equiv.) y se agita la mezcla a temperatura ambiente durante 45 min.
         NOTA: Macrociclo 1 se preparó a partir cyclen y terc-butil bromoacetato de acuerdo con el procedimiento previamente publicado ^7.
      2. Añadir terc-butil-2-bromo-4- (4-nitrofenil) butanoato de etilo (0,87 g, 2,53 mmol, 1,3 equiv.) En porciones durante 1 hr. Se continúa agitando la mezcla bajo tél mismas condiciones de reacción para los siguientes 18 horas.
         Nota: butil-2-bromo-4-terc-(4-nitrofenil) butanoato de etilo Se preparó a partir de 4- (4-nitrofenil) ácido butírico, cloruro de tionilo, y bromo de acuerdo con el procedimiento publicado previamente ^8.
      3. Eliminar DMF por medio de destilación al vacío de bulbo a bulbo a 40-60 ° C ^9.
      4. Se purifica el residuo por cromatografía en columna (gel de sílice, metanol al 7% / diclorometano) para obtener el producto 2 como un sólido amorfo de color marrón (1,09 g, 72%) ^10.
   2. Síntesis de 4- (4-aminofenil) -2- (terc 4,7,10-tris- -butoxycarbonylmethyl-1,4,7,10-tetraazaciclododec-1-il) éster de ácido butírico tert -butil (3).
      1. Se disuelve el derivado de nitrobenceno 2 (1,00 g, 1,28 mmol) en etanol (10 ml) y 7 N solución de amoniaco en metanol (150 l). Añadir paladio sobre carbón activado como catalizador (Pd / C, 150 mg, 15% en peso) a la solutien.
      2. Agitar la mezcla heterogénea durante 16 h bajo una atmósfera de hidrógeno (2,5 bar) en el aparato hidrogenador Parr.
      3. Preparar una torta de tierra de diatomeas suspendiéndolo en etanol y la filtración de la suspensión a través de un embudo de vidrio sinterizado. Se vierte la suspensión de la 1.1.2.2 sobre el pastel preparado para eliminar el catalizador Pd / C por filtración.
      4. Eliminar el disolvente por destilación suave en un evaporador rotativo (temperatura del baño de agua ~ 40 ° C) para obtener el compuesto 3 como un sólido amorfo de color marrón (0,91 g, 95%).
   3. Síntesis de 4- (4-isotiocianatofenil) -2- éster (4,7,10-tris- terc--butoxycarbonylmethyl 1,4,7,10- tetraazaciclododec-1-il) butírico tert -butil ácido (4).
      1. Añadir tiofosgeno (0,124 ml, 1,58 mmol, 1,3 equiv.) A una mezcla de 3 (0,91 g, 1,22 mmol) y trietilamina (0,685 ml, 4,87 mmol, 4 equiv.) En diclorometano (15 ml).
      2. Agite enérgicamente las millas de reacciónxture con un agitador magnético a temperatura ambiente durante 16 hr.
      3. Eliminar el disolvente por destilación suave en un evaporador rotativo (temperatura del baño de agua ~ 40 ° C) y, a continuación purificar el producto bruto por cromatografía en columna (gel de sílice, 5% de metanol / diclorometano) para obtener el producto 4 como un sólido marrón claro amorfo (0,51 g, 53%).
2. Síntesis del dendrímero DCA.
   1. Síntesis del dendrímero 5.
      1. Tome dendrímero G4-PAMAM (667 mg, 10% de solución de dendrímero en metanol, 4,67 mmol), se evapora el metanol por destilación suave en un evaporador rotativo (temperatura del agua de baño ~ 40 ° C), y disolver el residuo en DMF (4 ml) .
      2. Se añade trietilamina (0,105 ml, 0,75 mmol, 160 equiv.), Se agita durante 45 min a 60 ° C, y añadir isotiocianato de 4 (354 mg, 0,45 mmol, 1,5 equiv. En relación con los grupos superficiales amino del dendrímero) ove porcionesr 1 hr.
      3. Se agita la mezcla de reacción con un agitador magnético a 45 ° C durante 48 hr.
      4. Se elimina el disolvente mediante destilación a vacío de bulbo a bulbo a 40-60 ° C.
      5. Se purifica el residuo por cromatografía de exclusión por tamaño usando un medio de filtración en gel lipofílico y metanol como eluyente. Para empaquetar la columna, se hinchan los medios de filtración en metanol durante al menos 3 horas a temperatura ambiente (> 4 ml de metanol por 1 g de polvo) sin aplicar presión. Realizar la separación por gravedad recogiendo fracciones de 1 ml.
      6. Analizar las fracciones recogidas con cromatografía en capa fina (TLC). Desarrollar la placa de TLC en metanol al 15% / diclorometano (sólo el lugar más polar se encuentra en la línea de base se deriva del producto dendrímero). Se evaporan las fracciones recogidas por destilación suave en un evaporador rotativo (temperatura del baño de agua ~ 40 ° C) para obtener el producto 5 (270 mg, 91%).
   2. Síntesis del dendrímero 6.
      1. Disolver el quelante protegido dendrimérica 5 (270 mg, 4,23 mmol) en ácido fórmico (5 ml) y se agita la mezcla a 60 ° C durante 24 hr.
      2. Se evapora el ácido fórmico por destilación en un evaporador rotatorio (~ 15 mbar de presión, temperatura del baño de agua ~ 40 ° C) y liofilizar el producto para dar 6 (presión ~ 0,2 mbar) ^9.
   3. Síntesis del agente de contraste dendrimérica (DCA)
      1. Disolver el quelante dendrimérica 6 (4,35 mol) en agua y ajustar el pH a 7,0 con hidróxido de sodio 0,1 M.
      2. Disolver GdCl ₃ · 6H ₂ O (113 mg, 304 mmol) en agua (1 ml) y agregarlo gota a gota a la solución de agente quelante 6 durante un período de 4 horas; mantener el pH a 7,0 con solución de hidróxido de sodio acuoso (0,05 M) mediante la medición de pH con un medidor de pH.
      3. Se agita la mezcla con un agitador magnético en la sala de tEMPERATURA durante 24 horas.
      4. Añadir ácido etilendiaminotetraacético (EDTA, 158 mg, 426 mmol) en porciones a la solución durante 4 horas para eliminar el exceso de Gd (III) mientras se mantiene el pH a 7,0 con solución de hidróxido de sodio acuoso (0,05 M). Se agita la mezcla a temperatura ambiente durante 24 hr.
      5. Se realiza una cromatografía de exclusión por tamaño para eliminar la mayoría de GdEDTA y el exceso de EDTA. Utilizar un medio de filtración en gel hidrófilo hinchado en agua para empacar la columna. Reducir la mezcla a un volumen adecuado y la carga de la columna. Eluir la columna con agua desionizada sin aplicar presión.
      6. Centrifugar la muestra usando una unidad de filtro centrífugo 3 kDa durante 30 min a 1.800 xg fuerza centrífuga para eliminar los residuos de GdEDTA y EDTA. Repita este paso (alrededor de cinco veces) hasta que el filtrado muestra la ausencia de EDTA y GdEDTA. Transferir la muestra a un matraz, se evapora, y luego liofilizar el disolvente para obtener un producto de color blanco como la final DCA (186 mg, 71%).
         Nota: Control de ausencia de EDTA y GdEDTA mediante ESI-MS.
      7. Confirmar la ausencia de Gd (III) como ion libre mediante la prueba de anaranjado de xilenol. Se disuelve el filtrado (0,5 ml) en una solución tampón de acetato (pH 5,8). Añadir unas gotas de una solución de naranja de xilenol y realizar un seguimiento del cambio de color (color amarillo o violeta indica la ausencia o presencia de libre Gd (III) los iones en solución, respectivamente) ^11.

2. En Vitro Caracterización de los productos dendrimérica

1. Estimación del número de unidades de DOTA-macrocíclicos acoplados al dendrímero PAMAM (carga del dendrímero con macrociclos DOTA-like)
   1. Estimación con ¹ H NMR (NMR - espectroscopía de resonancia magnética nuclear).
      NOTA: Este procedimiento es posible en dendrímeros 5 y 6, pero no en DCA.
      1. Registre el espectro de ^{RMN de} 1H ^12.
      2. Integrar la región aromática y las dos regiones separadas alifáticos (1. Las señales del dendrímero alifáticos y protones macrocíclicas, 2. las señales de los grupos t-Bu) o sólo una región alifático para dendrímeros 5 y 6, respectivamente.
         Nota: No hay señal separada en la región alifática se originó a partir de los grupos t-Bu en dendrímero 6 ya que se han hidrolizado.
      3. Utilice la ecuación. 1 o la Ec. 2 para estimar el número de unidades macrocíclicas (n), donde R = la relación de las integrales (alifáticos / aromáticos en la Ec. 1 o alifático-dendrímero / alifáticos t- Bu en la Ec. 2), H = _DEND el número de protones en dendrímero, H _Ar = número de protones aromáticos, H _{t Bu} = número de protones en grupos t-Bu, y H _mac = número de protones en un macrociclo.
         Nota: O Eq. 1 o la Ec. 2 se puede utilizar for dendrímero 5, mientras que sólo la ecuación. 1 puede ser utilizado para dendrímero 6. Desde protones intercambiables (en aminas, amidas, tioureas, o carboxilatos) son típicamente siendo sustituidos con deuterio, que no se asumieron en los cálculos. Aquí, H _DEND se utilizaron = 1,128 (para 5) o 1000 (para 6), H _Ar = 4, y H = 27 _mac.
         (1)
         (2)
   2. Estimación del análisis elemental mediante el uso de la relación de nitrógeno a azufre.
      1. Realizar el análisis elemental de la muestra sólida dendrímero (DCA en este trabajo).
      2. Utilice la ecuación. 3 Para estimar el número de unidades macrocíclicas (n), donde R = la relación de determinados% N% y S, N o S _{DEND DEND} = el número denitrógeno o átomos de azufre en el dendrímero, y N _mac o S _mac = el número de átomos de nitrógeno o de azufre en una unidad macrocíclico.
         Nota: El factor 2,29 se obtiene de la relación en masas atómicas de azufre y nitrógeno. En este trabajo, se utilizaron N _DEND = 250, S _DEND = 2, N = 5 _{mac, mac} y S = 1.
         (3)
   3. Estimación con láser de tiempo de desorción / ionización asistida por matriz de vuelo (MALDI-TOF).
      1. Realizar el análisis MALDI-TOF MS ^13.
      2. Calcular el número de unidades macrocíclicos (n) de acuerdo con la Ec. 4, en la que M _z = la masa observada (m / z), z = la carga de la especie, M = _DEND la masa de la parte dendrímero, y M _mac = la masa de una unidad macrocíclico.
         NOTE: M _DEND = 14.306 y M _mac = 719 se utilizaron en este trabajo.
         (4)
2. Determinación de la concentración de DCA ([DCA]): Bulk medición de susceptibilidad magnética (BMS)
   1. Disolver DCA (5-10 mg) en agua (360 l) en un tubo de vial de plástico ([DCA] ~ 5-10 mM).
      NOTA: [DCA] debe estar en el intervalo de 5-10 mM para evitar un posible solapamiento de resonancias BuOH t- en concentraciones de muestra> 15 mm, con la resonancia de agua a δ = 4,7 ppm.
   2. Añadir 60 l de D ₂ O: t- mezcla BuOH (2: 1 v / v) a la solución acuosa de DCA y mezclar la solución resultante (420 l) usando un mezclador Vortex.
   3. Transferencia de 400 l de la muestra en un tubo de RMN exterior y colocar un tubo de RMN de inserción coaxial con un BuOH t-: H ₂ O mezcla (10:90 v / v) en el tubo de muestra.
   4. Grabarel espectro de RMN ¹ H y medir el desplazamiento de frecuencia entre las señales de resonancia que se derivan de t- BuOH en los tubos de RMN interior y exterior (referencia) ^12.
   5. Utilice la ecuación. 5 para determinar el [DCA], donde T es la temperatura absoluta, Δχ = el cambio registrado, mu _eff = el momento efectivo magnética para un ion lantánido (μ _eff = 7,94 para el Gd (III) ^14, y s = una constante dependiente de la forma de la muestra y su posición en el campo magnético (0, 1/3, y 1/6 en el caso de una esfera, cilindro paralelo a, y el cilindro perpendicular al campo magnético, respectivamente).
      NOTA: El valor calculado obtenido por la [DCA] debe corregirse para la concentración original debido a la adición de la _D2O: t- solución BuOH (60 l).
      (5)
3. La luz dinámicadispersión de las mediciones (DLS).
   1. Preparar una solución de DCA se filtró (filtro / PTFE 0,2 micras politetrafluoretileno, 0,75 mM por Gd (III)) en (2-hidroxietil) -1-piperazinetanosulfónico (HEPES) tampón de 4- (25 mM, pH 7,4) y la transfiere en una cubeta para la medición DLS.
   2. Colocar la cubeta en el aparato de DLS y establecer los siguientes parámetros: 5 repeticiones de 15 exploraciones (1 ciclo = 12 seg, índice de refracción = 1,345, absorción = 1%) sin retrasos en entre las exploraciones y con equilibrio de la temperatura 30 segundos antes de la grabación .
   3. Exportación de los datos adquiridos y obtener el histograma de distribución de tamaño por el trazado de la población (%) como una función del tamaño (diámetro hidrodinámico).
4. Medición de las capacidades de relajación longitudinal y transversal.
   NOTA: Un procedimiento similar ya fue descrito utilizando el analizador de tiempo de relajación ^15; este procedimiento se realizó usando un espectrómetro de RMN de 300 MHz con Topspinsoftware.
   1. Preparar un conjunto de soluciones de DCA en _{H2O: D2O} (500 l, 10% de D ₂ O en H ₂ O, [DCA] = 2,0, 2,5, 3,0, 3,5, 4,0, 4,5 y 5,0 mM, [HEPES ] = 25 mM) de la muestra Stock DCA (ver sección 2.2).
   2. Transferir 450 l de solución en un tubo de RMN y colocarlo en el instrumento.
   3. Optimizar los parámetros de adquisición (duración 90 ° impulso de excitación (P1), y la irradiación desplazamiento de frecuencia (O ₁₎₎ y luego realizar la T ₁ y T ₂ experimentos usando la recuperación de la inversión (RI) y Car-Purcell-Meiboom-Gill (CPMG ) secuencias de pulsos, respectivamente.
   4. Determinación de los tiempos T ₁ y T ₂ de relajación.
      1. Seleccione la medición registrada, el proceso del espectro 2D en la dimensión F2, y llevar a cabo la corrección de fase interactiva.
      2. Seleccione la división apropiada (pico con la máxima intensidad) en el Análisis / T _{1 / T 2 ventana de relajación, integrarlo, y exportar la región al módulo de relajación.}
      3. Seleccione la función apropiada de ajuste (invrec o uxnmrt2 para experimentos de IR y CPMG, respectivamente) para obtener los tiempos de relajación _T1 o _T2.
   5. Repita los pasos 2.4.4.2-2.4.4.4 para todos los restantes [DCA] soluciones.
   6. Calcula las velocidades de relajación _(R1 y _R2) a partir de los valores obtenidos T ₁ (R _1,2 = 1 / T _1,2).
   7. Parcela R ₁ y R ₂ (seg ^-1) como una función de la concentración de Gd (III) en mM.
   8. Determinar las capacidades de relajación longitudinal y transversal, _R1 y _R2 ^(s-1 mM ^-1), a partir de la pendiente de la recta de ajuste, tal como se define por la ecuación. 6, donde R _{i, obs} = la longitudinal (i = 1) o transversal (i = 2) velocidad de relajación de diamagnéticoagua en ausencia de especies paramagnéticas y [Gd] = la concentración de Gd (III) usado en el experimento.
      (6)

3. En Vitro MRI; Comparación entre el DCA y GdDOTA

1. Preparación de fantasmas de tubo
   1. Preparar soluciones acuosas de DCA (4 x 350 l) y GdDOTA (4 x 350 l), así como muestras de agua (4 x 350 l) para dos conjuntos de experimentos en los que se calcula la concentración de los agentes de contraste: (3.1.1.1) por Gd (III) o (3.1.1.2) por molécula.
      1. Se preparan dos muestras de DCA y dos GdDOTA muestras con concentraciones de 0,5 y 1,0 mm por Gd (III), respectivamente. Además, preparar dos muestras de agua (como tubos de control).
      2. Preparar dos muestras DCA (2,5 y 5,0 mM por Gd (III) o 0,05 y 0,1 mM por molécula dendrimérica), dos muestras GdDOTA (0,25, 0,5 mM) y dos muestras de agua (controtubos L).
         NOTA: Las concentraciones apropiadas DCA y GdDOTA deben ser preparados mediante la dilución de las muestras respectivas acciones con concentraciones determinadas por el método de BMS (ver sección 2.2) con tampón HEPES (pH 7,4). Con el fin de simplificar los cálculos, n = 50 se supuso para el número medio de unidades de macrocíclicos por molécula de dendrímero. Por lo tanto, la relación de DCA: GdDOTA era 1: 5, calculado sobre una base por molécula.
   2. Colocar las muestras en 300 tubos vial de plástico mu l, evitando la presencia de burbujas de aire en la solución.
      NOTA: El tamaño de los tubos vial de plástico depende del tipo y el tamaño de la bobina de radiofrecuencia utilizado (aquí, se da un ejemplo con la bobina de volumen).
   3. Inserte las muestras dentro de una jeringa (60 ml de volumen), llenarlo con GdDOTA 1 mM solución, y lo coloca en el escáner.
      Nota: Las muestras se colocaron en la solución acuosa de GdDOTA para evitar los efectos de susceptibilidad (variaciones en el campo magnético strength que se producen cerca de interfaces entre las sustancias de diferente susceptibilidad magnética).
2. Optimización de parámetros y de imagen.
   1. Utilice la exploración anatómica (Localizador / TriPilot) a la posición de la jeringa con las muestras en el isocentro del imán.
   2. Pulse el semáforo (exploración de ajuste) para realizar ajustes de cuñas (ajuste de la homogeneidad del campo magnético) de todo el volumen, la frecuencia central (O _1), la ganancia del receptor (RG), y la ganancia de transmisión (TX0 y TX1).
   3. Para _T1-ponderada (T _1w) de imágenes, seleccione el método rápido de bajo ángulo de disparo (FLASH).
   4. Elija corte coronal de las muestras colocadas en vertical (horizontal) de la jeringa en el escáner utilizando el escaneo del localizador.
   5. Utilice la ecuación. 7 para la optimización de la adquisición de contraste a ruido (CNR) Parámetro ^16, donde α = el ángulo de inclinación, TE = el tiempo de eco, TR =el tiempo de repetición, y T _{1, A,} T _{1, B} = T ₁ veces de la muestra A (T _{1, A)} y la muestra B (T _{1, B)} para los que el CNR debe maximizarse (lo mismo es válido para T ₂ veces: T _{2, A} y T _{2, B).}
      NOTA: T ₁ y T ₂ tiempos de relajación se debe establecer en valores obtenidos de las mediciones de capacidades de relajación longitudinal y transversal (sección 2.4), mientras que TE, TR, y α debe ser obtenida del cálculo de optimización CNR.
      (7)
   6. Adquirir la imagen utilizando los parámetros obtenidos en el paso anterior (3.2.5).
   7. Se calcula la relación de señal a ruido (SNR).
      1. Cargar la imagen T _1w adquirida (escanear) en la pantalla y procesamiento de imágenesventana, y haga clic en Definir región de interés (ROI).
      2. Elija un ROI circular y dibujarlo en la posición de la muestra y el fondo. Posteriormente, haga clic en la pantalla para obtener la amplitud media de la señal (S _señal) y la desviación estándar de la de fondo _(ruido S).
      3. Repita el paso 3.2.7.2 para la DCA, GdDOTA, y las muestras de agua.
      4. Calcular la SNR mediante la fórmula: SNR = _señal S / S _ruido.
   8. Siguiendo un procedimiento ligeramente modificado, realice _2-ponderada de imágenes T (T _2w) utilizando el método de mejora rápida adquisición de relajación (RARE) con. Para la optimización de los parámetros de adquisición de CNR, utilizar la ecuación. 8.
      (8)

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Resultados

La preparación de DCA consistía en dos etapas: 1) la síntesis del quelante monomérica de tipo DOTA (Figura 1) y 2) de acoplamiento del quelante con el dendrímero G4 PAMAM y la posterior preparación del Gd dendrimérica (III) (Figura 2) . En la primera etapa, se preparó una de tipo DOTA quelante basado en cyclen que contiene cuatro ácidos carboxílicos y un grupo ortogonal adecuado para otras modificaciones sintéticas. La prepara...

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Discusión

Preparación del agente de contraste de MRI dendrimérica requiere la selección apropiada de la unidad monomérica (es decir, el quelante de Gd (III)). Reducen la toxicidad de este ion paramagnético y, hasta la fecha, una gran variedad de acíclicos y quelantes macrocíclicos sirven para este propósito ^1-3. Entre estos, macrocíclicos quelantes de tipo DOTA poseen la más alta estabilidad termodinámica e inercia cinética y, por lo tanto, son la opción más preferido para la preparación de agen...

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Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cyclen	CheMatech	C002
tert-Butyl bromoacetate	Alfa Aesar	A14917
N,N-Dimethylformamide	Fluka	40248
Potassium carbonate	Sigma-Aldrich	209619
4-(4-Nitrophenyl)butryic acid	Aldrich	335339
Thionyl chloride	Acros Organics	382662500	Note: Corrosive substance; toxic if inhaled
Bromine	Acros Organics	402841000	Note: causes severe skin burns, fatal if inhaled
Diethyl ether	any source
Sodium sulphate	Acros Organics	196640010
Chloroform	VWR Chemicals	22711.29
tert-Butyl 2,2,2-trichloroacetimidate	Aldrich	364789	Note: flammable substance; irritrant to skin and eyes
Boron trifluoride etherate	Acros Organics	174560250	48% BF3. Note: Flammable substance; causes skin burns, fatal if inhaled
Sodium bicarbonate	Acros Organics	424270010
Ethyl-acetate	any source		For column chromatography
n-Hexane	any source		For column chromatography
Bulb-to-bulb (Kugelrohr) distillation apparatus	Büchi		Model type: Glass oven B-585
Silicagel	Carl Roth GmbH	P090.2
Methanol	any source		For column chromatography
Dichloromethane	any source		For column chromatography
Ethanol	VWR Chemicals	20821.296
Ammonia	Acros Organics	428381000	7 N Solution in Methanol
Palladium	Aldrich	643181	15% wet
Hydrogenation apparatus PARR	PARR Instrument Company
Celite 503	Aldrich	22151
Sintered glass funnel	any source
Thiophosgen	Aldrich	115150	Note: irritrant to skin; toxic if inhaled
Triethylamine	Alfa Aesar	A12646
Dichloromethane	Acros Organics	348460010	Extra dry
Magnetic stirrer	any source
PAMAM G4 Dendrimer	Andrews ChemService	AuCS - 297	10% wt. solution in MeOH
Lipophylic Sephadex LH-20	Sigma	LH20100
Thin-layer chromatography plates	Merck Millipore	1.05554.0001
Formic acid	VWR Chemicals	20318.297
Lophylizer	any source
Gadollinium(III) chloride hexahydrate	Aldrich	G7532
Sodium hydroxide	Acros Organics	134070010
pH meter	any source
Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate	Aldrich	E5134
Mass spectrometer (ESI)	Agilent		Ion trap SL 1100
Acetate buffer	any source		pH 5.8
Xylenol orange	Aldrich	52097	20 μM in acetate buffer
Hydrophylic Sephadex G-15	GE Healthcare	17-0020-01
Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Unit	Merck Millipore	UFC900324	Ultracel-3 membrane (MWCO 3000)
Centrifuge	any source
NMR spectrometer	Bruker		Avance III 300 MHz
Topspin	Bruker		Version 2.1
Combustion analysis instrument	EuroVector SpA		EuroEA 3000 Elemental Analyser
MALDI-ToF MS instrument	Applied Biosystems		Voyager-STR
Deuteriumoxid	Carl Roth GmbH	6672.3
tert-Butyl alcohol	Carl Roth GmbH	AE16.1
Vortex mixer	any source
Norell NMR tubes	Deutero GmbH	507-HP-7
NMR coaxial tube	Deutero GmbH	coaxialb-5-7
DLS instrument	Malvern		Zetasizer Nano ZS
0.20 μm PTFE filter	Carl Roth GmbH	KC94.1
HEPES	Fisher BioReagents	BP310
Plastic tube vials	any source
Dotarem	Guerbet		NDC 67684-2000-1
MRI scanner	Bruker		BioSpec 70/30 USR magnet (7 T). Note: potential hazards related to high magnetic fields
RF coil	Bruker		Dual frequency volume coil (RF RES 300 1H/19F 075/040 LIN/LIN TR)
Paravision (software)	Bruker		Version 5.1