Préparation et<em&gt; In vitro</em&gt; Caractérisation des agents de contraste à base de dendrimères pour imagerie par résonance magnétique

Résumé

Ce protocole décrit la préparation et la caractérisation d'une imagerie par résonance magnétique (IRM), l'agent de contraste dendrimère qui porte des chelates macrocycliques à base Cyclen coordinants des ions paramagnétiques de gadolinium. Dans une série d'expériences d' IRM in vitro, cet agent a produit un signal d' IRM amplifié par rapport à l'analogue monomère disponible dans le commerce.

Résumé

complexes paramagnétiques de gadolinium (III) avec acyclique ou chélates macrocycliques sont des agents de contraste les plus couramment utilisés (CA) pour l'imagerie par résonance magnétique (IRM). Leur but est d'améliorer la vitesse de protons de l'eau dans les tissus de relaxation, augmentant ainsi le contraste de l'image MR et la spécificité des mesures d'IRM. Les agents de contraste actuels cliniquement approuvés sont des molécules de faible poids moléculaire qui sont rapidement éliminées de l'organisme. L'utilisation de dendrimères en tant que porteurs de chélateurs paramagnétiques peut jouer un rôle important dans le développement futur des plus efficaces agents de contraste IRM. Plus précisément, l'augmentation de la concentration locale des résultats des espèces paramagnétiques dans un contraste de signal plus élevé. En outre, cette AC fournit un plus long temps de rétention du tissu en raison de sa masse moléculaire élevée et leur taille. Ici, nous démontrons une procédure commode pour la préparation d'agents d'IRM macromoléculaires de contraste à base de poly (amidoamine) (PAMAM), les dendrimères monomacrocycliques chélateurs de type DOTA (DOTA - 1,4,7,10-tétraazacyclododécane-1,4,7,10-tétra-acétate). L'unité de chélation a été ajoutée en exploitant la réactivité du groupe isothiocyanate (NCS) vers les groupes de dendrimère PAMAM de surface de type amine pour former des ponts de thiourée. dendrimères produits ont été purifiés et analysés par spectroscopie de résonance magnétique nucléaire, spectrométrie de masse et analyse élémentaire. Enfin, la haute résolution des images RM ont été enregistrées et les contrastes des signaux obtenus à partir du dendrimère préparé et les agents monomères disponibles dans le commerce ont été comparés.

Introduction

L'imagerie par résonance magnétique (IRM) est une technique d'imagerie puissante et non-ionisant largement utilisé dans la recherche biomédicale et le diagnostic clinique en raison de sa nature non invasive et un excellent contraste des tissus mous intrinsèque. Les méthodes d'IRM les plus couramment utilisés utilisent le signal obtenu à partir de protons de l'eau, fournissant des images à haute résolution et des informations détaillées dans les tissus en fonction des différences dans la densité des signaux d'eau. L'intensité du signal et la spécificité des expériences d'IRM peut être encore améliorée en utilisant des agents de contraste (CA). Ce sont des espèces paramagnétiques ou superparamagnétiques qui affectent le sens longitudinal (T ₁₎ et transversale (T ₂₎ des temps de relaxation, respectivement de ^1,2.

Les complexes de gadolinium ion lanthanide avec polyamino ligands acides polycarboxyliques sont ₁ OPN les plus couramment utilisés T. Gadolinium (III) réduit la relaxation T ₁temps de protons de l' eau, augmentant ainsi le contraste du signal lors d' expériences d' IRM ^3. Cependant, le gadolinium ionique est toxique; sa taille se rapproche de celle du calcium (II), et elle affecte sérieusement la signalisation dans les cellules assistées de calcium. Par conséquent, acycliques et macrocycliques chélates sont utilisés pour neutraliser cette toxicité. Divers ligands polydentés ont été développés jusqu'à présent, ce qui entraîne gadolinium (III) ayant une stabilité thermodynamique élevée et l' inertie cinétique ^1. Ceux qui sont fondés sur les cyclen azamacrocycle 12 chaînons, en particulier son tétracarboxylique DOTA dérivé (1,4,7,10-tétraazacyclododécane-1,4,7,10-tétraacétate) sont complexes les plus étudiés et appliqués de cette classe de CA.

Néanmoins, GdDOTA de type CA sont des systèmes de faible poids moléculaire, présentant certains inconvénients, tels que la faible efficacité du contraste et de l'excrétion rénale rapide. Macromoléculaires et multivalent CA peuvent être une bonne solution à ces problèmes ^4. Depuis CA biodistribution est principalement déterminée par leur taille, les CA macromoléculaires affichent beaucoup plus longs temps de rétention dans les tissus. Tout aussi important, la polyvalence de ces résultats , des agents à une concentration locale accrue de la sonde monomère MR (par exemple, un complexe GdDOTA), ce qui améliore sensiblement le signal RM acquises et la qualité de la mesure.

Les dendrimères sont parmi les échafauds les plus préférés pour la préparation des multivalent CA pour l' IRM ^4,5. Ces macromolécules hautement ramifiées ayant des dimensions bien définies sont sujettes à diverses réactions de couplage sur leur surface. Dans ce travail, nous rapportons la préparation, la purification et la caractérisation d'un CA dendrimères pour l'IRM consistant en une génération 4 (G4) poly (amidoamine) (PAMAM) dendrimère couplé à chélates GdDOTA-like (DCA). On décrit la synthèse du dérivé réactif du DOTA et son couplage avec le dendrimère PAMAM. Sur complexation avec Gd (III), la caractérisation physico-chimique norme procedure de DCA a été réalisée. Enfin, des expériences d'IRM ont été réalisées pour démontrer la capacité de DCA pour produire des images IRM avec un contraste plus fort que ceux obtenus à partir de bas poids moléculaire AR.

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Protocole

1. Préparation de DCA

1. Synthèse de l'unité monomère 4 ^6.
   1. Synthèse du 4- (4-nitrophényl) -2- (tert - 4,7,10-tris- -butoxycarbonylmethyl-1,4,7,10-tetraazacyclododec-1-yl) ester de l' acide butyrique tert - butyle (2).
      1. Dissoudre le (tert 4,7-bis -butoxycarbonylmethyl-1,4,7,10-tétraazacyclododécane-cyclododec-1-yl) -acétique tert - butyl ester 1 (1,00 g, 1,94 mmol) dans du N, N - diméthylformamide ( DMF, 5 ml), on ajoute du carbonate de potassium (0,67 g, 4,86 ​​mmol, 2,5 équiv.) et on agite le mélange à température ambiante pendant 45 min.
         REMARQUE: macrocycle 1 a été préparé à partir Cyclen et de tert - butyle bromoacétate selon le mode opératoire déjà publié ^7.
      2. Ajouter le tert - butyl-2-bromo-4- (4-nitrophényl) butanoate de méthyle (0,87 g, 2,53 mmol, 1,3 équiv.) Par portions sur 1 heure. Continuer de remuer le mélange sous til mêmes conditions de réaction pour le 18 heures suivant.
         Remarque: -butyl-2-bromo-4 - tert - (4-nitrophényl) butanoate de méthyle a été préparé à partir de 4- (4-nitrophényl) butyrique, le chlorure de thionyle, et le brome selon le procédé précédemment publié ^8.
      3. Éliminer le DMF par distillation sous vide d' ampoule à ampoule à 40-60 ° C ^9.
      4. On purifie le résidu par Chromatographie sur colonne (gel de silice, 7% de méthanol / dichlorométhane) pour obtenir le produit 2 sous forme de solide amorphe brun (1,09 g, 72%) ^10.
   2. Synthèse du 4- (4-amino-phényl) -2- (tert - 4,7,10-tris- -butoxycarbonylmethyl-1,4,7,10-tetraazacyclododec-1-yl) ester de l' acide butyrique tert - butyle (3).
      1. Dissoudre le dérivé de 2 nitrobenzène (1,00 g, 1,28 mmol) dans de l' éthanol (10 ml) et 7 une solution d'ammoniac dans du methanol (150 ul). Ajouter du palladium sur charbon activé comme catalyseur (Pd / C, 150 mg, 15% en poids) à la solutisur.
      2. Agiter le mélange hétérogène pendant 16 heures sous une atmosphère d'hydrogène (2,5 bar) dans l'appareil d'hydrogénation de Parr.
      3. Préparer un gâteau de diatomite en suspension dans de l'éthanol et filtration de la suspension à travers un entonnoir en verre fritte. Verser la suspension de 1.1.2.2 sur le gâteau préparé pour éliminer le catalyseur Pd / C par filtration.
      4. Éliminer le solvant par distillation douce sur un évaporateur rotatif (température du bain d' eau à 40 ° C) pour obtenir un composé 3 sous forme de solide amorphe brun (0,91 g, 95%).
   3. Synthèse du 4- (4-isothiocyanatophényl) -2- (4,7,10-tris-tert -butoxycarbonylmethyl 1,4,7,10- tetraazacyclododec-1-yl) butyrique tert-butyle ester (4).
      1. Ajouter du thiophosgène (0,124 ml, 1,58 mmol, 1,3 équiv.) À un mélange de 3 (0,91 g, 1,22 mmol) et de triéthylamine (0,685 ml, 4,87 mmol, 4 équiv.) Dans du dichlorométhane (15 ml).
      2. Agiter vigoureusement les mi de réactionxture avec un agitateur magnétique à température ambiante pendant 16 heures.
      3. Éliminer le solvant par distillation douce sur un évaporateur rotatif (température de l' eau du bain ~ 40 ° C), puis purifier le produit brut par Chromatographie sur colonne (gel de silice, 5% de méthanol / dichlorométhane) pour obtenir le produit 4 en tant que solide brun clair amorphe (0,51 g, 53%).
2. Synthèse de la DCA dendrimère.
   1. Synthèse du dendrimère 5.
      1. Prendre G4-dendrimère PAMAM (667 mg, solution de dendrimère 10% dans du methanol, 4,67 pmol), on évapore le méthanol par distillation douce sur un évaporateur rotatif (température du bain d'eau à 40 ° C) et on dissout le résidu dans du DMF (4 ml) .
      2. Ajouter de la triéthylamine (0,105 ml, 0,75 mmol, 160 éq.), Agiter pendant 45 min à 60 ° C et ajouter de l' isothiocyanate de 4 (354 mg, 0,45 mmol, 1,5 équiv. Par rapport aux groupes du dendrimère de surface aminé) par portions over 1 h.
      3. On agite le mélange réactionnel avec un agitateur magnétique à 45 ° C pendant 48 heures.
      4. Éliminer le solvant par distillation sous vide d'ampoule à ampoule à 40-60 ° C.
      5. On purifie le résidu par chromatographie d'exclusion stérique en utilisant un milieu de filtration sur gel lipophile et de methanol comme éluant. Pour emballer la colonne, gonfler les médias de filtration dans le méthanol pendant au moins 3 heures à température ambiante (> 4 ml de méthanol par 1 g de poudre) sans appliquer de pression. Effectuer la séparation par gravité en recueillant fractions de 1 ml.
      6. Analyser les fractions recueillies avec chromatographie sur couche mince (CCM). Développer la plaque CCM dans 15% de méthanol / dichlorométhane (seulement l'endroit le plus polaire situé sur la ligne de base est dérivé du produit dendrimères). Evaporer les fractions recueillies par distillation douce sur un évaporateur rotatif (température du bain d'eau à 40 ° C) pour obtenir un produit 5 (270 mg, 91%).
   2. Synthèse du dendrimère 6.
      1. Dissoudre le chélateur protégé dendrimère 5 (270 mg, 4,23 pmol) dans de l' acide formique (5 ml) et agiter le mélange à 60 ° C pendant 24 heures.
      2. Evaporer l'acide formique par distillation sur un évaporateur rotatif (~ pression de 15 mbar, température du bain d'eau à 40 ° C) et à lyophiliser le produit pour donner 6 (pression ~ 0,2 mbar) ^9.
   3. Synthèse de l'agent de contraste dendrimère (DCA)
      1. Dissoudre le chélateur dendrimère 6 (4,35 pmol) dans l' eau et ajuster le pH à 7,0 avec de l' hydroxyde de sodium 0,1 M.
      2. Dissoudre GdCl ₃ .6H ₂ O (113 mg, 304 pmol) dans l' eau (1 ml) et ajouter goutte à goutte à la solution de chélateur 6 sur une période de 4 h; maintenir le pH à 7,0 avec une solution d'hydroxyde de sodium aqueux (0,05 M) en mesurant le pH avec un pH-mètre.
      3. Incorporer le mélange avec un agitateur magnétique à la chambre tEMPÉRATURE pendant 24 heures.
      4. Ajouter de l'acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA, 158 mg, 426 pmol) à la solution par portions pendant 4 heures pour éliminer l'excès de Gd (III), tout en maintenant le pH à 7,0 avec une solution d'hydroxyde de sodium aqueux (0,05 M). On agite le mélange à la température ambiante pendant 24 heures.
      5. Effectuer chromatographie d'exclusion pour éliminer la majorité des GdEDTA et l'excès d'EDTA. Utiliser un milieu de filtration sur gel hydrophile gonflé dans l'eau pour emballer la colonne. Réduire le mélange à un volume approprié et de charger la colonne. Eluer la colonne avec de l'eau déminéralisée sans appliquer de pression.
      6. Centrifuger l'échantillon en utilisant une unité de filtre centrifuge 3 kDa pendant 30 min à la force centrifuge de 1800 x g pour éliminer les résidus de GdEDTA et de l'EDTA. Répéter cette étape (environ cinq fois) jusqu'à ce que le filtrat indique l'absence d'EDTA et GdEDTA. Transférer l'échantillon dans un flacon, évaporer, puis lyophiliser le solvant pour obtenir un produit blanc cassé que la finale DCA (186 mg, 71%).
         REMARQUE: Vérifiez l'absence d'EDTA et GdEDTA au moyen d'ESI-MS.
      7. Confirmez l'absence de Gd (III) comme ion libre en utilisant le test xylénol orange. On dissout le filtrat (0,5 ml) dans une solution tampon à l'acétate (pH 5,8). Ajouter quelques gouttes d'une solution xylénol orange et de suivre le changement de couleur (couleur jaune ou violette indique l'absence ou la présence de Gd (III) des ions en solution, respectivement) ^11.

2. Caractérisation in vitro des produits dendrimères

1. Estimation du nombre de macrocycliques DOTA-unités couplées au dendrimère PAMAM (chargement du dendrimère avec des macrocycles DOTA-like)
   1. Estimation de RMN ¹ H (RMN - spectroscopie par résonance magnétique nucléaire).
      NOTE: Cette procédure est disponible sur dendrimères 5 et 6, mais pas sur DCA.
      1. Relever le spectre RMN ¹ H ^12.
      2. Intégrer la région aromatique et les deux régions distinctes aliphatiques (1. signaux des dendrimères et des protons aliphatiques macrocycliques, 2. les signaux des groupes t - Bu) , ou tout simplement une région aliphatique pour dendrimères 5 et 6, respectivement.
         Note: Il n'y a pas de signal distinct dans la région aliphatique provenaient des groupes t - Bu dans dendrimère 6 car ils ont été hydrolysée.
      3. Utilisez Eq. Ou 1 éq. 2 pour estimer le nombre d'unités macrocycliques (n), où R = le rapport des intégrales (aliphatique / aromatique dans Eq. 1 ou aliphatiques-dendrimère / Bu aliphatiques T- dans l' équation. 2), H _dende = le nombre de protons en dendrimère, H _Ar = le nombre de protons aromatiques, H _{t Bu} = le nombre de protons dans les groupes t - Bu, et H _mac = le nombre de protons dans un macrocycle.
         Remarque: Soit l'équation. Ou 1 éq. 2 peut être utilisé for dendrimère 5, alors que seulement Eq. 1 peut être utilisé pour dendrimère 6. Etant donné que les protons échangeables (sur des amines, des amides, des thiourées ou des carboxylates) sont généralement remplacés par le deutérium, ils ne sont pas supposés dans les calculs. Ici, H _dende = 1,128 (pour 5) ou 1000 (pour 6), H _Ar = 4, et H _mac = 27 ont été utilisés.
         (1)
         (2)
   2. L'estimation de l'analyse élémentaire en utilisant le rapport de l'azote au soufre.
      1. Effectuer l'analyse élémentaire sur l'échantillon dendrimère solide (DCA dans ce travail).
      2. Utilisez Eq. 3 pour estimer le nombre d'unités macrocycliques (n), où R = le rapport de déterminé% N et% S, N ou S _{divi- dende} = le nombre deatomes d' azote ou de soufre dans le dendrimère, et N ou S _{mac mac} = le nombre d'atomes d' azote ou de soufre dans une unité macrocyclique.
         Remarque: Le facteur 2,29 est obtenu à partir du rapport des masses atomiques du soufre et de l'azote. Dans ce travail, N _dende = 250, S _dende = 2, N _mac = 5, et S _mac = 1 ont été utilisés.
         (3)
   3. Estimation avec le laser le temps de désorption / ionisation assistée par matrice de vol (MALDI-TOF).
      1. Effectuer l'analyse MALDI-TOF MS ^13.
      2. Calculer le nombre d'unités macrocycliques (n) selon l'équation. 4, où M _z = la masse observée (m / z), z = la charge de l'espèce, M _dende = la masse de la partie dendrimère, et M _mac = la masse d'une unité macrocyclique.
         NONTE: M _dende = 14306 et M _mac = 719 ont été utilisés dans ce travail.
         (4)
2. Détermination de la concentration DCA ([DCA]): mesure de la susceptibilité magnétique en vrac (BMS)
   1. Dissoudre DCA (5-10 mg) dans de l'eau (360 ul) dans un tube flacon en matière plastique ([DCA] ~ 5-10 mM).
      NOTE: [DCA] devrait être de l'ordre de 5-10 mM pour éviter le chevauchement éventuel des résonances de BuOH T- à des concentrations de l' échantillon> 15 mM, avec la résonance de l' eau à δ = 4,7 ppm.
   2. Ajouter 60 ul de D ₂ O: T- mélange BuOH (2: 1 v / v) à la solution aqueuse de DCA et mélanger la solution obtenue (420 pi) à l' aide d' un mélangeur Vortex.
   3. Transférer 400 pl de l'échantillon dans un tube RMN extérieur et placer un tube d'insertion de RMN coaxial avec un BuOH T-: mélange de H ₂ O (10:90 v / v) dans le tube d'échantillon.
   4. Recordet le spectre de RMN ¹ H mesurer le décalage de fréquence entre les signaux de résonance résultant de T- BuOH dans les tubes de RMN intérieure et extérieure ⁽¹²⁾ de référence.
   5. Utilisez Eq. 5 pour déterminer la [DCA], où T = température absolue, Δχ = le changement enregistré, u _eff = le moment efficace magnétique pour un ion lanthanide (μ _eff = 7,94 pour Gd (III) ^14, et s = une constante dépendant de la forme de l'échantillon et sa position dans le champ magnétique (0, 1/3, et 1/6 dans le cas d'une sphère, d'un cylindre parallèle à cylindre et perpendiculaire au champ magnétique, respectivement).
      REMARQUE: La valeur calculée obtenue pour la [DCA] doit être corrigée à la concentration initiale en raison de l'addition du D ₂ O: T- solution BuOH (60 ul).
      (5)
3. Une lumière dynamiquediffusion (DLS) mesures.
   1. Préparer une solution DCA filtrée (filtre / PTFE de 0,2 um polytétrafluoroéthylène, 0,75 mM par Gd (III)) en 4- (2-hydroxyéthyl) -1-piperazineethanesulfonic (HEPES) tampon (25 mM, pH 7,4) et le transférer dans un cuve pour la mesure de DLS.
   2. Placez la cuvette dans l'appareil de DLS et définir les paramètres suivants: 5 répétitions de 15 balayages (1 scan = 12 sec, l'indice de réfraction = 1,345, absorption = 1%) sans retards dans entre les balayages et équilibration de la température 30 sec avant l'enregistrement .
   3. Exporter les données acquises et à obtenir l'histogramme de distribution de taille en reportant la population (%) en fonction de la taille (diamètre hydrodynamique).
4. La mesure des relaxivité longitudinale et transversale.
   NOTE: Une procédure similaire a déjà été décrit en utilisant la relaxation analyseur de temps de ^15; cette procédure a été effectuée en utilisant un spectromètre de RMN à 300 MHz avec Topspinlogiciel.
   1. Préparer une série de solutions DCA en H ₂ O: D ₂ O (500 pi, 10% D ₂ O en H ₂ O, [DCA] = 2.0, 2.5, 3.0, 3.5, 4.0, 4.5 et 5.0 mM, [HEPES ] = 25 mM) à partir de l'échantillon DCA de stock (voir section 2.2).
   2. Transférer 450 pi d'une solution dans un tube de RMN et le placer dans l'instrument.
   3. Optimiser les paramètres d'acquisition (durée 90 ° impulsion d'excitation (p1), et l' irradiation de décalage de fréquence (O _1)), puis effectuer le T ₁ et T ₂ expériences en utilisant la récupération d'inversion (IR) et voiture-Purcell-Meiboom-Gill (CPMG ) des séquences d'impulsions, respectivement.
   4. Détermination des temps T ₁ et T ₂ de relaxation.
      1. Sélectionnez la mesure enregistrée, le processus du spectre 2D dans la dimension de F2, et effectuer la correction de phase interactive.
      2. Sélectionnez la tranche appropriée (pic d'intensité maximale) dans l'analyse / T _{1 / T 2 fenêtre de relaxation, intégrer et exporter la région vers le module de relaxation.}
      3. Sélectionnez la fonction appropriée de montage (invrec ou uxnmrt2 pour des expériences IR et CPMG, respectivement) pour obtenir les temps T ₁ ou T ₂ relaxation.
   5. Répétez les étapes 2.4.4.2-2.4.4.4 pour toutes les solutions restantes [DCA].
   6. Calculer les taux de relaxation (R ₁ et R ₂₎ à partir des valeurs obtenues T ₁ (R _1,2 = 1 / T _1,2).
   7. Parcelle R ₁ et R ₂ (sec ^-1) en fonction de Gd (III) , la concentration en mM.
   8. Déterminer les relaxivité longitudinale et transversale, r ₁ et r ₂ (mM ^{-1 s} s) à partir de la pente de la courbe ajustée telle que définie par l' équation. 6, où R _{i, obs} = longitudinal (i = 1) ou transversal (i = 2) Taux de relaxation diamagnétiquel'eau en l'absence d'espèces paramagnétiques et [Gd] = la concentration de Gd (III) utilisé dans l'expérience.
      (6)

3. IRM in vitro; Comparaison entre DCA et GdDOTA

1. Préparation de fantômes tube
   1. Préparer des solutions aqueuses de DCA (4 x 350 pi) et GdDOTA (4 x 350 pi), ainsi que des échantillons d'eau (4 x 350 pi) pour les deux séries d'expériences dans lesquelles la concentration des agents de contraste est calculé comme suit: (3.1.1.1) par Gd (III) ou (3.1.1.2) par molécule.
      1. Préparer deux échantillons DCA et deux GdDOTA des échantillons avec des concentrations de 0,5 et 1,0 mM par Gd (III), respectivement. En outre, préparer deux échantillons d'eau (sous forme de tubes de contrôle).
      2. Préparer deux échantillons DCA (2,5 et 5,0 mM par Gd (III) ou 0,05 et 0,1 mM par molécule dendrimère), deux échantillons GdDOTA (0,25, 0,5 mM) et deux échantillons d'eau (control tubes).
         NOTE: Les concentrations de DCA et GdDOTA appropriées devraient être préparées en diluant les échantillons d'actions respectifs avec des concentrations déterminées par la méthode BMS (voir section 2.2) avec un tampon HEPES (pH 7,4). Afin de simplifier les calculs, n = 50 a supposé pour le nombre moyen d'unités macrocycliques par molécule de dendrimère. Par conséquent, le rapport de DCA: GdDOTA était de 1: 5, calculé sur une base par molécule.
   2. Placer les échantillons dans 300 ul de tubes en plastique du flacon, ce qui évite la présence de bulles d'air dans la solution.
      REMARQUE: La taille des tubes en matière plastique du flacon dépend du type et de la taille de la bobine de radiofréquence utilisée (ici, par exemple, avec la bobine de volume est donné).
   3. Insérez les échantillons à l'intérieur d'une seringue (60 ml de volume), le remplir avec 1 mM GdDOTA solution, et placez-le dans le scanner.
      NOTE: Les échantillons ont été placés dans la solution aqueuse de GdDOTA pour éviter les effets de la sensibilité (les variations du champ magnétiqueORCE qui se produisent près des interfaces entre les substances de susceptibilité magnétique différente).
2. L' optimisation des paramètres et de l' imagerie.
   1. Utilisez l'analyse anatomique (Localizer / TriPilot) pour positionner la seringue avec les échantillons dans l'isocentre de l'aimant.
   2. Appuyez sur le feu de circulation (balayage de réglage) pour effectuer des ajustements pour calant (réglage de magnétique homogénéité du champ) de l'ensemble du volume, la fréquence centrale (O _1), le gain du récepteur (RG), et le gain d'émission (Tx0 et TX1).
   3. Pour pondération T ₁ (T _1s) imagerie, sélectionnez la méthode rapide contre-plongée (FLASH).
   4. Choisissez tranche coronale pour les échantillons placés verticalement (seringue horizontalement) dans le scanner à l'aide de l'analyse de Localizer.
   5. Utilisez Eq. 7 pour l' optimisation de la (CNR) acquisition de contraste-bruit paramètres ^16, où α = l'angle de basculement, TE = le temps d' écho, TR =le temps de répétition, et T _{1, A,} T _{1, b} = T ₁ fois de l' échantillon A (T _{1, A)} et l' échantillon B (T _{1, B)} pour laquelle le CN doit être maximisée (la même chose est valable pour T ₂ fois: T _{2, A} et T _{2, B).}
      NOTE: T ₁ et T ₂ relaxation fois devraient être fixés aux valeurs obtenues à partir des mesures de relaxivité longitudinales et transversales (section 2.4), tandis que TE, TR, et α doit être obtenue à partir du calcul d'optimisation CNR.
      (7)
   6. L'acquisition de l'image en utilisant les paramètres obtenus à l'étape précédente (3.2.5).
   7. Calculer le rapport signal sur bruit (SNR).
      1. Chargez le T _1s image acquise (scan) dans l'affichage et traitement d' imagesfenêtre, puis cliquez sur Définir région d'intérêt (ROI).
      2. Choisissez un ROI circulaire et dessiner à la position de l'échantillon et le fond. Par la suite, cliquez sur l' écran pour obtenir l'amplitude moyenne du signal _(signal S) et écart - type de l'arrière - plan _(bruit de S).
      3. Répétez l'étape 3.2.7.2 pour la DCA, GdDOTA, et des échantillons d'eau.
      4. Calculer le SNR en utilisant la formule: SNR = _{bruit de signal} S / S.
   8. Après une procédure légèrement modifiée, effectuez T ₂ weighted (T _2w) imagerie utilisant l'acquisition rapide avec la méthode d'amélioration de la relaxation (RARE). Pour l'optimisation des paramètres d'acquisition du CN, utiliser l'équation. 8.
      (8)

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Résultats

La préparation de DCA est composée de deux étapes: 1) la synthèse du chélateur de type DOTA monomère (figure 1) et 2) le couplage du chélateur avec le dendrimère G4 PAMAM et la préparation subséquente du Gd dendrimère (III) (figure 2) . Dans la première étape, un chélateur de type DOTA à base cyclène contenant quatre acides carboxyliques et d'un groupe orthogonal approprié pour d'autres modifications de synthèse...

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Discussion

Préparation de l'agent de contraste IRM dendrimère nécessite une sélection appropriée de l'unité monomère ( par exemple, le chélateur Gd (III)). Ils réduisent la toxicité de cet ion paramagnétique et, à ce jour, une grande variété de chélateurs macrocycliques acyclique et servent à cette fin ^03/01. Parmi ceux - ci, des chélateurs macrocycliques de type DOTA possèdent la stabilité thermodynamique plus élevée et l' inertie cinétique et, par conséquent, sont le choix p...

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matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cyclen	CheMatech	C002
tert-Butyl bromoacetate	Alfa Aesar	A14917
N,N-Dimethylformamide	Fluka	40248
Potassium carbonate	Sigma-Aldrich	209619
4-(4-Nitrophenyl)butryic acid	Aldrich	335339
Thionyl chloride	Acros Organics	382662500	Note: Corrosive substance; toxic if inhaled
Bromine	Acros Organics	402841000	Note: causes severe skin burns, fatal if inhaled
Diethyl ether	any source
Sodium sulphate	Acros Organics	196640010
Chloroform	VWR Chemicals	22711.29
tert-Butyl 2,2,2-trichloroacetimidate	Aldrich	364789	Note: flammable substance; irritrant to skin and eyes
Boron trifluoride etherate	Acros Organics	174560250	48% BF3. Note: Flammable substance; causes skin burns, fatal if inhaled
Sodium bicarbonate	Acros Organics	424270010
Ethyl-acetate	any source		For column chromatography
n-Hexane	any source		For column chromatography
Bulb-to-bulb (Kugelrohr) distillation apparatus	Büchi		Model type: Glass oven B-585
Silicagel	Carl Roth GmbH	P090.2
Methanol	any source		For column chromatography
Dichloromethane	any source		For column chromatography
Ethanol	VWR Chemicals	20821.296
Ammonia	Acros Organics	428381000	7 N Solution in Methanol
Palladium	Aldrich	643181	15% wet
Hydrogenation apparatus PARR	PARR Instrument Company
Celite 503	Aldrich	22151
Sintered glass funnel	any source
Thiophosgen	Aldrich	115150	Note: irritrant to skin; toxic if inhaled
Triethylamine	Alfa Aesar	A12646
Dichloromethane	Acros Organics	348460010	Extra dry
Magnetic stirrer	any source
PAMAM G4 Dendrimer	Andrews ChemService	AuCS - 297	10% wt. solution in MeOH
Lipophylic Sephadex LH-20	Sigma	LH20100
Thin-layer chromatography plates	Merck Millipore	1.05554.0001
Formic acid	VWR Chemicals	20318.297
Lophylizer	any source
Gadollinium(III) chloride hexahydrate	Aldrich	G7532
Sodium hydroxide	Acros Organics	134070010
pH meter	any source
Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate	Aldrich	E5134
Mass spectrometer (ESI)	Agilent		Ion trap SL 1100
Acetate buffer	any source		pH 5.8
Xylenol orange	Aldrich	52097	20 μM in acetate buffer
Hydrophylic Sephadex G-15	GE Healthcare	17-0020-01
Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Unit	Merck Millipore	UFC900324	Ultracel-3 membrane (MWCO 3000)
Centrifuge	any source
NMR spectrometer	Bruker		Avance III 300 MHz
Topspin	Bruker		Version 2.1
Combustion analysis instrument	EuroVector SpA		EuroEA 3000 Elemental Analyser
MALDI-ToF MS instrument	Applied Biosystems		Voyager-STR
Deuteriumoxid	Carl Roth GmbH	6672.3
tert-Butyl alcohol	Carl Roth GmbH	AE16.1
Vortex mixer	any source
Norell NMR tubes	Deutero GmbH	507-HP-7
NMR coaxial tube	Deutero GmbH	coaxialb-5-7
DLS instrument	Malvern		Zetasizer Nano ZS
0.20 μm PTFE filter	Carl Roth GmbH	KC94.1
HEPES	Fisher BioReagents	BP310
Plastic tube vials	any source
Dotarem	Guerbet		NDC 67684-2000-1
MRI scanner	Bruker		BioSpec 70/30 USR magnet (7 T). Note: potential hazards related to high magnetic fields
RF coil	Bruker		Dual frequency volume coil (RF RES 300 1H/19F 075/040 LIN/LIN TR)
Paravision (software)	Bruker		Version 5.1